Spodoptera litura에서 Testes Fusion의 미세 외과 적 폐색
Summary
알루미늄 호일은 고환의 융합을 방해하기 위해 Spodoptera litura 의 고환 사이에 미세 외과 적으로 삽입되었습니다. 절차에는 동결, 고정, 소독, 절개, 장벽 배치, 봉합, 수술 후 수유 및 검사가 포함됩니다. 이러한 접근법은 조직 형성을 방해하는 방법을 제공한다.
Abstract
RNA 간섭 (RNAi)과 같은 유전 적 방법을 사용하고 정기적으로 간격이 짧은 구두체 반복 (CRISPR) / CRISPR 관련 엔도뉴클레아제 Cas9와 같은 유전 적 방법을 사용하는 대신, 물리적 장벽이 Spodoptera litura 의 고환 사이에 미세 외과 적으로 삽입되어이 미세 수술이 성장과 번식에 미치는 영향을 연구했습니다. 고환 사이에 알루미늄 호일을 삽입 한 후, 변태 중 곤충 털갈이가 정상적으로 진행되었습니다. 곤충의 성장과 발달은 현저하게 변화되지 않았다. 그러나 고환 융합이 미세 수술에 의해 중단되면 정자 다발의 수가 변경되었습니다. 이러한 발견은 고환 융합을 차단하는 것이 남성 생식 능력에 영향을 줄 수 있음을 의미합니다. 이 방법은 특정 신호 전달 경로의 기능을 연구하기 위해 기관 간의 통신을 중단하는 데 더 적용될 수 있습니다. 기존의 수술에 비해, 미세수술은 동결마취만을 필요로 하며, 이는 이산화탄소 마취보다 바람직하다. 미세 수술은 또한 수술 부위 영역을 최소화하고 상처 치유를 용이하게합니다. 그러나 특정 기능을 가진 재료를 선택하려면 추가 조사가 필요합니다. 수술 중 절개를 할 때 조직 손상을 피하는 것이 중요합니다.
Introduction
융합은 조직 또는 장기 발달에서 흔히 발생하는 현상입니다. 그 예로는 Drosophila1에서의 등쪽 폐쇄 및 흉부 폐쇄 및 구개골 형태형성, 신경관 형태형성, 및 마우스 및 닭에서의 심장 형태형성2이 포함된다. CRISPR 및 RNAi는 융합 과정에서 유전자의 역할을 조사하기 위해 적용되었습니다2,3,4.
Spodoptera litura (S. litura, Lepidoptera : Noctuidae)는 중국을 포함한 아시아의 열대 및 아열대 지역에 널리 분포하는 해로운 다식성 해충입니다4,5,6. S. litura의 광범위한 분포는 부분적으로 생식선 발달과 관련된 강력한 생식 능력에 기인합니다. 남성 불임은이 해충을 방제하는 한 가지 접근법입니다. 고환 구조의 개략적인 그림에서 볼 수 있듯이, 고환은 외부 외피 (복막 외피) 및 내부 기저 라미나를 포함한 고환 외피에 의해 둘러싸여 있습니다. 기저 라미나는 내부적으로 확장되어 여포 상피를 형성하고 고환의 내부 영역을 여포라는 네 개의 챔버로 분리합니다 (그림 1).
여포에서 정자는 유사분열과 meiosis 후에 정자로 발전하고, 정자 주머니의 정자는 같은 방향으로 정렬되어 정자 다발을 형성합니다7. 정자 생성 동안, 일차 정자 세포는 유피렌 정자 또는 아피렌 정자로 분화됩니다. 유충 단계의 정자 세포는 길쭉한 핵의 머리에 연결된 긴 꼬리를 가진 유피렌 정자로 발전합니다. 이들은 알을 비옥하게 할 수 있습니다. 반대로, 번데기 중반 단계의 정자 세포는 버려진 핵을 가진 아피렌 정자로 발전합니다. 이 정자는 유피렌 정자의 생존, 운동 및 수정을 돕습니다9,10. 번데기의 6 일째 날은 고환이 풍부한 유피렌과 아피렌 정자 번들을 가지고있는 기간입니다.
