Mikrokirurgisk obstruktion af testiklerne fusion i Spodoptera litura
Summary
Aluminiumsfolie blev mikrokirurgisk indsat mellem testiklerne af Spodoptera litura for at hindre fusionen af testikler. Proceduren omfatter frysning, fastgørelse, desinfektion, snit, placering af barrieren, suturering, postoperativ fodring og inspektion. Denne tilgang giver en metode til at forstyrre vævsdannelsen.
Abstract
I stedet for at anvende genetiske metoder som RNA-interferens (RNAi) og grupperet regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser (CRISPR) / CRISPR-associeret endonuklease Cas9, blev en fysisk barriere mikrokirurgisk indsat mellem testiklerne af Spodoptera litura for at studere virkningen af denne mikrokirurgi på dens vækst og reproduktion. Efter indsættelse af aluminiumsfolie mellem testiklerne fortsatte insektsmeltning under metamorfose normalt. Insektvækst og -udvikling blev ikke bemærkelsesværdigt ændret; Antallet af sædbundter ændrede sig imidlertid, hvis testiklernes fusion blev stoppet af mikrooperationen. Disse resultater indebærer, at blokering af testikelfusion kan påvirke mandlig reproduktionsevne. Metoden kan yderligere anvendes til at afbryde kommunikationen mellem organer for at studere funktionen af specifikke signalveje. Sammenlignet med konventionel kirurgi kræver mikrokirurgi kun frysende anæstesi, hvilket foretrækkes frem for kuldioxidanæstetisering. Mikrokirurgi minimerer også operationsstedets område og letter sårheling. Udvælgelsen af materialer med specifikke funktioner kræver dog yderligere undersøgelse. Undgå vævsskade er afgørende, når du laver snit under operationen.
Introduction
Fusion er et almindeligt fænomen i vævs- eller organudvikling. Eksempler inkluderer dorsal lukning og thorax lukning i Drosophila1 og gane morphogenese, neuralrør morfogenese, og hjerte morfogenese i mus og kylling2. CRISPR og RNAi er blevet anvendt til at undersøge genernes roller i fusionsprocessen2,3,4.
Spodoptera litura (S. litura, Lepidoptera: Noctuidae) er et skadeligt polyfagisk skadedyr, der er bredt udbredt i tropiske og subtropiske områder i Asien, herunder Kina4,5,6. Den brede fordeling af S. litura tilskrives delvis dens kraftige reproduktionsevne, som er relevant for gonadudvikling. Mandlig infertilitet er en tilgang til at kontrollere dette skadedyr. Som vist i den skematiske figur af testikelstruktur er testiklerne omgivet af testikeskeden, herunder den ydre kappe (peritoneal kappe) og indre basale lamina. Den basale lamina strækker sig internt for at danne follikulært epitel og adskiller testiklernes indre område i fire kamre ved navn follikler (figur 1).
I folliklerne udvikler spermatogonia sig til spermatozoer efter mitose og meiose, og derefter justeres spermatozoerne i sædsækkene i samme retning for at danne sædbundter7. Under spermatogenese differentierer de primære spermatocytter sig til eupyrensædceller eller apyrensædceller. Spermatocytter i larvefasen udvikler sig til eupyrensæd med en lang hale forbundet med et hoved af en langstrakt kerne; disse kan befrugte æg. Omvendt udvikler spermatocytter i midten af puppefasen sig til apyrensæd med en kasseret kerne; disse sædceller hjælper med overlevelse, bevægelse og befrugtning af eupyrensæd9,10. Den 6. dag i puppen er den periode, hvor testiklerne har rigelige eupyren- og apyrensædbundter.
Figur 1: Skematisk diagram over testikelstrukturen af Lepidoptera insekter11. Klik her for at se en større version af denne figur.
