Здесь мы демонстрируем метод применения напряжения сдвига жидкости к раковым клеткам в суспензии для моделирования воздействия гемодинамического стресса на циркулирующие опухолевые клетки.
Во время метастазирования раковые клетки из твердых тканей, включая эпителий, получают доступ к лимфатической и гематогенной циркуляции, где они подвергаются механическому воздействию из-за гемодинамического потока. Одним из таких стрессов, который испытывают циркулирующие опухолевые клетки (CTC), является напряжение сдвига жидкости (FSS). В то время как раковые клетки могут испытывать низкие уровни FSS в опухоли из-за интерстициального потока, CTC подвергаются, без прикрепления внеклеточного матрикса, гораздо более высоким уровням FSS. Физиологически FSS колеблется более 3-4 порядков величины, с низкими уровнями, присутствующими в лимфатических системах (<1 дин /см2),а самые высокие уровни присутствуют кратковременно, когда клетки проходят через сердце и вокруг сердечных клапанов (>500 дин /см2). Существует несколько моделей in vitro, предназначенных для моделирования различных диапазонов физиологического напряжения сдвига в течение различных временных интервалов. В данной работе описывается модель для исследования последствий коротких (миллисекундных) импульсов ФСС высокого уровня на биологию раковых клеток с использованием простой системы шприцев и игл.
Метастазирование, или распространение рака за пределы исходного участка опухоли, является основным фактором, лежащим в основе смертности от рака1. Во время метастазирования раковые клетки используют кровеносную систему в качестве магистрали для распространения в отдаленные участки по всему телу2,3. На пути к этим участкам циркулирующие опухолевые клетки (ЦОК) существуют в динамическом микроокружении жидкости, в отличие от их исходной первичной опухоли3,4,5. Было высказано предположение, что эта микроокружение жидкости является одним из многих барьеров для метастазирования4. Существует широкое согласие в концепции метастатической неэффективности, т. е. что большинство КТК, поступающих в циркуляцию, либо погибает, либо не образуют продуктивных метастатических колоний6,7,8. Однако вопрос о том, почему метастазирование является неэффективным с точки зрения отдельного КТК, менее определенно и остается активной областью расследования. ЦОК отделяются от внеклеточного матрикса, лишены растворимых факторов роста и выживания, которые могут присутствовать в первичной опухоли, и подвергаются воздействию иммунной системы и гемодинамических сил совершенно иначе, чем в первичной опухоли4. Каждый из этих факторов может способствовать плохому выживанию ЦОД, но их относительный вклад неясен. В данной статье рассматривается вопрос о том, как гемодинамические силы влияют на ЦОК.
Изучение влияния гемодинамических сил на ЦОК является довольно сложной задачей. В настоящее время не существует инженерных систем in vitro, которые могли бы воспроизвести всю пространственно-високоритную динамику (от сердца к капиллярам) и реологические свойства сосудистой системы человека. Более того, как ЦОК воспринимают кровеносную систему, не совсем ясно. Экспериментальные данные показывают, что большинство раковых клеток не циркулируют непрерывно, как клетки крови. Скорее, из-за их относительно большого размера (10-20 мкм в диаметре) большинство ЦОК застревают в капиллярных пластах (6-8 мкм в диаметре) в течение переменных промежутков времени (от дней до дней), где они могут умереть, экстравазироваться или быть смещены в следующее капиллярноерусло 8,9,10,11. Тем не менее, есть некоторые доказательства того, что размер CTC может быть более неоднородным in vivo, и что меньшие CTC обнаруживаются12. Поэтому, исходя из расстояния и скорости кровотока, ЦОК могут свободно циркулировать только в течение нескольких секунд между этими периодами ловушки, хотя количественного описания этого поведения не хватает13.
Кроме того, в зависимости от того, где ЦОК входят в кровообращение, они могут проходить через несколько капиллярных лож в легких и других периферических участках, а также через правое и левое сердце до достижения конечного пункта назначения. По пути CTC подвергаются различным гемодинамическим нагрузкам, включая напряжение сдвига жидкости (FSS), сжимающие силы во время их ловушки в микроциркуляции и, возможно, силы тяги в обстоятельствах, когда они могут проявлять лейкоцитарное катание вдоль стенок кровеносных сосудов14. Таким образом, как способность моделировать циркуляцию, так и понимание моделируемого поведения КТК ограничены. Из-за этой неопределенности любые результаты из модельных систем in vitro должны быть проверены в экспериментальном организме позвоночных и, в конечном счете, у больных раком.
