Megakaryocytkultur i 3D Metylcellulosabaserad hydrogel för att förbättra cellmognad och studera effekten av styvhet och inneslutning
Summary
Det erkänns nu att den tredimensionella miljön av celler kan spela en viktig roll i deras beteende, mognad och / eller differentiering. Detta protokoll beskriver en tredimensionell cellkulturmodell utformad för att studera effekten av fysisk inneslutning och mekaniska begränsningar på megakaryocyter.
Abstract
3D-miljön som leder till både inneslutning och mekaniska begränsningar erkänns alltmer som en viktig bestämningsfaktor för cellbeteende. 3D-kulturen har därför utvecklats för att bättre närma sig in vivo-situationen. Megakaryocyter skiljer sig från hematopoetiska stam- och stamceller (HSPCs) i benmärgen (BM). BM är en av kroppens mjukaste vävnader, instängd i benet. Benet är dåligt utökningsbart på cellskalan, megakaryocyter utsätts samtidigt för en svag styvhet och hög inneslutning. Detta protokoll presenterar en metod för återvinning av mus härstamning negativa (Lin-) HSPCs genom immuno-magnetisk sortering och deras differentiering i mogna megakaryocyter i ett 3D medium bestående av metylcellulosa. Metylcellulosa är icke-reaktiv mot megakaryocyter och dess styvhet kan justeras till den normala benmärgen eller ökas för att efterlikna en patologisk fibrotisk märg. Processen för att återställa megakaryocyterna för ytterligare cellanalyser beskrivs också i protokollet. Även om proplatelet förlängning förhindras inom 3D-miljön, beskrivs det nedan hur man återanvänder megakaryocyterna i flytande medium och kvantifiera deras förmåga att förlänga proplatelets. Megakaryocyter som odlas i 3D-hydrogel har en högre kapacitet att bilda proplatelets jämfört med de som odlas i en flytande miljö. Denna 3D-kultur tillåter i) att skilja stamceller mot megakaryocyter som når ett högre mognadstillstånd, ii) att rekapitulera fenotyper som kan observeras in vivo men gå obemärkt i klassiska flytande kulturer, och iii) att studera transduktionsvägar inducerade av de mekaniska ledtrådar som tillhandahålls av en 3D-miljö.
Introduction
Celler i kroppen upplever en komplex 3D-mikromiljö och utsätts för samspelet mellan kemiska och mekanofysiska signaler inklusive styvhet från vävnaden och inneslutning på grund av närliggande celler och omgivande matris 1,2,3. Vikten av stelhet och inneslutning för cellbeteende har bara erkänts under de senaste decennierna. År 2006 belyste det viktiga arbetet från Engler et al. 4 den mekaniska miljöns betydelse för celldifferentiering. Författarna visade att variation i cell substrat styvhet resulterade i orientering av stamceller mot olika differentiering härstamningar. Sedan dess har effekten av mekaniska signaler på cellens öde och beteende blivit alltmer erkänd och studerade. Trots att det är en av organismens mjukaste vävnader har benmärgen en 3D-strukturell organisation som är begränsad inuti benet. Märg styvhet, även om det är tekniskt svårt att mäta exakt, uppskattas ligga mellan 15 och 300 Pa 5,6. Inom stroman är cellerna tätt begränsade till varandra. Dessutom migrerar de flesta av dem mot sinusoidkärlen för att komma in i blodcirkulationen. Dessa villkor skapar ytterligare mekaniska begränsningar på angränsande celler, som måste anpassa sig till dessa krafter. Mekaniska ledtrådar representerar en viktig parameter vars konsekvenser på megakaryocyt differentiering och proplatelet bildandet nyligen har utforskats. Även om megakaryocyter kan skilja in vitro i traditionell flytande kultur, når de inte den mognadsgrad som observeras in vivo, delvis på grund av frånvaron av de mekaniska signalerna från 3D-miljön 7. Växande stamceller inbäddade i hydrogel ger 3D mekaniska signaler som saknas i flytande miljö.
Hydrogeler har använts i stor utsträckning i flera årtionden inom det hematologiska området, särskilt för att odla celler i kolonibildande analyser för att kvantifiera hematopoetiska stamceller. Sådana hydrogeler har dock sällan använts för att utforska den biologiska effekten av den 3D mekaniska miljön på mognad och differentiering av hematopoetiska celler. Under de senaste åren har vårt laboratorium utvecklat en 3D-odlingsmodell med en metylcellulosabaserad hydrogel 8. Denna icke-inaktiva fysiska gel är ett användbart verktyg för att efterlikna de fysiska begränsningarna i den inhemska megakaryocytmiljön. Det härleds från cellulosa genom att hydroxylrester (-OH) ersätts av metoxidgrupper (-OCH3). Både graden av metylersättning och metylcellulosakoncentrationen bestämmer hydrogelstelheten när den väl har gelé. Under utvecklingsstadiet av denna teknik visades det att en Youngs modulus i intervallet 30 till 60 Pa är den optimala gelstyvheten för megakaryocyttillväxt 9.
