공초점 현미경을 사용하여 리슈마니아 의 식균작용 조사
Summary
Leishmania 감염에서 식균작용과 관련된 메커니즘은 잘 이해되지 않고 있습니다. 여기에서, 우리는 숙주 세포와의 리슈마니아 상호작용 동안 발생하는 초기 사건을 평가하는 방법을 설명한다.
Abstract
Phagocytosis는 뚜렷한 단계를 포함하는 오케스트레이션 된 과정입니다 : 인식, 결합 및 내면화. 전문 식세포는 식균작용에 의해 Leishmania 기생충을 흡수하며, 여러 숙주 세포 수용체에 의해 기생충 표면의 리간드를 인식하는 것으로 구성됩니다. 대식세포막에 대한 리슈마니아 의 결합은 보체 수용체 유형 1 (CR1) 및 보체 수용체 유형 3 (CR3) 및 패턴 인식 수용체를 통해 발생한다. 리포포스포글리칸(LPG)과 63kDa 당단백질(gp63)은 대식세포-리슈마니아 상호작용에 관여하는 주요 리간드이다. 숙주 세포 수용체에 의한 기생충 리간드의 초기 인식에 따라, 기생충은 기생충 액포 내에서 내재화되고, 생존하고, 증식합니다. 리슈마니아-유도된 액포의 성숙 과정은 단량체성 G 단백질 Rab 5 및 Rab 7, 리소좀 관련 막 단백질 1 (LAMP-1), 리소좀 관련 막 단백질 2 (LAMP-2), 및 미세소관 관련 단백질 1A/1B-경쇄 3 (LC3)을 포함하는 세포 내 소포로부터 분자의 획득을 포함한다.
여기에서, 우리는 공초점 현미경을 사용하여 숙주 세포와의 리슈마니아 상호작용 동안 발생하는 초기 사건을 평가하는 방법을 설명하는데, 여기에는 (i) 결합 (ii) 내재화 및 (iii) 식세포 성숙이 포함된다. 감염 결과의 이러한 결정 요인을 둘러싼 지식의 본문에 추가함으로써, 우리는 리슈 마니아 감염의 병인에 대한 이해를 향상시키고 새로운 화학 요법 표적에 대한 최종 검색을 지원하기를 희망합니다.
Introduction
Leishmaniasis는 Leishmania 속의 원생 동물 기생충에 의해 야기 된 방치 된 열대 질환으로, 피부 리슈 마니아증, 점막 피부 리슈 마니아증 및 내장 리슈 마니아증1을 포함하여 척추 동물 숙주에서 광범위한 임상 증상을 나타냅니다. 세계 보건기구 (WHO)는 10 억 명이 넘는 사람들이 위험에 처해 있으며 연간 백만 건 이상의 새로운 사례가보고되고있다고 추정합니다 2.
Leishmania spp.는 단핵구, 대식세포 및 수지상 세포를 포함한 숙주 세포 내에서 생존하는 의무적 인 세포 내 원생 동물입니다3. 리슈마니아-대식세포 상호작용은 직접적인 상호작용을 통해 또는 보체 수용체 4,5를 수반하는 옵소닌화에 의해 다수의 숙주 세포 수용체 및 기생충 리간드를 포함하는 복잡한 과정이다. 고전적 표면 수용체, 예컨대 CR1, CR3, 만노스-푸코스, 피브로넥틴, 톨-유사 및 스캐 빈저 수용체는 대식세포 6,7,8에 대한 기생충 부착을 매개한다. 이 수용체는 63 kDa 당단백질 (gp63) 및 당지질 리포스포글리칸 (LPG)9을 포함하여 리슈마니아의 표면에있는 분자를 인식합니다. 이들은 프로마스티고테스의 표면에서 가장 풍부한 분자이며, 숙주 면역 반응의 전복에 필수적인 역할을 하며, 포유동물 세포(10)에서 기생충 감염의 확립을 선호한다. 기생충 표면 리간드가 대식세포 수용체에 결합한 후, F-액틴은 포유류 세포 표면에 축적되어 기생충을 둘러싸고 식균작용을 한다. 이어서, 이것은 기생충-유도된 구획의 형성으로 이어지고, 이는 식리소좀 특징(11)을 제시한다. 일단 이러한 식세포 내부에 들어가면, 기생충은 생존과 증식에 필수적인 몇 가지 변화를 겪습니다3.
