Summary
우리는 여기에서 2개의 광자 현미경 검사를 사용하여 살아있는 마우스의 두개골 뼈의 골수에 있는 거대 karyocytes 및 proplatelet를 화상 진찰하는 방법을 설명합니다.
Abstract
혈소판은 골수에 위치한 특수 세포인 거대 카르요세포에 의해 생성됩니다. 10년 이상 전에 메가카요사이클을 실시간으로 이미지화할 수 있는 가능성과 그들의 토착 환경은 혈소판 형성 과정에 새로운 빛을 비추고 있습니다. 메가카요세포는 부비동성 혈관의 내피 안대기를 통해 프로플라틀레라고 불리는 길쭉한 돌출부를 확장합니다. 이 논문은 두개골 골수와 부비동성 용기에 형광으로 표기된 메가카요사이클을 실시간으로 이미지화하는 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 염증 반응을 제한하기 위해 두개골을 그대로 유지하는 사소한 수술에 의존합니다. 마우스 헤드는 호흡의 움직임을 방지하기 위해 두개골에 붙어 링으로 고정됩니다.
2광자 현미경을 사용하여 거대 카르요세포는 최대 몇 시간 동안 시각화할 수 있으므로 부비동성 혈관 내부의 신장 과정에서 세포 돌출 및 프로플라츠를 관찰할 수 있습니다. 이를 통해 돌출의 형태(너비, 길이, 수축 영역의 존재)와 그들의 신장 동작(속도, 규칙성 또는 일시 정지 또는 후퇴 단계의 존재)과 관련된 여러 매개변수를 정량화할 수 있습니다. 이 기술은 또한 혈소판 속도 및 혈류 방향을 결정하기 위해 부비동성 용기에서 순환 혈소판의 동시 기록을 허용합니다. 이 방법은 유전자 변형 마우스를 사용하여 혈소판 형성에 대한 관심있는 유전자의 역할을 연구하는 데 특히 유용하며 약리학적 테스트 (메커니즘을 연구하고 혈소판 생산 장애의 치료에 있는 약물을 평가). 그것은 매우 귀중 한 도구가 되었다, 그것은 지금 생체 내 및 체 외 프로 플라틀릿 형성 다른 메커니즘에 의존 알려져 있다 으로 체 외 연구를 보완 하기 위해. 예를 들어, 시험관 내 마이크로투부레는 연막 연도에 필요하다는 것이 나타났다. 그러나, 생체 내에서,그들은 오히려 비계 역할을, 신장은 주로 혈류력에 의해 추진되고.
Introduction
혈소판은 골수에 위치한 메가카요세포 전문 세포에 의해 생성된다. 메가카요세포가 혈소판을 순환에서 방출하는 정확한 방법은 뼈를 통해 실시간 이벤트를 관찰하는 기술적 도전으로 인해 오랫동안 불분명하게 남아 있습니다. 2광자 현미경 검사는 이 도전을 극복하는 것을 도왔고 혈소판 형성 과정을 이해하는 중요한 발전으로 이끌어 냈습니다. 생체 내 첫 번째 생체 내 메가카요세포 관측은 2007년 폰 안드리안과 동료들이 두개골1을통해 형광 메가카요사이클을 시각화하여 만들어졌다. 이는 젊은 성인 마우스의 전두엽 두개골에 있는 뼈 층이 수십 개의 미크론의 두께를 가지고 있고 근본적인 골수2에서형광 세포의 시각화를 허용하기에 충분히 투명하기 때문에 가능하였다.
후속 연구는 다양한 조건하에서 프로플라틀 형성을 평가하고 기본메커니즘을해독하기 위해이 절차를 적용3,4,5,6. 이러한 연구는 거대 카르요세포가 부비동성 혈관의 내피 장벽을 통해 프로플라틀레라고 불리는 돌출부를 동적으로 확장한다는 확실한 증거를제공했다(도 1). 이 프로플라슬은 그 때 부피에 있는 수백개의 혈소판을 나타내는 긴 조각으로 풀어 놓입니다. 혈소판은 다운스트림 장기의 미세 순환, 특히 폐7에서프로플라톤의 리모델링 후 형성될 것이다. 현재까지, 그러나, 정확한 프로세스 및 분자 기계장치는 논쟁의 대상이 남아 있습니다. 예를 들어, 프로플라슬의 신장에서 세포골격 단백질의 제안된 역할은 시험관 내 및 생체 내조건(3)사이에 다르며, 프로플라츠톤 형성의 차이는 염증조건6하에서입증되었다. 더 복잡한 것, 최근 연구는 프로 플라츠판 구동 개념에 이의를 제기하고 생체 내에서,혈소판은 본질적으로 메가 카요세포 수준8에서막 신진 메커니즘을 통해 형성된다는 것을 제안했다.
이 논문은 최소한의 침습 적 절차를 사용하여 살아있는 마우스의 두개골 뼈에서 골수에 있는 거대 karyocytes 및 proplatelet의 관찰을 위한 프로토콜을 제시합니다. 유사한 접근법은 이전에 다른 골수 세포, 특히 조혈 줄기 및 선조 세포9를시각화하기 위해 설명되었습니다. 여기서 초점은 측정 할 수있는 몇 가지 매개 변수를 자세히 메가 karyocytes 및 혈소판의 관찰에, 특히 proplatelet 형태와 혈소판 속도. 이 프로토콜은 형광 추적자와 약물을 주입하고 두개골 뼈를 통해 관찰하기 위해 경정맥에 카테터를 삽입하는 방법을 제시합니다. 칼변종 뼈는 반지가 뼈에 붙어 있도록 경미한 수술을 사용하여 노출됩니다. 이 링은 머리를 고정하고 호흡으로 인한 움직임을 방지하고 렌즈의 침수 매체로서 식염수로 채워진 컵을 형성하는 역할을합니다. 이 기술은 i) 용기 벽과 상호 작용하는 부비동 형상 및 거대 카르요세포가 실시간으로 관찰하는 데 적합합니다. ii) 프로플라츠 형성, 신장 및 방출 과정에서 메가카요세포체를 따릅니다. 및 iii) 혈소판 움직임을 측정하여 복잡한 부비동성 혈류를 모니터링합니다. 이 프로토콜을 사용하여 얻은 데이터는 최근에3로게시되었습니다.
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Protocol
모든 동물 실험은 유럽 표준 2010/63/EU및 스트라스부르 대학의 동물 실험 윤리에 대한 CREMEAS 위원회 (코미테 레지오날 디티크 앙 마티에르 디티크 앙 마티에르 디티크 앙 마티에르 데테마포션 애니멀 스트라스부르, 동물 시설 계약 N°:G67-482-10 프로젝트, N67-482-10 프로젝트)2018061211274514 에 따라 수행되었습니다.
1. 쥐의 준비와 경정맥에 카테터 삽입
참고: 여기, 남성 또는 여성, 5-7 주 된 mTmG 기자 마우스 사용 되었다 (B6.129 (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4 (ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo10)Pf4-cre 마우스와 교차 11,강렬한 녹색 형광 라벨을 허용11. 실험을 시작하기 전에 현미경의 가열 챔버를 몇 시간 동안 예열하십시오.
- 마우스를 이미징 룸으로 운반하고 마취로 진행합니다.
