Investigando a Faagocytose da Leishmania usando Microscopia Confocal
Summary
O mecanismo associado à fagocitose na infecção por Leishmania permanece mal compreendido. Aqui, descrevemos métodos para avaliar os primeiros eventos ocorridos durante a interação da Leishmania com as células hospedeiras.
Abstract
A fagocitose é um processo orquestrado que envolve etapas distintas: reconhecimento, vinculação e internalização. Faócitos profissionais tomam parasitas leishmania por fagocitose, consistindo em reconhecer ligantes em superfícies parasitas por múltiplos receptores de células hospedeiras. A ligação da Leishmania às membranas macrófagos ocorre através do receptor complementar tipo 1 (CR1) e do receptor complementar tipo 3 (CR3) e receptores de reconhecimento de padrões. Lipofosfoglicano (GLP) e 63 kDa glicoproteína (gp63) são os principais ligantes envolvidos nas interações macrófago-Leishmania. Após o reconhecimento inicial de ligantes parasitas por receptores de células hospedeiras, os parasitas se internalizam, sobrevivem e se multiplicam dentro de vacólos parasitoforosos. O processo de maturação de vacuoles induzidos por Leishmania envolve a aquisição de moléculas de vesículas intracelulares, incluindo a proteína G monomérica Rab 5 e Rab 7, proteína de membrana associada à lisesomal 1 (LAMP-1), proteína de membrana associada lysomal 2 (LAMP-2) e proteína associada a microtúbulos 1A/1B-cadeia de luz 3 (LC3).
Aqui, descrevemos métodos para avaliar os eventos precoces ocorridos durante a interação da Leishmania com as células hospedeiras utilizando microscopia confocal, incluindo (i) internalização (ii) vinculante e (iii) maturação fágora. Ao agregar ao corpo de conhecimento em torno desses determinantes do desfecho da infecção, esperamos melhorar a compreensão da patogênese da infecção por Leishmania e apoiar a eventual busca por novos alvos quimioterápicos.
Introduction
A leishmaniose é uma doença tropical negligenciada causada por parasitas protozoários do gênero Leishmania, resultando em um amplo espectro de manifestações clínicas no hospedeiro vertebrado, incluindo leishmaniose cutânea, leishmaniose mucocutânea e leishmaniose visceral1. A Organização Mundial da Saúde (OMS) estima que mais de um bilhão de pessoas estão em risco, com mais de um milhão de novos casos notificados por ano2.
Leishmania spp. são protozoários intracelulares obrigatórios que sobrevivem dentro de células hospedeiras, incluindo monócitos, macrófagos e células dendríticas3. A interação leishmania-macrófago é um processo complexo que envolve múltiplos receptores de células hospedeiras e ligantes parasitas, seja por interação direta ou por opssonização envolvendo receptores complementares 4,5. Receptores de superfície clássicas, como CR1, CR3, mannose-fucose, fibronectina, receptores de pedágio e carniceiro, mediam o apego do parasita aos macrófagos 6,7,8. Esses receptores reconhecem moléculas na superfície da Leishmania, incluindo a glicoproteína de 63 kDa (gp63) e lipofosfoglicano glicópide (GLP)9. Estas são as moléculas mais abundantes na superfície dos promastigotes e desempenham um papel essencial na subversão da resposta imune hospedeira, favorecendo o estabelecimento de infecção por parasitas em células mamíferas10. Depois que os ligantes da superfície parasita se ligam aos receptores de macrófago, f-actin se acumula em superfícies de células de mamíferos, circundam parasitas à medida que são fagocitados. Posteriormente, isso leva à formação de um compartimento induzido por parasitas denominado vacuole parasitoforoso (PV), que apresenta características fagolisossomais11. Uma vez dentro desses faólises, os parasitas sofrem várias alterações essenciais à sobrevivência e multiplicação3.