С вышеупомянутыми оговорками в этой статье демонстрируется относительно простая модель применения FSS к клеткам в суспензии для исследования влияния FSS на CTC, впервые описанную в 2012году 15. FSS возникает в результате трения кровотока о стенку сосуда, что приводит к градиенту параболической скорости в условиях ламинарного потока в более крупных сосудах. Клетки испытывают более высокие уровни FSS вблизи стенок сосудов и более низкие уровни вблизи центра кровеносного сосуда. Вязкость жидкости, скорость потока и размеры трубопровода, через который происходит поток, влияют на FSS, как описано уравнением Хагена-Пуазёя. Это относится к потокам крови, которые ведут себя как ньютоновские жидкости, но не удерживают микроциркуляции. Физиологический FSS колеблется на несколько порядков величины с самыми низкими уровнями в лимфатических системах (<1 дин /см2)и самыми высокими в областях вокруг сердечных клапанов и атеросклеротических бляшек (>500 дин /см2)5. Среднее напряжение сдвига стенки в артериях составляет 10-70дин/см2 и 1-6 дин/см2 в венах16,17.
В сердце клетки могут подвергаться воздействию турбулентных потоков вокруг клапанных листочков, где очень высокий уровень, но очень кратковременный FSS можетнаблюдаться 18,19. Хотя область биообработки уже давно изучает влияние FSS на клетки млекопитающих в суспензии, эта информация может быть ограниченной ценностью для понимания влияния FSS на CTC, поскольку она обычно фокусируется на гораздо более низких уровнях FSS, применяемых в течение длительноговремени 20. Как описано ниже, с помощью шприца и иглыможноприменять относительно высокий (от десятков до тысяч дин/см2) FSS на относительно короткую (миллисекунды) продолжительность к клеточной суспензии. Начиная с первоначального описания этой модели15,другие использовали ее для изучения влияния FSS на раковые клетки21,22,23. Множественные «импульсы» FSS могут быть применены к клеточным суспензиям за короткий период времени для облегчения последующего экспериментального анализа. Например, эта модель может быть использована для измерения способности клеток противостоять механическому разрушению FSS путем измерения жизнеспособности клеток в функции от количества примененных импульсов. В качестве альтернативы, влияние воздействия FSS на биологию раковых клеток может быть изучено путем сбора клеток для различных последующих анализов. Важно отметить, что часть клеточной суспензии зарезервирована в качестве статического контроля для сравнения эффектов FSS с теми, которые могут быть связаны с отслойкой клетки и временем, проведенным в приостановке.
В данной работе демонстрируется применение ФСС к раковым клеткам в суспензии с использованием шприца и иглы. Используя эту модель, было показано, что раковые клетки более устойчивы к коротким импульсам FSS высокого уровня относительно непереформированных эпителиальных клеток<sup class="xref"…
The authors have nothing to disclose.
Развитие модели, продемонстрированной здесь, было поддержано грантом Министерства энергетики США W81XWH-12-1-0163, грантами NIH R21 CA179981 и R21 CA196202, а также Фондом исследований метастазов Сато.
0.25% Trypsin | Gibco | 25200-056 | |
14 mL round bottom tubes | Falcon – Corning | 352059 | |
30 G 1/2" Needle | BD | 305106 | |
5 mL syringe | BD | 309646 | |
96-well black bottom plate | Costar – Corning | 3915 | |
Bioluminescence detector | AMI | AMI HTX | |
BSA, Fraction V | Sigma | 10735086001 | |
Cell Titer Blue | Promega | G8081 | |
crystal violet | Sigma | C0775 | |
D-luciferin | GoldBio | D-LUCK | |
DMEM | Gibco | 11965-092 | |
FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
PBS | Gibco | 10010023 | |
Plate Reader | BioTek | Synergy HT | |
Sodium Azide (NaN3) | Sigma | S2002 | |
Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-3005 |