- 케타민(케타민(100 μg/g) 및 자일라진(10μg/g) (5 μL/g)의 용액을 주입하여 마우스를 마취한다.
참고 : 케타민 / 자일라진의 반복 투여는 여기에서 사용되며 잘 작동하지만 정기적 인 재주입을위한 기록중단이 필요합니다. 또는 마취 기계를 사용할 수 있는 경우 마취의 유도는 케타민/자일라진으로 수행되고 이후에 가스 흡입(이소플루란, 공기 및 산소의 혼합물)에서 유지될 수 있다. - 깊은 마취에 도달 할 때까지 케이지에있는 동물을 교체하십시오. 모든 후속 조작을 위해 37°C에서 따뜻하게 가열된 접시에 마우스를 놓습니다.
참고: 동물이 깊은 마취에 도달하는 동안 현미경 및 모든 장비(섹션 4.1 참조)를 켜고 수술이 완료되면 실험을 시작하기 위해 필요한 다양한 매개 변수(섹션 4.2 참조)를 설정합니다. 여기서, 절차는 단지 3 시간 지속되고 단자입니다. 마우스는 깨어나지 않고 실험 후 안락사됩니다. 따라서 피부와 기기에 대한 에탄올 소독은 충분합니다. 그러나, 기관 지침에 따라, 또는 절차가 더 오래 지속될 경우, 베타딘 / 포비도네 및 알코올과 세 번갈아 스크럽과 같은 더 완전한 소독 방법을 사용해야합니다.
- 케타민(케타민(100 μg/g) 및 자일라진(10μg/g) (5 μL/g)의 용액을 주입하여 마우스를 마취한다.
- 경정맥에 카테터를 설치합니다.
참고: 가능한 한 수술 중 미생물 오염을 피하는 것이 중요합니다. 수술을 진행하기 전에 70 %의 에탄올 (EtOH)으로 피부를 조심스럽게 소독하십시오. 항상 살균 된 가위와 핀셋을 사용하고 정기적으로 70 % EtOH로 헹구습니다. 깨끗한 곳에서 작업하고 얼굴 마스크를 착용하십시오. 플라스틱 튜브 내부의 바늘로 구성된 22 G "오버 더 니들" 카테터는 정맥 주사에 사용됩니다(재료표참조).- 마우스를 등에 놓고 수술용 테이프로 전방 다리를 고정하여 목구멍을 늘립니다(그림2A). 70%의 에탄올로 목을 소독합니다.
참고: 편의를 위해 수술 전에 목을 면도할 수 있습니다. 절차가 더 오래 지속되는 경우 적절한 무균 기술을 위해 주의 깊게 면도해야합니다. - 멸균 가위를 사용하여 오른쪽 또는 왼쪽 경정맥에 0.7-1cm 절개를 합니다. 인접한 결합 조직을 스트레칭하여 외부 경정맥과 가슴 근육의 상단을 노출시한다(도2A).
- 카테터를 따뜻하고 멸균된 생리식염수로 채웁니다. 가슴 근육을 관통 한 후 정맥에 카테터를 삽입(도 2B).
참고: 카테터 내부의 기포를 피하십시오. 근육이 압축 점을 형성하기 때문에 출혈을 방지하기 위해 근육을 통해 카테터를 삽입하는 것이 중요합니다. Itgb3-/-마우스와 같은 혈종 결함을 가진 마우스조차도 이 접근법으로 카테터 삽입시 출혈하지 않습니다. - 바늘을 부드럽게 제거하고 필요한 경우 카테터를 정맥 깊숙이 이동하십시오. 주사기를 연결하고 수술 접착제(재료의 표)의한 방울을 추가하여 카테터를 안정화.
참고: 정맥이 더 작은 구경을 가지고 있기 때문에 몇 가지 연습이 필요하지만 꼬리 정맥 내부에 카테터를 삽입 할 수 있습니다. 이것은 꼬리 정맥이 거의 보이지 않는 어두운 머리를 가진 마우스를 사용할 때 특히 어렵습니다. 그것의 더 큰 구경 때문에, 경정맥 안쪽에 카테터를 배치하는 것은 더 큰 볼륨 또는 반복한 처리가 더 안정적으로 주입될 수 있습니다. 주사기는 처음에는 따뜻한 식염수로 채워져 있으며 약물 용액을 주입하기 전에 죽은 양을 주입하는 것을 잊지 마십시오. - 마우스를 조심스럽게 쉬운위치(도 2C)로되돌려 놓습니다. 건조를 방지하기 위해 눈에 젤(재료 의 표)를적용합니다.
- 마우스를 등에 놓고 수술용 테이프로 전방 다리를 고정하여 목구멍을 늘립니다(그림2A). 70%의 에탄올로 목을 소독합니다.
2. 두개골 반지의 수술 및 설치
참고: 마우스 설치를 위한 전폭적인 지원은 4개, 블록 및 플레이트, 마우스 헤드를 고정하는 링 및링(그림 3A)으로구성된다. 지원의 모든 요소는 i.materialise.com 3D 프린팅에 의해 얻어졌습니다. 플레이트는 아크릴로니톨 부타디엔 스티렌(ABS) 폴리머, 스테인리스 스틸의 블록 및 나사, 고급 스테인리스 스틸(고상한 스테인리스 스틸) 링(3D 프린팅 파일용 치수 및 보충 재료에 대한 보충 도면 S1 참조)으로 만들어집니다. 블록은 나사 또는 접착된 지지대에 영구적으로 고정됩니다. 반지가 마우스 두개골에 고정되면 블록 홀더(그림 3A)에나사해야합니다.
- 소독을 위해 70%의 에탄올로 젖은 종이 타월로 두피에 머리카락을 적시다. 젖은 종이 타월로 느슨한 머리카락을 모두 제거하십시오.
참고: 편의를 위해 수술 전에 두피를 면도할 수 있습니다. - 두피를 최대 1cm의 미드라인에서 형성하여 귀 사이에 멸균 미세 가위와 핀셋을 사용하여 칼바륨을 노출시합니다.
참고: 링은 전두엽 및 정수리뼈(그림 3B)와겹치기 위해 배치됩니다. - 멸균 핀셋을 사용하여 두개골을 노출하십시오. 가위와 핀셋으로 골막을 조심스럽게 제거합니다. 생리식염수에 담근 멸균 면봉을 사용하여 모든 폐막염과 이미징을 바꿀 수있는 파편이나 머리카락을 제거하십시오.
참고: 염증 반응을 제한하려면 뼈를 손상시키지 않도록 주의하십시오. - 식염수로 헹구어 혈액 흔적을 제거하고 마른 면봉으로 뼈를 빠르게 건조시합니다. 접착제 젤을 반지에 바르고 노출된 뼈에 놓고 몇 초 동안 유지하여 반지가 두개골에 단단히 부착되도록 하십시오.
참고: 바람직하지 않은 자동 발광으로 이어질 수 있으므로 접착제가 관측장에 들어가지 않아야 합니다. - 생리식염수에 담그고 면봉으로 두개골을 가볍게 촉촉하게 합니다.