A biogênese dos PVs é um processo de tráfico de membrana altamente regulamentado crítico para a sobrevivência intracelular deste patógeno12. A formação deste compartimento resulta de eventos de fusão sequencial entre fágoras e compartimentos da via endocítica hospedeira. Estudos de biologia celular clássica revelaram que o amadurecimento dos PVs envolve a aquisição de proteínas G monoméricas Rab 5 e Rab 7, que estão principalmente associadas à maturação precoce e tardia, respectivamente13. Além disso, esses compartimentos adquirem proteínas de membrana associadas ao lissomo 1 e 2 (LAMP 1, LAMP 2), os principais componentes proteicos da membrana lisosômica e proteína associada a microtúbulos 1A/1B-light chain 3 (LC3), um marcador autofagossomo14. Apesar das semelhanças aparentes, a cinética da formaçãode PV 15,16 e a morfologia desses compartimentos variam dependendo da espécie Leishmania. Por exemplo, a infecção causada por L. mexicana ou L. amazonensis induz a formação de grandes compartimentos contendo um grande número de parasitas17. Em contraste, outras espécies, como L. braziliensis e L. infantum, formam vacuoles menores que normalmente contêm apenas um ou dois parasitas em cada vacuole18.
Apesar desse conhecimento em torno da interação célula hospedeira-Leishmania, os eventos iniciais desencadeados pelo contato entre receptores hospedeiros e ligantes parasitas não foram totalmente elucidados. Esses eventos são conhecidos por serem determinantes do resultado da infecção por parasitas e dependem de espécies parasitas, o tipo de receptores de células hospedeiras recrutados para reconhecer parasitas e a ativação de vias de sinalização de macrófagos19,20. Portanto, é essencial identificar as moléculas envolvidas na biogênese dos PVs induzidos pela Leishmania e determinar o papel dessas moléculas no estabelecimento e desfecho da infecção. Aqui, descrevemos um método de monitoramento dos primeiros eventos ocorridos durante a fagocitose da Leishmania, incluindo vinculação, internalização, formação de fágoras e maturação. Este trabalho poderia auxiliar no esclarecimento da participação de PLC, Akt, Rab5, Rab7 e LC3 na formação de PVs induzidos por diferentes espécies de Leishmania. É importante ressaltar que esse protocolo pode ser utilizado para investigar a participação de outras proteínas envolvidas na maturação de PV. Estudos futuros ampliarão o conhecimento em torno dos mecanismos envolvidos na interação celular hospedeira da Leishmania e contribuirão para o desenho de novas estratégias quimioterápicos.
Protocol
Representative Results
Discussion
A interação leishmania-macrófago é um processo complexo e envolve várias etapas que podem influenciar o desenvolvimento da doença5. Para entender melhor os mecanismos envolvidos na interação da Leishmania nãoopsonizada e das células hospedeiras, descrevemos um protocolo que emprega microscopia de fluorescência confocal para avaliar a fagocitose desde os estágios iniciais até os estágios finais da infecção por Leishmania . O uso de técnicas de fluorescên…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Instituto Gonçalo Moniz, à Fiocruz Bahia, ao Brasil e ao departamento de microscopia pela assistência. Este trabalho foi apoiado pelo número INOVA-FIOCRUZ 79700287000, P.S.T.V. detém uma bolsa de produtividade em pesquisa do CNPq (305235/2019-2). Plasmids foram gentilmente fornecidos por Mauricio Terebiznik, Universidade de Toronto, CA. Os autores gostariam de agradecer a Andris K. Walter pela revisão da língua inglesa e assistência de cópia do manuscrito.
Materials
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| AlexaFluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | Tem varios no site | |
| anti-LC3 antibody | Novus Biologicals | NB600-1384 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Thermo Fisher Scientific | X | |
| CellStripper | Corning | 25-056-CI | |
| CellTracker Red (CMTPX) Dye | Thermo Fisher Scientific | C34552 | |
| Centrífuga | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ciprofloxacin | Isofarma | X | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | X | |
| Confocal fluorescence microscope (Leica SP8) | Leica | Leica SP8 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270106 | |
| Fluorescence microscope (Olympus Lx73) | Olympus | Olympus Lx73 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750045 | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| HEPES (N- 2-hydroxyethyl piperazine-N’-2-ethane-sulfonic acid) | Gibco | X | |
| Histopaque | Sigma | 10771 | |
| M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
| NH4Cl | Sigma | A9434 | |
| Normal goat serum | Sigma | NS02L | |
| Nucleofector 2b Device | Lonza | AAB-1001 | |
| Nucleofector solution | Lonza | VPA-1007 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Phorbol myristate acetate (PMA) | Sigma | P1585 | |
| Phosphate buffer solution (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| ProLong Gold Antifade kit | Life Technologies | P36931 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco | 11875-093 | |
| Saponin | Thermo Fisher Scientific | X | |
| Schneider's Insect medium | Sigma | S0146 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Triton X-100 | Sigma | X |
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