Bildgebung und Quantifizierung intakter neuronaler Dendriten mittels CLARITY Tissue Clearing
Summary
Neuronale dendritische Morphologie liegt oft der Funktion zugrunde. Tatsächlich manifestieren sich viele Krankheitsprozesse, die die Entwicklung von Neuronen beeinflussen, mit einem morphologischen Phänotyp. Dieses Protokoll beschreibt eine einfache und leistungsfähige Methode zur Analyse intakter dendritischer Dornen und der dazugehörigen Stacheln.
Abstract
Die Gehirnaktivität, die elektrochemischen Signale, die zwischen Neuronen übertragen werden, wird durch die Konnektivitätsmuster neuronaler Netzwerke und durch die Morphologie von Prozessen und Unterstrukturen innerhalb dieser Neuronen bestimmt. Daher ist vieles von dem, was über die Gehirnfunktion bekannt ist, neben Entwicklungen in bildgebenden Technologien entstanden, die weitere Einblicke in die Organisation und Verbindung von Neuronen im Gehirn ermöglichen. Verbesserungen bei der Gewebereinigung haben eine hochauflösende Bildgebung dicker Hirnschnitte ermöglicht, was die morphologische Rekonstruktion und Analyse neuronaler Unterstrukturen wie dendritischer Dorne und Stacheln erleichtert. Gleichzeitig bieten Fortschritte in der Bildverarbeitungssoftware Methoden zur schnellen Analyse großer bildgebender Datensätze. Diese Arbeit stellt eine relativ schnelle Methode zur Verarbeitung, Visualisierung und Analyse dicker Scheiben von markiertem Nervengewebe in hoher Auflösung mit CLARITY-Gewebereinigung, konfokaler Mikroskopie und Bildanalyse vor. Dieses Protokoll wird die Bemühungen erleichtern, die Konnektivitätsmuster und neuronalen Morphologien zu verstehen, die gesunde Gehirne charakterisieren, und die Veränderungen dieser Eigenschaften, die in kranken Gehirnzuständen auftreten.
Introduction
Das Verständnis der räumlichen Organisation, der Konnektivitätsmuster und der Morphologie komplexer dreidimensionaler biologischer Strukturen ist für die Abgrenzung der Funktionen bestimmter Zellen und Gewebe unerlässlich. Dies gilt insbesondere für die Neurowissenschaften, in denen enorme Anstrengungen unternommen wurden, um hochauflösende neuroanatomische Karten des zentralen Nervensystems zu erstellen1,2. Eine genaue Untersuchung der Neuronen, aus denen diese Karten bestehen, ergibt unterschiedliche Morphologien mit Verbindungen und Orten, die die Funktion dieser verschiedenen Neuronensätze widerspiegeln3,4. Darüber hinaus kann die Untersuchung subzellulärer Strukturen, insbesondere dendritischer Stacheln, die Reife von Synapsen beeinflussen und dabei Entwicklungsprozesse und neurologische Krankheitszuständewiderspiegeln 5,6,7. Daher sind Ansätze, die die Bildauflösung und den Durchsatz verbessern, unerlässlich, um die Gehirnfunktion auf allen Ebenen besser zu verstehen.
Jüngste Fortschritte haben das molekulare und genetische Toolkit zur Markierung und Manipulation von Populationen von Neuronen erweitert. Die Entwicklung neuer fluoreszierender Marker, kombiniert mit neuen Methoden zur Einführung dieser Marker in Neuronen, ermöglicht eine differentielle Markierung von Populationen interagierender Neuronen innerhalb derselben Tier- oder Gehirnprobe8,9,10,11. Da Licht durch undurchsichtige Lipide gestreut wird und angesichts des hohen Lipidgehalts des Hirngewebes die Bildgebung neuronaler Populationen in erster Linie auf dünne Schnitte beschränkt war oder sich auf fortschrittliche mikroskropige Techniken (z. B. konfokale, Multiphotonen- und Lichtblattmikroskopie) stützte, um tiefe Strukturen abzubilden. Diese Bemühungen wurden jedoch durch Fortschritte bei den Gewebereinigungstechniken stark unterstützt. Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging/immunostaining/in situ hybridization-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) ist eine solche Technik, bei der interessante Gewebe mit Hydrogelmonomeren (Acrylamid und Bisacrylamid) infundiert und anschließend mit Reinigungsmitteln gewaschen werden12. Die Hydrogel-Monomere hybridisieren zu einem stabilen 3D-Hydrogel-Gerüst, das optisch transparent und durchlässig für Makromolekül-Etiketten ist. Nukleinsäuren und Proteine bleiben innerhalb der hybridisierten Matrix erhalten, während Lipide durch die Waschmittelwäschen entfernt werden (Abbildung 1). Dies führt zu einem stabilen Gewebe, das starr genug ist, um die ursprüngliche Form und Ausrichtung von Zellen und Nicht-Lipidmolekülen beizubehalten, während es optisch transparent genug ist, um tiefe Strukturen mit hoher Auflösung abzubilden. Diese Aufrechterhaltung der Gewebestruktur und -orientierung ermöglicht die Abbildung dicker Scheiben, wodurch Zell-zu-Zell-Verbindungen und räumliche Beziehungen erhalten bleiben. Da die Lage und Verfügbarkeit von Proteinen und Nukleinsäuren während des Clearingprozesses aufrechterhalten wird, können gereinigte Gewebe außerdem expressionsbasierte Marker sowie exogene Markierungen enthalten. Somit eignet sich CLARITY als potente Methode, um große Mengen tiefer Hirnstrukturen und die Verbindungen zwischen diesen Strukturen mit hoher Auflösung abzubilden.