- 1:1 블루와 옐로우 성분을 조심스럽게 혼합하여 실리콘 치과 페이스트를 준비합니다. 이미징 중 누출을 방지하기 위해 밀봉을 위해 링 주위에 치과 페이스트를 적용하십시오. 고리에 들어갔을 수 있는 치과 페이스트 나 접착제를 조심스럽게 제거하십시오.
- 벨린으로 링을 채우고 누출을 확인합니다.
참고: 식염수는 현미경 목표에 대한 침지 배지 역할을 합니다. 출혈은 혈증 관련 결함을 가진 마우스를 사용할 때 더 중요할 지도 모릅니다. 혈액이 더 많은 이미징을 흐리게 할 수 있으므로 혈액이 고리에 들어가는 것을 방지하는 것이 필수적입니다. - 마우스를 지지에 놓고 블록홀더(그림 3C)에링을 나사로 놓습니다. 접힌 압축을 동물의 머리 아래에 놓고 머리를 들어 올리고 두개골에서 반지의 분리를 방지합니다.
참고: 머리가 직접 고정되어 호흡으로 인한 이미지 움직임을 방지합니다. - 가열된 현미경챔버(도 3D)에지지체 및 마우스 어셈블리를 배치합니다.
참고: 삽입된 카테터를 언제든지 빼내지 않도록 주의하십시오.
3. 실험이 끝날 때까지 마취된 마우스의 후속 조치
참고: 마취는 케타민(s.c.) 주사를 5 μL/g의 부피와 케타민(50 μg/g) 및 자일라진(5μg/g)(5μg/g)의 혼합물로 번갈아 가며 35분마다 재유도된다. 취득 시 가열된 현미경 챔버를 열 수 없는 만큼, 발가락 꼬집기로 마취제를 재투여하기 전과 후에 마취 모니터링이 수행됩니다. 마찬가지로 각 새 비디오 녹화를 시작하기 전에 발가락 핀치가 수행됩니다.
- 필요한 경우, 주사를 .c 주사에 의한 마취를 획득 중지하고 다시 유도하십시오.
- 마우스 머리를 움직이지 않도록 주의하기 때문에 왼손의 엄지와 검지 손가락 사이에 뒷면의 피부를 꼬집습니다. 피하 주사제를 오른손을 사용하여 백 스킨의 접에 마취제를 주입합니다 (또는 왼손잡이 사람들을위한 그 반대의 경우도 마찬가지입니다).
- 링에 식염수의 존재를 확인하고 필요한 경우 신선한 식염수를 채웁니다. 다음 35분 동안 녹음을 하고 녹음 기간 동안 비슷하게 진행합니다.
- 실험이 끝나면 깨어나기 전에 자궁 경부 탈구로 마우스를 안락사시합니다.
참고: 마우스는 지역 윤리 및 동물 복지 위원회에 동의하여 최대 3시간 동안 마취됩니다.
4. 2광자 이미징
참고: 현미경 및 관련 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. 이미지는 공진 스캐너(12 또는 8kHz)로 기록되었습니다. 양방향으로 픽셀이 기록됨에 따라 양방향 모드가 설정되어 속도 획득속도를 높였습니다. 따라서 단계의 불일치는 제어판 "위상 보정"으로 수정되어야 합니다. 마지막으로, 적응된 평균은 획득 속도와 신호 대 잡음 비율 사이의 타협으로 설정되었습니다.
- 레이저 및 공진 스캐너를 포함한 2광자 현미경을 켭니다(레이저에 따라 레이저 출력은 보통 ~1.8-2.5W).
- 선택한 형광에 적합한 레이저 파장을 설정합니다. 방출된 조명의 복구를 위해 적절한 파장을 설정합니다.
참고: 여기서, 913nm 및 하이브리드 검출기(500-550 nm 및 575-625 nm)의 파장이 각각 알렉사플루어-488 및 Qtracker-655를 동시에 흥분시키고 검출하는 데 사용되었습니다. - 관내 카테터를 사용하여, 형광 추적기를 주입하여 혈관에 라벨을 붙입니다(Qtracker-655; 재료의 표). 0.2 μM에 용액의 50 μL/마우스를 주입하고, 최대 150 μL/실험을 위해 매시간 한 번씩 갱신됩니다.
참고: 다른 트레이서는 고분자량 dextran1과같은 다른 추적자를 사용할 수 있습니다. 이 경우 혈액 점도가 dextran에 의해 변경될 수 있다는 것을 고려하고 일부 출혈성 매개 변수를 수정하십시오. - 현미경의 목적하에 지지체와 마우스로 현미경 단계를 배치합니다. 링이 항상 식염수로 채워져 있는지 확인하고 목표를 몰입하십시오. 부비동산 혈관을 따라 정렬된 골수 혈관(빨간색)과 거대 카르요세포(녹색)의 존재를 찾기 위해 에피플루오를 사용합니다.
참고: 두개골 뼈의 두께는 100 μm2보다낮습니다. 골수는 뼈 아래에 위치하며 형광 녹색 거대 카르요사이클과 Qtracker-655에 의해 표지된 조밀한 붉은 해부학 부비동성 용기에 의해 쉽게 인식됩니다. - 긴 인수(메가카요사이클, 프로플라판)
- 관심 영역을 검색합니다. 위에서 설명한 대로 이미지 수집 매개 변수를 적용합니다.
- 긴 획득(예: 프플래틀렛 형성 또는 신장의 시각화)의 경우 8kHz 공진 스캐너를 사용하여 최적화된 간격(일반적으로 0.85~1.34 μm 사이)으로 z 스택 이미지를 획득합니다.
참고: 12kHz 공진 스캐너는 획득 속도를 높일 수 있습니다. - 384 x 384 픽셀 이미지를 획득하여 전체 메가카요세포와 선박을 시각화합니다. 원하는 대로 라인 평균을 사용하여 신속한 해결을 위해 사용하십시오. 프로플라츠렛 시각화를 위해 이미지 스택 획득의 시간 간격, 일반적으로 10 s 또는 30 초를 결정합니다.
참고: 여기서는 8kHz 공진 스캐너로 1개의 이미지/10s를 획득할 수 있는 더 높은 신호 대 잡음 비율을 얻기 위해 평균 8개의 라인을 사용했습니다. 라이브 인수 시 라인 평균이 허용되는지 확인합니다.
- 짧고 빠른 획득 (혈소판)
참고: 혈소판 속도와 같은 급속한 이벤트를 더 짧게 획득하려면 프레임 획득 속도를 극대화하는 것이 필수적입니다. 적절한 획득 유형을 선택하면 프레임 획득 속도가 최적화됩니다(예: 시공간 획득 유형 "xyt").- 필요한 경우 이미징 필드를 회전하여 이미지 크기를 최소화(예: 256 x 90픽셀)를 최소화하고 이미지 크기를 용기에 맞게 조정합니다.
- 사용 가능한 가장 높은 스캐닝 속도를 사용합니다.
- 양방향 스캐닝을 사용합니다.
참고: 양방향 스캐닝의 경우 위상이 잘 조정되었는지 확인합니다. - 이미지 정의와 빠른 수집 사이의 최적의 타협을 찾기 위해 라인 평균을 최소화합니다.