그림 1 : Lepidoptera 곤충의 고환 구조의 개략도11. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
고환 융합은 Lepidoptera 순서의 대부분의 곤충에서11,12, 특히 농업 해충 인 종에서 발생합니다. 고환 융합은 애벌레 단계에서 양측으로 자라는 한 쌍의 고환을 말하며, 서로 접근하고 고수하여 결국 단일 생식선으로 통합됩니다 11. Spodoptera litura에서는 애벌레에서 번데기 단계로 변태하는 동안 발생합니다. 5번째 인스타(L5D1)의 1일째부터 6번째 인스타(L6D4)의 4일째까지, 한 쌍의 고환은 점차 크기가 커지고, 색은 아이보리 화이트에서 연한 노란색으로 변합니다. 그것은 준비 단계 (L6D5 내지 L6D6)에 도달함에 따라 희미한 적색이된다. 두 개의 양측 대칭 고환이 준비 단계에서 서로 접근하고, 하나로 융합되고, 시계 반대 방향 (doral view)을 비틀어 번데기와 성인 단계에서 단일 고환을 생성합니다11. 이 현상은 상당한 경제적 중요성을 가지고 있으며 5000 년 동안 길들여진 누에에서는 발생하지 않습니다.13. 따라서 고환의 융합이 생식 능력을 향상시킨다고 가정합니다.
Spodoptera litura 고환 융합의 중요성을 결정하기 위해서는 과정을 막는 효과를 조사하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜에서 알루미늄 호일은 고환 사이에 미세 외과 적으로 삽입되어 분리되도록 유지했으며 곤충과 고환의 발달에 따른 변화가 연구되었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Spodoptera litura에서 미세 외과 적으로 고환 융합을 방해 한 후, 정자 다발의 수가 감소하여이 융합이 생식 능력에 도움이된다는 가설을지지했습니다. 외과 적 조작은 20 세기 초부터 곤충의 생리 학적 발달을 연구하는 데 사용되어 왔습니다. 두개골 신경이 곤충 변형에 의해 조절되는지 여부를 결정하기 위해 일부 연구자들은 다른 곤충 (Hemiptera의 Rhodnius prolixus, Lepidoptera의 Lym…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (Nos.:31772519, 31720103916; )과 사우스 웨스트 대학 실크웜 게놈 생물학의 국가 핵심 연구소 (No.: sklsgb2013003)의 공개 보조금에 의해 지원되었습니다.
Materials
| 75% Rubbing alcohol | Qingdao Hainuo Nuowei Disinfection Technology Co., Ltd | Q/370285HNW 001-2019 | |
| Colored Push Pins | Deli Group Co.,LTD | 0042 | |
| Corneal Scissors | Suzhou Xiehe Medical Device Co., Ltd | MR-S221A | Curved and blunt tip |
| Glad Aluminum Foil | Clorox China(Guangzhou) Limited | 831457 | 10 cm*2.5 cm*0.6 |
| Medical Cotton Swabs (Sterile) | Winner Medical Co., Ltd. | 601-022921-01 | |
| Medical Iodine Cotton Swab | Winner Medical Co., Ltd. | 608-000247 | |
| Needle holder | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. | J32030 | 14 cm fine needle |
| Sterile surgical blade | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LTD | #11 | |
| Suigical Blade Holder | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LTD | K6-10 | Straight 3# |
| Suture thread with needle | Ningbo Medical Stitch Needle Co., Ltd | needle: 3/8 Circle, 2.5*8 ; Thread: Nylon, 6/0, 25 cm | |
| Tying Forceps | Suzhou Xiehe Medical Device Co., Ltd | MR-F201T-3 | Straight-pointed; long handle; 0.12 mm-wide-head |
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