Der Einsatz von CLARITY verbessert die Ansätze zur Bildgebung neuronaler Populationen erheblich. Diese Technik ist besonders geschickt bei der Erzeugung großer Mengen von Bilddaten. CLARITY funktioniert gut mit mehreren Formen der proteinbasierten Fluoreszenz. Dieses Protokoll verwendet einen lentiviral-basierten Ansatz, um Zellen mit EGFP und tdTomato spärlich zu markieren; Transgene Reporterallele, die tdTomato oder EGFP exprimieren, um Zellen für die Rekonstruktion zu markieren, wurden jedoch routinemäßig verwendet. Es ist wichtig, ein Fluorophor zu wählen, das sowohl lichtstabil als auch hell ist (z. B. EGFP oder tdTomato). Darüber hinaus führt die Verwendung eines starken Promotors zur Expression des Fluorophors zu einem überlegenen Kontrast und einer hervorragenden Bildqualität. Die Nachteile dieser Technik ergeben sich, da die richtige Analyse dieser großen Datenmenge sowohl arbeits- als auch zeitintensiv sein kann. Spezialisierte Mikroskope können dazu beitragen, den Durchsatz zu verbessern und die Arbeitsbelastung zu verringern. Der Bau, Besitz und /oder Betrieb fortschrittlicher Mikroskope ist jedoch für viele Labore oft unerschwinglich. Diese Arbeit stellt eine relativ schnelle und einfache Methode mit hohem Durchsatz dar, um große Mengen neuronalen Gewebes mit hoher Auflösung unter Verwendung von CLARITY-Gewebereinigung großer Abschnitte in Kombination mit konfokaler Standardmikroskopie zu visualisieren. Dieses Protokoll beschreibt diesen Ansatz durch die folgenden Schritte: 1) Sezieren und Vorbereiten des Nervengewebes, 2) Reinigen des Gewebes, 3) Mounten des Gewebes, 4) Abbildung der vorbereiteten Scheiben und 5) Verarbeiten von Vollschnittbildern mit Hilfe der Rekonstruktion und Analyse der Mikroskopie-Visualisierungssoftware (Abbildung 2). Diese Bemühungen führen zu hochauflösenden Bildern, die verwendet werden können, um Populationen von Neuronen, neuronale Verbindungsmuster, 3D-dendritische Morphologie, dendritische Wirbelsäulenhäufigkeit und -morphologie sowie molekulare Expressionsmuster in intaktem Hirngewebe zu analysieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vor dem Aufkommen zeitgenössischer Gewebereinigungstechniken bestand das Studium der neuronalen Morphologie aus zeitintensiven Schnitten, Bildgebung und Rekonstruktion benachbarter sehr dünner Schnitte. Die elektrophoretische Gewebereinigung in Kombination mit konfokaler Bildgebung bietet einen ungehinderten Blick auf die gesamte neuronale Morphologie. Von intakten dendritischen Bäumen bis hin zum kleinsten synaptischen Bouton war die Bildgebung und Quantifizierung der neuronalen Morphologie noch nie so praktikabel wi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten dem viralen Kern NRDDC am Jan and Dan Duncan Neurological Institute für die Herstellung der in diesen Experimenten verwendeten AAVs und Lentiviren danken. Darüber hinaus möchten wir uns beim Baylor College of Medicine Center for Comparative Medicine für die Maushaltung und die allgemeine Wartung der verwendeten Mäuse bedanken. Wir danken der American Heart Association für ihre Unterstützung unter der Preisnummer 20PRE35040011 und BRASS: Baylor Research Advocates for Student Scientists für ihre Unterstützung (PJH). Abschließend möchten wir logos dafür danken, dass sie unserem Labor das elektrophoretische Gewebereinigungssystem Logos X-Clarity zur Verfügung gestellt haben.
Materials
| 15 mL Conical Tube | Thermo Scientific | 339650 | |
| 25 G x 1" Needle | BD | 305127 | |
| 30% Acrylamide (No-Bis) | National Diagnostics | EC-810 | |
| 50 mL Conical Tube | Thermo Scientific | 339653 | |
| Electrophoretic Tissue Clearing Solution | Logos | C13001 | |
| Histodenz | Sigma | D2158-100G | |
| Hydrogel Solution Kit | Logos | C1310X | |
| Imaris | Oxford Instruments | N/A | |
| Paraformaldehyde 16% | EMS | 15710 | |
| PBS, 1x, 500 mL, 6 bottles/case | fisher | MT21040CV | |
| VA-044 | Wako | 925-41020 | |
| X-CLARITY Polymerization System | Logos | C20001 | |
| X-CLARITY Tissue Clearing System II | Logos | C30001 |
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