참고: 혈소판 속도 측정의 경우, 획득의 급속성을 높이는 데 도움이 된다면 픽셀화된 이미지가 충분할 수 있습니다. - z 스택을 최소화하여 획득 의 급속성을 높입니다. 단 1개의 z-스택만 획득하면 혈소판 속도를 정량화하기에 충분합니다. 혈소판 속도를 측정하기 위해 10-20 s를 획득하십시오.
참고: 12kHz 공진 스캐너가 있는 이러한 조건을 사용하여 최대 133프레임/s를 얻을 수 있습니다. 매개 변수는 조건에 맞게 조정되어야 합니다. 일부 선박에서는 혈소판 속도는 그럼에도 불구하고 이러한 설정으로 혈소판 속도를 안정적으로 정량화하기에는 너무 높습니다.
- 프로플라틀릿 너비 및 길이 측정
참고: ImageJ와 라이카 소프트웨어에서 얻은 LIF 파일을 로드하려면 먼저 IMAGEJ에 LOCI 플러그인을 다운로드하여 설치하여 바이오 포맷 수입업체를 사용합니다.- 프로플라틀너비
- ImageJ로 영화를 엽니다. 폭 측정을 수행하려면 용기없이 프로 플라츠판의 영화만 사용하십시오. 다른 채널을 분리하려면 이미지를 클릭합니다| 색상 및 분할 채널을 선택합니다.
- z 스택 영화의 경우 이미지를 클릭하여 각 시간 별 평균 z 프로젝션을 만듭니다| 스택 및 Z 프로젝트를 선택합니다. 투영 유형의경우 평균 강도를입력합니다.
- 이미지를 처리하여 노이즈를 제거합니다. 프로세스를 클릭하여 배경을 뺍니다| 배경을 빼고 롤링 볼 반경: 50.0 픽셀을 적용합니다. 프로세스를 클릭하여 이미지를 부드럽게하고 부드럽게합니다.
- 프로 플라틀렛 의 기지 에 가까운 선을 추적 (메가 카요사이클트 근처, 다른 개체를 피하기).
참고: 분석 및 설정 배율을클릭하여 원하는 단위에서 값을 얻기 위해 이미지의 배율을 설정하는 것을 잊지 마십시오. 기본적으로 이미지 단위는 픽셀에 있습니다. - 강도 프로파일을 플롯하고, 가우시안 곡선에 맞고, 전체 폭을 절반 최대(FWHM)로 계산합니다. 이를 위해 플러그인을 클릭하여 다음 스크립트를 매크로에 작성합니다| 매크로를 새로 선택하고 매크로를 클릭하여 실행합니다| 매크로 실행: y=getProfile(); x=Array.getSequence(예. 길이); Fit.doFit ("가우시안", x,y); Fit.plot(); 시그마=Fit.p(3); FWHM = (2 * sqrt (2 * 로그 (2) ) * 시그마; 인쇄(FWHM).
참고: 프로플래틀 강도에 해당하는 라인 스캔에 단 하나의 피크만 있는지 확인합니다. - 1 슬라이스에 4.7.5 단계로 설명된 작업을 수행하거나 시간이 지남에 따라 반복되어 프롬플라톤의 평균 폭을 얻을 수 있습니다.
- 프로플라틀 길이
- 프로 플라틀렛을 따라 선을 추적, 상단에 메가 카요 사이클에 가까운 기지에서. 분할된 선을 사용하여 프로플라틀렛 모양을 따릅니다. 각 시간 지점에 대해 반복합니다.
- ROI 관리자를 사용하여 각 줄을 저장해야 합니다: 분석 | 클릭하십시오. 도구 및 ROI 관리자를 선택합니다. ROI 관리자 창에서 추가를 클릭하여 선택한 대로 각 줄을 관리자에 추가합니다. 폴더에 있는 모든 선을 저장하려면 선택 취소|의 ROI 관리자를 클릭합니다. 더 많은 및 저장을클릭합니다. ROI 관리자로부터 결과 표에서 각줄(측정)의길이 값을 추출합니다.
참고: 분석 및 설정 배율을클릭하여 원하는 단위로 값을 얻기 위해 이미지의 배율을 설정하는 것을 잊지 마십시오. 기본적으로 이미지 단위는 픽셀에 있습니다.
- 프로플라틀너비
- 혈소판 속도 측정
참고: 혈소판 속도는 10-20s 이상 용기 내부에 흐르는 형광 혈소판의 비디오 녹화에서 계산됩니다. 주기적으로 반복되는 라인 스캔 데이터를 얻기 위해 첫 번째 이미지 처리가 수행됩니다. 모션은 각도가 속도에 따라 달라지므로 계산을 허용하는 줄무늬로 이어집니다. 여기서, 속도는 고전 단수 값 분해(SVD)방법(15)보다더 강력한 라돈 변환을 사용하는 방법으로 계산되었다.- ImageJ와 이미지 처리
- ImageJ로 영화를 엽니다. 프로세스 | 클릭하여 가우시안 블러 필터를 적용 필터, 가우시안 블러를선택하고 시그마(반경)를 적용: 2.00. 흐름을 측정하기 위해 작은 영역을 선택하고 유동 방향에 따라 인접한 3선을 추적합니다.
참고: 분석 | 클릭하여 ROI 관리자를 사용하여 각 줄을 저장하는 것을 잊지 마십시오. 도구 | ROI 매니저. ROI 관리자 창에서 추가를 클릭하여 각 줄을 추가하고 저장합니다. | 선택 취소에서 먼저 클릭하십시오. 더 많은 다음 저장을클릭합니다. - ImageJ 라인 스캔 소프트웨어를 사용하여 이미지 | 클릭하여 각 줄에 대한 kymograph을 빌드합니다. 스택; 다시 슬라이스를 선택하고 다음 매개 변수를 적용 : 출력 간격 (미크론): 1.000 / 슬라이스 카운트 : 1 / 보간 을 피하십시오. 생성된 시공간 이미지를 저장합니다.
참고: 결과 이미지는 시간이 지남에 따라 혈소판의 선형 모션에 대응하는 줄무늬를 보여줍니다. 줄무늬의 각도는 속도의 함수입니다.
- ImageJ로 영화를 엽니다. 프로세스 | 클릭하여 가우시안 블러 필터를 적용 필터, 가우시안 블러를선택하고 시그마(반경)를 적용: 2.00. 흐름을 측정하기 위해 작은 영역을 선택하고 유동 방향에 따라 인접한 3선을 추적합니다.
- Matlab 또는 GNU 옥타브 소프트웨어를 사용하여 속도 측정
참고: 혈류내의 혈소판의 속도는 Drew 및 공동작업자(15)에의해 기술된 라돈 변환에 기초한 계산 분석 방법을 사용하여 시시간 이미지로부터 추정된다. 이 수학 방법에 대한 설명은 이 검토의 범위를 벗어났으며, 판독기는 Drew 등에서계산(15)에대한 세부 정보를 참조합니다. Matlab 코드와 자세한 정보는 https://www.drew-lab.org/code 웹사이트에서 확인할 수 있습니다.- Matlab 또는 GNU 옥타브 소프트웨어를 사용하여 코드를 엽니다.
참고: 코드는 원하는 스터디에 따라 적응해야 할 수 있습니다. - 동일한 용기 부분에 그려진 인접한 선에 대응하는 3개의 시공간 이미지에서 값을 추출합니다. 선박의 이 부분에 대한 평균 혈소판 흐름 속도 값을 계산합니다.