Testikelfusion forekommer i de fleste insekter af Lepidoptera-ordenen11,12, især i de arter, der er landbrugsskadedyr. Testikelfusion refererer til et par testikler, der vokser bilateralt i larvefasen, nærmer sig og klæber til hinanden og til sidst integreres i en enkelt gonad11. I Spodoptera litura sker det under metamorfose fra larven til puppestadiet. Fra dag 1 i den 5. instar (L5D1) til dag 4 i den 6. instar (L6D4) vokser parret testikler gradvist i størrelse, og farven bliver lysegul fra elfenbenshvid. Det bliver svagt rødt, når det når prepupalfasen (L6D5 til L6D6). To bilaterale symmetriske testikler nærmer sig hinanden i præpuppestadiet, smelter sammen til en og vrider mod uret (doral visning) for at producere en enkelt testikler i puppe- og voksenfasen11. Dette fænomen forekommer ikke i silkeorme, som har stor økonomisk betydning og er blevet tæmmet i 5000 år13. Det antages således, at testiklernes fusion forbedrer reproduktionsevnen.
For at bestemme betydningen af Spodoptera litura testikelfusion er det vigtigt at undersøge virkningerne af at blokere processen. I denne protokol blev aluminiumsfolie mikrokirurgisk indsat mellem testiklerne for at holde dem adskilt, og de deraf følgende ændringer i udviklingen af insekterne og deres testikler blev undersøgt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Efter mikrokirurgisk obstruktion af testiklernes fusion i Spodoptera litura faldt antallet af sædbundter, hvilket understøttede hypotesen om, at denne fusion er gavnlig for reproduktionsevnen. Kirurgisk manipulation er blevet brugt til at studere den fysiologiske udvikling af insekter siden begyndelsen af det 20. århundrede. For at afgøre, om kranialnerven er reguleret af insektmetamorfose, udførte nogle forskere procedurer såsom ligation og halshugning på forskellige insekter (herunder Rho…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (nr.:31772519, 31720103916; ) og et åbent tilskud fra State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology, South West University (nr.: sklsgb2013003).
Materials
| 75% Rubbing alcohol | Qingdao Hainuo Nuowei Disinfection Technology Co., Ltd | Q/370285HNW 001-2019 | |
| Colored Push Pins | Deli Group Co.,LTD | 0042 | |
| Corneal Scissors | Suzhou Xiehe Medical Device Co., Ltd | MR-S221A | Curved and blunt tip |
| Glad Aluminum Foil | Clorox China(Guangzhou) Limited | 831457 | 10 cm*2.5 cm*0.6 |
| Medical Cotton Swabs (Sterile) | Winner Medical Co., Ltd. | 601-022921-01 | |
| Medical Iodine Cotton Swab | Winner Medical Co., Ltd. | 608-000247 | |
| Needle holder | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. | J32030 | 14 cm fine needle |
| Sterile surgical blade | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LTD | #11 | |
| Suigical Blade Holder | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LTD | K6-10 | Straight 3# |
| Suture thread with needle | Ningbo Medical Stitch Needle Co., Ltd | needle: 3/8 Circle, 2.5*8 ; Thread: Nylon, 6/0, 25 cm | |
| Tying Forceps | Suzhou Xiehe Medical Device Co., Ltd | MR-F201T-3 | Straight-pointed; long handle; 0.12 mm-wide-head |
References
- Zeitlinger, J., Bohmann, D. Thorax closure in Drosophila: involvement of Fos and the JNK pathway. Development. 126 (17), 3947-3956 (1999).
- Ray, H. J., Niswander, L. Mechanisms of tissue fusion during development. Development. 139 (10), 1701-1711 (2012).
- Ducuing, A., Keeley, C., Mollereau, B., Vincent, S. A. DPP-mediated feed-forward loop canalizes morphogenesis during Drosophila dorsal closure. The Journal of Cell Biology. 208 (2), 239-248 (2015).
- Du, Q., et al. Identification and functional characterization of doublesex gene in the testis of Spodoptera litura. Insect Science. 26 (6), 1000-1010 (2019).
- Qin, H. G., Ding, J., Ye, Z. X., Huang, S. J., Luo, R. H. Dynamic analysis of experimental population of Spodoptera litura. Journal of Biosafety. 13 (2), 45-48 (2004).
- Guan, B. B., et al. The research in biology and ecology of Spodoptera litura. Journal of Biosafety. 8 (1), 57-61 (1999).