Följande protokoll beskriver en metod för att odla mus megakaryocytic stamceller i en 3D metylcellulosa hydrogel. Det har tidigare visats att jämfört med standard flytande kultur ökar denna hydrogelkultur graden av megakaryocytpolyloidisering, förbättrar mognaden och intracellulär organisation och ökar megakaryocyternas kapacitet att förlänga proplatelets när de har återsuspenderat i ett flytande medium 9. Detta manuskript beskriver i detalj protokollet för isolering av musben märg Lin− celler och deras inbäddning i en metylcellulosa hydrogel för 3D-kultur samt kvantifiering av deras förmåga att producera proplatelets och återvinning av cellerna för ytterligare analyser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Under det senaste decenniet har mekanobiologi ökat allt mer intresse inom många biologiområden. Det är nu allmänt erkänt att den mekaniska miljön som omger cellerna spelar en roll i deras beteende, betonar vikten av att studera hur megakaryocyter känner och svarar på extracellulära mekaniska signaler. Det är utmanande att noggrant mäta stelheten hos benmärgsvävnaden in situ11, särskilt om vi betraktar den hematopoetiska röda märgen eftersom den ligger inuti trabekulära b…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Fabien Pertuy och Alicia Aguilar som ursprungligen utvecklade denna teknik i labbet, liksom Dominique Collin (Institut Charles Sadron – Strasbourg) som kännetecknade metykoelastiska egenskaper hos metylcellulosahydrogelen. Detta arbete stöddes av ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) och av ett ARN-bidrag (ANR-18-CE14-0037 PlatForMechanics). Julie Boscher är mottagare från Fondation pour la Recherche Médicale (FRM-bidragsnummer FDT202012010422).
Materials
| 18-gauge needles | Sigma-Aldrich | 1001735825 | |
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| 23-gauge needles | Terumo | AN*2332R1 | |
| 25-gauge neeldes | BD Microlance | 300400 | |
| 4-well culture dishes | Thermo Scientific | 144444 | |
| 5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
| Cytoclips | Microm Microtech | F/CLIPSH | |
| Cytofunnels equiped with filter cards | Microm Microtech | F/JC304 | |
| Cytospin centrifuge | Thermo Scientific | Cytospin 4 | |
| Dakopen | Dako | ||
| DMEM 1x | Gibco, Life Technologies | 41 966-029 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | Sterile Dulbecco’s phosphate-buffered saline |
| EasySep magnets | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell isolation Kit | Stem Cell Technologies | 19856A | biotinylated antibodies (CD5,CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119,7–4) and streptavidin-coated magnetic beads |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| Fetal Bovine Serum | Healthcare Life Science | SH30071.01 | |
| Luer lock 1 mL syringes | Sigma-Aldrich | Z551546-100EA | or 309628 syringes from BD MEDICAL |
| Luer lock syringes connectors | Fisher Scientific | 11891120 | |
| MC 3% | R&D systems | HSC001 | |
| Polylysin coated slides | Thermo Scientific | J2800AMNZ | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
| Rat serum | Stem Cell Technologies | 13551 | |
| Recombinant hirudin | Transgène | rHV2-Lys47 | |
| Recombinant human trombopoietin (rhTPO) | Stem Cell Technologies | 2822 | 10,000 units/mL |
| Round bottomed 10 mL plastique tubes | Falcon | 352054 | |
| Round bottomed 5 mL polystyrene tubes |
References
- Doolin, M. T., Moriarty, R. A., Stroka, K. M. Mechanosensing of Mechanical Confinement by Mesenchymal-Like Cells. Frontiers in Physiology. 11, (2020).
- Wang, C., et al. Matrix Stiffness Modulates Patient-Derived Glioblastoma Cell Fates in Three-Dimensional Hydrogels. Tissue Engineering Part A. , (2020).
- Doyle, A. D., Yamada, K. M. Mechanosensing via cell-matrix adhesions in 3D microenvironments. Experimental Cell Research. 343 (1), 60-66 (2016).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Choi, J. S., Harley, B. A. C. The combined influence of substrate elasticity and ligand density on the viability and biophysical properties of hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 33 (18), 4460-4468 (2012).
- Shin, J. -. W., et al. Contractile forces sustain and polarize hematopoiesis from stem and progenitor cells. Cell stem cell. 14 (1), 81-93 (2014).
- Boscher, J., Guinard, I., Eckly, A., Lanza, F., Léon, C. Blood platelet formation at a glance. Journal of cell science. 133 (20), (2020).
- Aguilar, A., Boscher, J., Pertuy, F., Gachet, C., Léon, C. Three-dimensional culture in a methylcellulose-based hydrogel to study the impact of stiffness on megakaryocyte differentiation. Methods in Molecular Biology. 1812, 139-153 (2018).
- Aguilar, A., et al. Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation. Blood. 128, 2022-2032 (2016).
- Hitchcock, I. S., Kaushansky, K. Thrombopoietin from beginning to end. British Journal of Haematology. 165 (2), 259-268 (2014).
- Leiva, O., Leon, C., Kah Ng, S., Mangin, P., Gachet, C., Ravid, K. The role of extracellular matrix stiffness in megakaryocyte and platelet development and function. American Journal of Hematology. 93 (3), 430-441 (2018).
- Jansen, L. E., Birch, N. P., Schiffman, J. D., Crosby, A. J., Peyton, S. R. Mechanics of intact bone marrow. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 50, 299-307 (2015).
- Eckly, A., et al. Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation. Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).
- Eckly, A., et al. Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).