참고: 올바른 측정 단위(예: μm/s)에서 결과를 변환하는 것을 잊지 마십시오.
- Matlab 또는 GNU 옥타브 소프트웨어를 사용하여 코드를 엽니다.
- ImageJ와 이미지 처리
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Representative Results
이 프로토콜을 사용하여 형광 추적기 Qtracker-655는 두개골 골수및 화살표에 의해 묘사된 흐름 방향에서 해부학된 골수 부비동성 혈관을 심상으로 투여하였다(그림4A,왼쪽). mTmG 마우스를 사용하여, eGFP 형광 혈소판은 각 혈관 분지에서 20s 이상 기록되었고, 그들의 속도는 ImageJ 및 GNU 옥타브 소프트웨어(도 4A,오른쪽)를 사용하여 측정되었다. 흐름 속도와 방향의 이질성에 유의하십시오. 시누소이드 용기는 비디오 1에기록된 양상에 도시된 바와 같이, 기유량및 정지의 존재와 함께, 마취로 인한 복잡한 흐름을 존재한다. 동일한 분기는 그림 4B(왼쪽)에 표시되며 빨간색및 파란색 화살표가 반대 흐름이 강조 표시됩니다. 이 분기에서 혈소판 속도측정 및 그래프에서 보고되었다(도 4B,오른쪽). 빨간색 추적은 왼쪽 용기 가지의 속도와 오른쪽 용기 가지의 파란색 추적에 해당합니다. 이것은 가속, 정지 및 감속의 단계와 각 선박 분기에 시간이 지남에 불규칙성을 보여줍니다. 일부 혈관에서는 혈류가 너무 빠르서 현재의 획득 조건하에서 신뢰할 수 있는 분석을 하는 것이 중요합니다.
프롬플래틀 신장 레코딩은 시간이 지남에 따라 다양한 형태를 시각화할 수 있게한다(도 5). 일부 프로플라톤은 불규칙한 형태와 함께 elongate(그림 5Ai 및 비디오 2). 다른 사람, 일반적으로 얇은 것 들, 그들의 확장을 따라 획득 창의 움직임을 필요로 하는 장거리 확장 수 있습니다(그림 5Aii 및 보충 비디오 1). 다른 사람은 짧고 두껍고 일반적으로 천천히 길게 합니다(그림 5Aiii 및 보충 비디오 2). 메가카요세포가 도 4B에도시된 분기와 같은 복잡한 흐름 영역에서 프로플라판을 확장하면, 프롬판은 유동 방향에 따라 한 용기 지점에서 다른 혈관 분지로 던지게 된다(도5B 및 비디오 3). 마우스가 예기치 않게 심장 마비를 겪었을 때 유동 방향에서 연막 신장에 대한 혈역학적 힘의 중요성이 입증되었습니다. 혈액 흐름을 중지하면 메가카요세포(도5C 및 비디오 4)에의해 확장된 프로플라판이 완화되었다.
획득의 품질/분해가 적절한 경우, 분리될 때까지 프로플라슬길이, 프로플래틀의 기저부 또는 다른 정의된 위치의 폭 또는 싹의크기(도 6A)와같은 형태학적 매개변수를 측정할 수 있다. 평균 최대 프로플래틀 길이 ~185 μm(범위 41.5-518.5 μm) 및 평균 프로플래틀 폭 5.2 μm(범위 2.8-8 μm)이 계산되었다(그림6A). 프로플라츠렛 길이를 시간의 함수로 플로팅하면 연신, 정지 또는 심지어후퇴(도 6B)의단계에서 프로플라츠의 동작을 시각화할 수 있습니다. 프로플라츠수 연분의 측정 속도는 프로플라틀릿3의신장, 정지 또는 후퇴 거동을 직접 반영하는 중요한 매개 변수이다.
프로플라틀이 모세포에 부착된 상태로 남아 있는 경우 장혈판 신장 속도를 측정할 수 있습니다. 분리되면 흐름에 의해 즉시 운반되고 시각화 창에서 사라집니다. 야생형(WT) 마우스에서는, 평균 프로플라틀연수 속도는 ~10 μm/min(도6C)이었다,이전간행물과 일치1. 마지막으로, 경정맥에 삽입된 카테터를 통해 약물을 주입할 수 있다. 예를 들어, 미생물을 비합합하하는 약물인 빈크리스틴의 정맥 투여가 WT 마우스로부터 프로플라슬을 철회하는 것으로 이어졌지만 myosin IIA-결핍마우스(Myh9-/-)(비디오 5 및 비디오 6)3에서프로플라트에 영향을 미치지 않은 것으로 관찰되었다.
그림 1: 골수의 프로 플라츠렛 형성의 회로도 표현. 조혈 줄기 세포로부터 분화 한 후, 큰 거대 핵세포는 부비동성 혈관을 따라 정렬하고 내피 장벽을 통해 프로 플라츠플라소플라스라고 불리는 세포질 투영을 확장합니다. 혈역학력의 영향으로 프로플라츠판이 하류 미세 순환의 혈소판으로 더 리모델링합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 카테터삽입.(A) 절개는 경정맥과 가슴 근육의 상부를 노출하도록 한다. (B)식염수로 채워진 카테터는 근육을 통과하여 경정맥에 삽입되어 압축 점을 생성한다. (C)마우스는 카테터가 잘 배치된 후 복부 표면이 아래쪽으로 놓이게 되도록 조심스럽게 회전한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 두개골 뼈를 통해 2광화상 이미징에 사용되는 실험용 설정. (A)3D 프린팅 스테인리스 스틸 블록은 ABS 폴리머 지지대상에 고정되어 있다(3D 설계용 보충 도면 S1 및 보충 재료 참조). 블록과 두개골 링은 링이 블록에 나사로 나사로 만들 수 있도록 설계되었습니다. 사용 편의성을 위해 나사 헤드가 Epon에 내장되어 있습니다. (B)노출된 두개골 뼈에 링의 위치를 보여주는 회로도. (C)두개골에 접착된 반지, 티슈 패드의 헤드,(D)현미경 목표 하에서 의 위치 가하여 마우스를 보여주는 사진. 약어: 3D = 3차원; ABS = 아크릴로니트리어버타디엔 스티렌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 두개골 골수 해부학부비동성 용기의 혈소판 속도 측정. (A)Q-Dot 주입에 의해 표지된 부비동성 용기의 2광화상. 두개골 골수에서 부비동성 혈관의 해부학을 보여주는 z 프로젝션. 화살표는 부비동산의 흐름의 복잡성을 나타내며 흐름방향을 나타냅니다. 오른쪽, 각 혈관 분기의 혈소판 속도의 측정에 의해 추정된 평균 유량 속도. x축의 숫자는 왼쪽의 이미지의 화살표 번호와 일치합니다. (B)왼쪽, 점선에 의해 디라인시코비누시드 분기, 반대 방향으로 흐르는 혈소판을 보여주는 (빨간색과 파란색 화살표) (비디오 1에해당). 2광자 단일 평면 이미지. 오른쪽, 용기의 각 부분에서 흐름 속도를 시간(빨간색선, 왼쪽, 파란색 선, 오른쪽)으로 보여주는 그래프는 정지, 가속 및 감속의 위상을 나타냅니다. 스케일 바 = 20 μm. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.