PVs의 생물발생은 이 병원체(12)의 세포내 생존에 매우 중요한 고도로 조절된 막 밀매 과정이다. 이 구획의 형성은 숙주 내시성 경로의 식세포와 구획 사이의 순차적 융합 사건으로부터 초래된다. 고전적 세포 생물학 연구에 따르면 PV의 성숙은 단량체 G 단백질 Rab 5 및 Rab 7 단백질의 획득을 포함하며, 이는 주로 초기 및 후기 엔도솜 성숙과 관련이 있습니다13. 또한, 이들 구획은 리소좀 관련 막 단백질 1 및 2 (LAMP 1, LAMP 2), 리소좀 막 및 미세소관 관련 단백질 1A/1B 경쇄 3 (LC3), 오토파고좀 마커14의 주요 단백질 구성성분을 획득한다. 명백한 유사성에도 불구하고, PV 형성15,16의 동역학과 이들 구획의 형태학은 리슈마니아 종에 따라 다양하다. 예를 들어, L. mexicana 또는 L. amazonensis에 의한 감염은 많은 수의 기생충(17)을 함유하는 큰 구획의 형성을 유도한다. 대조적으로, L. braziliensis 및 L. infantum과 같은 다른 종은 일반적으로 각 액포(18)에 하나 또는 두 개의 기생충 만 포함하는 더 작은 액포를 형성합니다.
숙주 세포-리슈마니아 상호작용을 둘러싼 이러한 지식에도 불구하고, 숙주 수용체와 기생충 리간드 사이의 접촉에 의해 촉발된 초기 사건은 완전히 해명되지 않았다. 이러한 사건은 기생충 감염의 결과의 결정 요인으로 알려져 있으며 기생충 종, 기생충을 인식하기 위해 모집 된 숙주 세포 수용체의 유형 및 대식세포 신호 전달 경로의 활성화19,20에 의존합니다. 따라서 리슈마니아로 유도된 PV의 생물발생에 관여하는 분자를 확인하고 감염 확립 및 결과에서 이들 분자가 수행하는 역할을 결정하는 것이 필수적이다. 여기에서, 우리는 결합, 내재화, 식기 형성 및 성숙을 포함하여 Leishmania의 식세포 작용 중에 발생하는 초기 사건을 모니터링하는 방법을 설명합니다. 이 작업은 PLC, Akt, Rab5, Rab7 및 LC3가 다른 리슈마니아 종에 의해 유도 된 PV의 형성에 참여하는 것을 명확히하는 데 도움이 될 수 있습니다. 중요하게도, 이 프로토콜은 PV 성숙에 관여하는 다른 단백질의 참여를 조사하는데 사용될 수 있다. 미래의 연구는 Leishmania-host cell 상호 작용에 관련된 메커니즘을 둘러싼 지식을 확장하고 새로운 화학 요법 전략의 설계에 기여할 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
리슈마니아-대식세포 상호작용은 복잡한 과정이며 질병 발생에 영향을 줄 수 있는 몇 가지 단계를 포함한다5. 비수술화된 리슈마니아와 숙주 세포의 상호작용에 관여하는 메카니즘을 더 잘 이해하기 위해, 우리는 공초점 형광 현미경을 사용하여 리슈마니아 감염의 초기 단계부터 후기 단계까지 식작용을 평가하는 프로토콜을 기술하였다. 면역 표지 및 형광 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gonçalo Moniz Institute, Fiocruz Bahia, Brazil 및 현미경 검사 부서에 도움을 주셔서 감사합니다. 이 연구는 INOVA-FIOCRUZ 번호 79700287000에 의해 지원되었으며, P.S.T.V.는 CNPq (305235/2019-2)의 연구 생산성 보조금을 보유하고 있습니다. 플라스미드는 캘리포니아 토론토 대학교 Mauricio Terebiznik에서 친절하게 제공했습니다. 저자는 Andris K. Walter에게 영어 개정 및 원고 카피 편집 지원에 감사드립니다.
Materials
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| AlexaFluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | Tem varios no site | |
| anti-LC3 antibody | Novus Biologicals | NB600-1384 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Thermo Fisher Scientific | X | |
| CellStripper | Corning | 25-056-CI | |
| CellTracker Red (CMTPX) Dye | Thermo Fisher Scientific | C34552 | |
| Centrífuga | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ciprofloxacin | Isofarma | X | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | X | |
| Confocal fluorescence microscope (Leica SP8) | Leica | Leica SP8 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270106 | |
| Fluorescence microscope (Olympus Lx73) | Olympus | Olympus Lx73 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750045 | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| HEPES (N- 2-hydroxyethyl piperazine-N’-2-ethane-sulfonic acid) | Gibco | X | |
| Histopaque | Sigma | 10771 | |
| M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
| NH4Cl | Sigma | A9434 | |
| Normal goat serum | Sigma | NS02L | |
| Nucleofector 2b Device | Lonza | AAB-1001 | |
| Nucleofector solution | Lonza | VPA-1007 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Phorbol myristate acetate (PMA) | Sigma | P1585 | |
| Phosphate buffer solution (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| ProLong Gold Antifade kit | Life Technologies | P36931 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco | 11875-093 | |
| Saponin | Thermo Fisher Scientific | X | |
| Schneider's Insect medium | Sigma | S0146 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Triton X-100 | Sigma | X |
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