- Wen, L., et al. The testis development and spermatogenesis in Spodopture litura (lepidoptera: noctuidae). Journal of South China Normal University (Natural Science Edition. 51 (4), 47-56 (2019).
- Friedländer, M., Seth, R. K., Reynolds, S. E. Eupyrene and apyrene sperm: dichotomous spermatogenesis in Lepidoptera. Advances in Insect Physiology. 32, 206 (2010).
- Cook, P. A., Wedell, N. Non-fertile sperm delay female remating. Nature. 397 (6719), 486 (1999).
- Iriki, S. On the function of apyrene spermatozoa in the silk worm. Zoological Magazine. 53, 123-124 (1941).
- Liu, L., Feng, Q. L. The study of fusion of testis in Lepidoptera insects. Journal of South China Normal University (Natural Science Edition). 46 (5), 1-7 (2014).
- Klowden, M. J. . Physiological systems in insects. , (2007).
- Xu, J., et al. Transgenic characterization of two testis-specific promoters in the silkworm, Bombyx mori. Insect Molecular Biology. 24 (2), 183-190 (2015).
- Guo, X. R., Zheng, S. C., Liu, L., Feng, Q. L. The sterol carrier protein 2/3-oxoacyl-CoA thiolase (SCPx) is involved in cholesterol uptake in the midgut of Spodoptera litura: gene cloning, expression, localization and functional analyses. BioMed Central Molecular Biology. 10, 102 (2009).
- Kopeć, S. Studies on the necessity of the brain for the inception of insect metamorphosis. Biological Bulletin. 42 (6), 323-342 (1922).
- Wigglesworth, V. B. Factors controlling moulting and ‘metamorphosis’ in an insect. Nature. 133 (5), 725-726 (1934).
- Williams, C. N. Physiology of insect diapause; the role of the brain in the production and termination of pupal dormancy in the giant silkworm, Platysamia cecropia. Biological Bulletin. 90 (3), 234-243 (1946).
- Fukuda, S. Hormonal control of molting and pupation in the silkworm. Proceedings of the Imperial Academy Tokyo. 16 (8), 417-420 (1940).
- Tian, H. J., Liu, Z. P., Bai, Y. Y. Common methods to detect Sperm quality of mammalian. Journal of Economic Zoology. 8 (4), 198-201 (2004).
- Ji, X. S., Chen, S. L., Zhao, Y., Tian, Y. S. Progress in the quality evaluation of fish sperm. Chinese Fishery Science. 14 (6), 1048-1054 (2007).
- Baulny, B. O. D., Vern, Y. L., Kerboeuf, D., Maisse, G. Flow cytometric evaluation of mitochondrial activity and membrane integrity in fresh and cryopreserved rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) spermatozoa. Cryobiology. 34 (2), 141-149 (1997).
- Krasznai, Z., Márián, T., Balkay, I., Emri, M., Trón, L. Permeabilization and structural changes in the membrane of common carp (Cyprinus carpio L.) sperm induced by hypo-osmotic shock. Aquaculture. 129 (1), 134 (1995).
- Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry & Physiology Toxicology & Pharmacology Cbp. 130 (4), 425-433 (2001).
- Rurangwa, E., Volckaert, F. A., Huyskens, G., Kime, D. E., Ollevier, F. Quality control of refrigerated and cryopreserved semen using computer-assisted sperm analysis (CASA), viable staining and standardized fertilization in African catfish (Clarias gariepinus). Theriogenology. 55 (3), 751-769 (2001).
- Seth, R. K., Kaur, J. J., Rao, D. K., Reynolds, S. E. Effects of larval exposure to sublethal concentrations of the ecdysteroid agonists RH-5849 and tebufenozide (RH-5992) on male reproductive physiology in Spodoptera litura. Journal of Insect Physiology. 50 (6), 505-517 (2004).
- Sweeney, R. M., Watterson, R. L. Rib development in chick embryos analyzed by means of tantalum foil blocks. American Journal of Anatomy. 126 (2), 127-149 (1969).
- Wilde, S., Logan, M. P. Application of impermeable barriers combined with candidate factor soaked beads to study inductive signals in the chick. Journal of Visualized Experiments. (117), e54618 (2016).