그림 5: 2광자 현미경 검사법에 의해 두개골 골수에서 관찰된 다양한 프로플라츠 형태. (A) 생체 내 3개의 대표자: 시간 경과 실험에서 z-프로젝션 이미지(비디오 2, 보충 비디오 1,및 보충 비디오 2)에서골수 부비노이드 내에서 확장되는 프로플라츠(arrows)의 다양한 형태를 보여주는 다름. 프로플라틀과 메가카요세포는 녹색에 있습니다. 부비동성 용기는 빨간색입니다. (B) 도 4B와동일한 분면에서 프로플라톤의 타임랩스 이미지, 흐름의 방향에 따라 진동(또한 비디오 3에도시됨). (C)z-프로젝션 타임랩스 이미지는 마우스의 심장 마비로 인한 혈류 중단 후 3개의 프로플라틀렛이 완화되는 것을 보여 주며(비디오 4에도시됨), 이전에동일한 흐름선(흰색, 노란색 및 파란색 화살표로 표시됨)에 정렬됨). 스케일 바 = 20 μm. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.
도 6: 프로플라츠 형태 분석. (A)프로플라츠백 폭이 최대 길이와 함께 측정된 부위를 묘사한 상부, z-프로젝션 이미지; 다음은 25개의 개별 프로플라틀릿의 최대 길이와 연신 기간 동안 동일한 프로플라틀렛(동일한 회색 코드)의 평균 프로플라틀 폭을 나타내는 그래프입니다. i) 프로플라틀폭은 프로플라틀의 기저에 가까운 고정된 위치에서 수직선을 그려서 측정하였고, 프로파일 강도는 매 분마다 이 위치에서 기록되었다. 가우시안 곡선이 이 프로파일에 장착되었고, FWHM은 프로플라틀렛의 폭을 나타내는 것으로 간주되었다. 평균 폭은 고정된 위치에서 각 시점에서 측정된 프로플라슬의 폭을 평균화하여 계산되었습니다. 막대는 획득 하는 동안 매 분마다 측정 된 너비의 ± sem을 의미합니다. ii) 최대 프로 플라틀릿 길이도 프로플라틀의 기지에서 팁까지 결정되었다. (B)WT 프로플라틀렛의 신장 동작을 나타내는 개별 추적, 그 중 일부는 일시 정지 및 후퇴 단계를 제시한다. 프로플래틀 성장 과정에 대한 일시 정지 및 후퇴를 더 잘 강조하기 위해 10s마다 측정된 길이는 각 프로플라틀릿의 최대 길이의 백분율로 표현되었습니다. (C)프롬플래틀 신장 속도를 나타내는 분산 플롯. 순 평균 프로플래틀 연장 속도(일시 정지 및 후퇴 포함)는 전체 시간 순서에 걸쳐 평균된 1분 간격으로 프롬플래틀 길이의 변화로 계산되었다. 개별 값과 ± 의미. 약어: FWHM = 전체 너비는 최대 절반입니다. sem = 평균의 표준 오류; WT = 야생 형.
비디오 1: 부비동성 용기 내의 역류. 부비동성 용기(빨간색, Qtracker)(단일 공초점 z-평면) 내순환 혈소판(녹색). 해부학된 부비누소이드 용기는 흐름이 불안정하고 정지, 가속 및 감속의 위상을 표시하는 분기를 제시합니다. 라이카 SP5 현미경으로 12kHz 공진 스캐너와 숫자 조리개 0.95 (라이카), 1 개의 평면, 256 x 90 픽셀, 양방향 획득, 라인 평균 2, 133 프레임 / s. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 2: 장시간 연장 된 프로 플라판은 다양한 형태를 표시합니다. 골수 부비동(빨간색, Qtracker) 내 다양한 형태(녹색)로 프로플라츠를 확장하는 메가카요사이클이 있는 WT 마우스의 대표적인 타임랩스 비디오 레코딩(z-projection). 12kHz 공진 스캐너와 숫자 조리개 0.95(라이카), z-스택 획득 10s 간격, z 깊이 4 μm, x-y 해상도 384 x 384픽셀, 라인 평균 8을 갖춘 라이카 SP5 현미경으로 획득. 필요할 때마다 프로파일은 평균 z 프로젝션을 얻기 위해 플러그인과 일치하는 ImageJ 템플릿을 사용하여 정렬되었습니다. 이미지 품질에 따라 배경이 차감되고 이미지가 매끄럽어졌으며 밝기와 대비가 조정되었습니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 3: 프로플라슬은 흐름 방향의 변화에 의해 번져입니다. 비디오 1에표시된 부비동성 분기에서 야생형 메가카요시테를 보여주는 타임랩스 비디오는 흐름방향(z-projection)에 따라 한 혈관 지점에서 진동하는 프로플라틀을 확장하는 과정에서 이다. 12kHz 공진 스캐너와 숫자 조리개 0.95(라이카), z-스택 획득 10s 간격, z 깊이 4 μm, x-y 해상도 384 x 384픽셀, 라인 평균 8을 갖춘 라이카 SP5 현미경으로 획득. 프로파일은 플러그인과 일치하는 ImageJ 템플릿을 사용하여 정렬되었으며 평균 z 프로젝션이 얻어졌습니다. 배경이 빼고 이미지가 매끄럽게 되고 밝기와 대비가 조정되었습니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 4: 프로플라틀렛 정렬 및 장력에 대한 흐름의 영향. 심장 마비 전후의 프로 플라틀릿의 시간 경과 비디오 녹화. 이 비디오는 심장 마비 전에 동일한 흐름 선에서 3개의 프로플라틀렛(녹색, AF-488 항-GPIX 항체 유도체로 표시)을 나타내므로, 따라서 2개의 광자 현미경 검사법의 해상도에서 제대로 개별화되지 않습니다. 심장 마비 후, 세 개의 proplatelets 분리 하 고 혈 류의 부재에서 완화 된다. 8kHz 공진 스캐너가 장착된 라이카 SP8 공초점 현미경으로 획득한 비디오는 25배의 수분 목표를 가진 이미지이며, 수치 조리개 0.95(라이카). 프로파일은 플러그인과 일치하는 ImageJ 템플릿을 사용하여 정렬되었으며 평균 z 프로젝션이 얻어졌습니다. 배경이 빼고 이미지가 매끄럽게 되고 밝기와 대비가 조정되었습니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 5: WT 마우스의 프로플라틀 거동에 빈크리스틴 약물 주입의 영향. 빈크리스틴(1 mg/kg)(z-프로젝션)의 투여 전후에 프로플라셋의 타임랩스 비디오 기록. 부비동성 혈관(빨간색) 내의 장시간 연장 된 장혈소판 (녹색)은 빈크리스틴의 정맥 투여 후 철회되기 시작합니다. 비디오는 8kHz 공진 스캐너가 장착된 라이카 SP8 공초점 현미경으로 획득되었으며, 25배의 수분 목표가 있는 이미지는 0.95(라이카)의 수치 조리개를 장착했습니다. 프로파일은 ImageJ 템플릿 매칭 플러그인을 사용하여 정렬되었으며 평균 z 프로젝션이 얻어졌습니다. 배경이 빼고 이미지가 매끄럽게 되고 밝기와 대비가 조정되었습니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 6: 미오신 결핍 마우스의 프로플라틀 거동에 빈크리스틴 약물 주입의 영향. 빈크리스틴(1 mg/kg)(z-프로젝션)의 투여 전후에 프로플라셋의 타임랩스 비디오 기록. 부비동성 혈관 내의 장시간 프로플라틀(녹색)은 Myh9-/-마우스에서 계속 길게 서있다. 비디오는 8kHz 공진 스캐너가 장착된 라이카 SP8 공초점 현미경으로 획득되었으며, 25배의 수분 목표가 있는 이미지는 0.95(라이카)의 수치 조리개를 장착했습니다. 프로파일은 ImageJ 템플릿 매칭 플러그인을 사용하여 정렬되었으며 평균 z 프로젝션이 얻어졌습니다. 배경이 빼고 이미지가 매끄럽게 되고 밝기와 대비가 조정되었습니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 S1: 두개골 반지및 지지의 3D 프린팅을 위한 디자인. 이러한 설계는 고품질 스테인리스 스틸,(B)나사,(C)스테인리스 의 블록,(D)ABS 폴리머의 지지체에서 3D 프린트(A) 두개골 링에 사용되었다. 약어: 3D = 3차원; ABS = ABS = 아크릴로니트리엘 부타디엔 스티렌. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
추가 동영상:
추가 비디오 1: 골수 시누소이드(빨간색, Qtracker) 내에서 프로플라틀(녹색)을 확장하는 메가카요사이클이 있는 야생형 마우스의 대표적인 타임랩스 비디오 레코딩(z-projection). 라이카 SP5 현미경은 12kHz 공진 스캐너와 0.95 (라이카)의 숫자 조리개, 10 s 간격의 z 스택 획득, 1.34 μm의 z-깊이, x-y 해상도 384 x 384 픽셀, 라인 평균 8을 갖춘 라이카 SP5 현미경으로 획득. 필요할 때마다 프로파일은 플러그인과 일치하는 ImageJ 템플릿을 사용하여 정렬되어 평균 z 프로젝션을 얻었습니다. 이미지 품질에 따라 배경이 차감되고 이미지가 매끄럽어졌으며 밝기와 대비가 조정되었습니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
추가 비디오 2: 골수 시누소이드(빨간색, Qtracker) 내에서 프로플라틀(녹색)을 확장하는 메가카요사이클이 있는 야생형 마우스의 대표적인 타임랩스 비디오 레코딩(z-projection). 라이카 SP5 현미경은 12kHz 공진 스캐너와 0.95 (라이카)의 숫자 조리개, 10 s 간격의 z 스택 획득, 1.34 μm의 z-깊이, x-y 해상도 384 x 384 픽셀, 라인 평균 8을 갖춘 라이카 SP5 현미경으로 획득. 필요할 때마다 프로파일은 플러그인과 일치하는 ImageJ 템플릿을 사용하여 정렬되어 평균 z 프로젝션을 얻었습니다. 이미지 품질에 따라 배경이 차감되고 이미지가 매끄럽어졌으며 밝기와 대비가 조정되었습니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 재료:
코딩 파일 1: 3D 프린팅 블록. 블록 인쇄를 위한 3D 개체 파일입니다. 이 코딩 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
코딩 파일 2 : 3D 인쇄 두개골 링. 두개골 반지의 인쇄를위한 3D 개체 파일. 이 코딩 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
코딩 파일 3: 3D 프린팅 지원. 지원 인쇄를 위한 3D 개체 파일입니다. 이 코딩 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
코딩 파일 4: 3D 프린팅 나사 링. 나사 인쇄를 위한 3D 개체 파일입니다. 이 코딩 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
혈소판 형성의 메커니즘은 골수 환경에 크게 의존한다. 따라서, 인트라바이탈 현미경 검사는 실시간으로 프로세스를 시각화하는 분야에서 중요한 도구가되었습니다. 형광 메가카요세포가 있는 마우스는 조건부 형광 유전자 발현 카세트를 함유하는 어떤 플로스기자 마우스와 함께 메가카요사이클로 Cre 재조합을 발현하는 마우스를 교차시킴으로써 얻을 수 있다. 여기서, mTmG 기자 마우스는 (B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo10을Pf4-cre마우스(11)와교차하여, 메가카요사이클및 혈소판에서 강렬한 녹색 형광 라벨링을 허용하였다. 일부 누설은 단백구/대식세포 및 섬유아세포12,13을포함하는 백혈구에 있는 Pf4-cre 마우스로 보고되었다는 것을 주의하는 것이 중요합니다.
그러나, 거대 카르요세포는 그들의 큰 크기 및 핵에 의해 쉽게 인식됩니다. 필드에 새로운 실험자는 [mTmG;에서 관측을 비교할 수 있습니다; Pf4-cre] 메가카요세포 특이적 라벨링 후 얻어낸 마우스. 이는 혈소판 특이단백질, GPIX(CD42a)3,14에대하여 향하는 알렉사 플루올표시 항체의 정맥투여를통해 가능하다. 이 후자의 접근법은 또한 형광 기자 마우스를 가진 지루하고 시간이 많이 소요되는 마우스 횡단을 수행하지 않고 유전자 조작 마우스에서 형광 메가 카요사이클을 이미징하는 데 도움이됩니다. 여기서, 5-7주 된 마우스는 더 반투명하고 오래된 마우스에 비해 이미징을 용이하게 하는 얇은 뼈로 존재하는 젊은 마우스로 사용되었다. 그러나, 너무 젊은 마우스는 누출없이 두개골 고리의 설치에 어려움을 초래할 수 있습니다.
이 연구에서는, 0.95(재료의 표)의 수치 조리개를 가진 25배 물 목표를 갖춘 라이카현미경을사용하여 생체 내 이미징을 수행하였다. 목표는 최적의 작업 거리와 두개골 반지에 의해 형성 된 컵을 입력 할 수 있도록 원성이어야한다. 이미지는 공진 스캐너(12 또는 8kHz)로 기록되었습니다. 전체 설정은 응답해야 할 과학적 질문의 유형에 따라 달라지며 필요한 배율, 해상도 및 획득 속도에 따라 최적화되어야 합니다. 예를 들어, 12kHz 공진 스캐너를 사용하면 25배 의 목표가 혈소판 속도를 측정하는 데 더 적합하지만 8kHz 스캐너와 낮은 배율은 증판을 기록하기에 충분할 수 있습니다.
프로토콜의 가장 중요한 단계는 누출이 발생하지 않도록 두개골 뼈에 링의 올바른 부착이며 기록 중에 분리되지 않도록하는 것입니다. 이를 위해, 반지를 적용하기 직전에 두개골 뼈가 건조하는 것이 필수적입니다. 반지가 붙어 나면 뼈를 빠르게 다시 가습합니다. 더욱이, 고리에 헤드의 무게에 의해 가해지는 힘으로 인해, 링은 레코딩 중에 부분적으로 분리될 수 있는 장력을 받게 된다. 이것은 누설을 일으키는 원인이 되고, 따라서, 뼈의 건조를 일으키는 원인이 될 수 있습니다, 나쁜 질 심상 및 바람직하지 않은 선동적인 반응 둘 다에 이끌어 내는. 이 문제는 마우스의 코 아래에 접힌 압축을 추가하여 머리를 지지함으로써 쉽게 피할 수있습니다(도 3C). 또 다른 중요한 점은 출혈과 반지 내부의 혈액 의 존재를 최소화하는 것입니다. 이것은 결함이 있는 hemostasis를 제시하고 출혈하기 쉬운 마우스를 공부할 때 명심해야 합니다. dextran과 같은 일부 추적자는 메가 카요세포의 녹색 형광은 아니지만 혈관 이미징을 악화시키는 농축 된 형태로 주입하면 골수 구멍에 누출을 초래할 수 있습니다. Qtracker-655는 많이 누출되지 않지만 30분 이내에 순환에서 제거되므로 추적기의 새로운 주사가 장기간 혈관을 시각화해야 합니다.
여기에 설명된 이 방법의 한 가지 제한은 마취제를 다시 주입하기 위해 35분마다 인수를 중단할 필요성입니다. 마취 기계를 사용할 수 있는 경우 이 제한을 극복할 수 있습니다. 이 경우 마취는 케타민과 자일라진 혼합물의 i.p. 주입에 의해 유사하게 유도될 수 있으며, 이는 카테터와 경미한 수술의 삽입을 수행하는 가장 쉬운 방법입니다. 일단 현미경 목표 의 밑에 위치하면, 마취는 가스의 흡입에 의해 그 때 유지됩니다 (산소의 혼합물, 이소플루란 및 주변 공기와 같은 마취제). 이러한 방식으로 관찰은 중단 없이 몇 시간 동안 이루어질 수 있습니다. 그러나, 윤리적인 이유로, 관측은 이 연구 결과에 있는 3 시간으로 제한되었습니다. 케타민/자일라진 혼합물을 사용하는 또 다른 제한은 혈소판 기능에 대한 잠재적 인 해로운 영향이 될 수 있습니다16 이는 대체 마취 계획을 필요로 할 수 있습니다.
전반적으로, 이 잘 확립 된 프로토콜의 주요 장점은 최소한의 수술만으로 비침습적 측면입니다. 다른 프로토콜은 긴 뼈에서 시간 경과 인트라비티 이미징을 수행하기 위해 개발되었습니다. 이들은 대퇴골머리(19,20)에가까운 근육 조직 제거 및 뼈마모(17,18),이식된 내시경 프로브를 필요로 하거나 대퇴골(21)에 창챔버를 설치하는 침습적 수술에 의존한다. 이러한 모든 절차는 주요 외상과 염증의 다양한 정도를 초래합니다. 염증은 마우스에 해로울 뿐만 아니라, 통제되지 않는 염증 조건이 데이터의 불일치 및 오해로 이어질 수 있도록 혈소판 형성6의 과정을 수정하는 것으로보고되었습니다. 그래서 이 절차는 염증 반응을 피하기 위해 선택되었습니다. 그러나, 과학적 질문에 따라, 실험자는 더 깊은 관측 장과 더 높은 해상도 (적은 산란)를 선호할 수 있습니다, 염증 반응의 낮은 정도의 비용으로 두개골 숱이 기반의 접근 방식을 사용하여 가능하다.
비침습적 특성으로 인해 이 방법의 주요 한계는 도달 할 수있는 최대 깊이입니다. 뼈의 밀도와 산란 특성으로 인해 수백 마이크로미터의 깊이 내에 영역을 이미지화하여 전체 calvarial 골수의 관찰을 방지할 수 있습니다. 더 높은 적외선 여기 파장에 의존하는 3 광자 현미경 검사법의 발달은 우수한 심조직 해상도를 가진 유망한 접근 법인 것 같습니다. 이미 뼈22,23을통해 뇌 깊숙이 이미지를 형성하는 데 성공적으로 사용되어 뼈를 얇게 하거나 수술 창을 이식하지 않고도 긴 뼈 내에서 골수를 이미지할 수 있는 흥미로운 가능성을 열어주었습니다.
요약하자면, 이 방법은 골수에 있는 거대 karyocytes의 행동을 공부하고 proplatelets의 확장을 구상하기 위하여 점점 더 이용됩니다. 또한, 기본 골수의 일부뿐만 아니라 외부 칼변변성 콤팩트 골격의 시각화를 허용함으로써, 이 방법은 이미 혈소판 필드 외부의 많은 응용 분야에서 사용되고 있다. 골세포와 골수 세포 역학, 골세포 밀매 및 골수 출구, 내피 세포 및 미세 혈관 구조, 골수 마이크로컬럼의 혈류 역학, 또는 세포 호밍24를포함한 그들의 환경에서 골수 세포 역학을 연구하는 데 사용되어 왔다.
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Disclosures
저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 우리가 실험실에서 기술을 설립 할 때 두 광자 현미경 실험에 대한 자신의 전문가 조언에 대한 플로리안 게르트너 (과학 기술 오스트리아, 클로스터뉴부르크, 오스트리아) 플로리안 게르트너 (과학 기술 오스트리아, 오스트리아)에 감사하고 싶습니다, 이미징 센터 IGBMC /CBI (일키르치, 프랑스)에서 이브 루츠 자신의 전문 지식과 두 개의 사진 현미경에 대한 도움. 우리는 또한 그의 기술적 인 도움에 대한 장 이브 린셀과 그림 1에서 스키마의 그림에 대한 이네스 기나드 감사합니다. 우리는 ARMESA (협회 드 Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique)의 두 광자 현미경 의 인수에 대한 지원에 감사드립니다. AB는 에타블리스 프랑수아 뒤 상 (APR2016)과 기관 내셔널 드 라 레체체 (ANR-18-CE14-0037-01)에서 박사 후 펠로우십에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GNU Octave software | GNU Project | https://www.gnu.org/software/octave/ | |
| Histoacryl 5 x 0, 5 mL | Braun | 1050052 | injectable solution of surgical glue |
| HyD hybrid detectors Leica Microsystems 4tunes | Leica Microsystems | ||
| ImageJ | GNU project | Minimum version required | |
| Imalgene/Ketamine 1000 fl/10 mL | Boehring | 03661103003199 | eye protection |
| Leica SP8 MP DIVE microscope equipped with a 25x water objective, numerical aperture of 0.95 | Leica Microsystems | simultaneous excitation of AlexaFluor-488 and Qtracker-655 | |
| Matlab | MathWorks | https://www.mathworks.com/ | |
| Ocrygel 10 g | Laboratoires T.V.M. | 03700454505621 | Silicon dental paste blue and yellow |
| Picodent twinsin speed | Rotec | 13001002 | |
| Qtracker 655 vascular label | Invitrogen | Q21021MP | injectable solution |
| Resonant scanner, 8 or 12 kHz | |||
| Rompun Xylazine 2% fl/25 mL | Bayer | 04007221032311 | |
| Superglue gel | to glue the ring to the bone | ||
| Surflo IV catheter - Blue 22 G | Terumo | SR-OX2225C1 | |
| Ti:Saph pulsing laser (Coherent) (femtosecond) | Coherent |
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