In vitro Essai tridimensionnel de germination de l’angiogenèse à l’aide de cellules souches embryonnaires de souris pour la modélisation de maladies vasculaires et l’analyse de médicaments
Summary
Ce test utilise des cellules souches embryonnaires de souris différenciées en corps embryoïdes cultivés dans un gel de collagène 3D pour analyser les processus biologiques qui contrôlent la germination de l’angiogenèse in vitro. La technique peut être appliquée pour tester des médicaments, modéliser des maladies et étudier des gènes spécifiques dans le contexte de délétions mortelles pour les embryons.
Abstract
Les progrès récents dans les cellules souches pluripotentes induites (CSPi) et les technologies d’édition de gènes permettent le développement de nouveaux modèles de maladies à base de cellules humaines pour les programmes de découverte phénotypique de médicaments (TED). Bien que ces nouveaux dispositifs puissent prédire plus précisément l’innocuité et l’efficacité des médicaments expérimentaux chez l’homme, leur développement en clinique repose encore fortement sur des données sur les mammifères, notamment l’utilisation de modèles de maladies chez la souris. Parallèlement aux modèles de maladies organoïdes ou d’organes sur puce humains, le développement de modèles murins in vitro pertinents est donc un besoin non satisfait pour évaluer les comparaisons directes de l’efficacité et de l’innocuité des médicaments entre les espèces et les conditions in vivo et in vitro . Ici, un test de germination vasculaire qui utilise des cellules souches embryonnaires de souris différenciées en corps embryoïdes (EB) est décrit. Les EB vascularisés cultivés sur du gel de collagène 3D développent de nouveaux vaisseaux sanguins qui se dilatent, un processus appelé angiogenèse germée. Ce modèle récapitule les principales caractéristiques de la formation in vivo de l’angiogenèse des vaisseaux sanguins à partir d’un réseau vasculaire préexistant, y compris la sélection des cellules de l’extrémité endothéliale, la migration et la prolifération des cellules endothéliales, le guidage cellulaire, la formation de tubes et le recrutement de cellules murales. Il se prête au criblage de médicaments et de gènes modulant l’angiogenèse et présente des similitudes avec des tests vasculaires tridimensionnels (3D) récemment décrits basés sur des technologies iPSC humaines.
Introduction
Au cours des trois dernières décennies, la découverte de médicaments basée sur la cible (TDD) a été largement utilisée dans la découverte de médicaments par l’industrie pharmaceutique. La DJT incorpore une cible moléculaire définie jouant un rôle important dans une maladie et repose sur le développement de systèmes de culture cellulaire relativement simples et de lectures pour le dépistage de médicaments1. La plupart des modèles de maladies typiques utilisés dans les programmes de TDD comprennent des méthodes traditionnelles de culture cellulaire telles que les cellules cancéreuses ou les lignées cellulaires immortalisées cultivées dans des environnements artificiels et des substrats non physiologiques. Bien que bon nombre de ces modèles aient fourni des outils viables pour identifier les médicaments candidats efficaces, l’utilisation de tels systèmes peut être discutable en raison de leur faible pertinence pour la maladie2.
Pour la plupart des maladies, les mécanismes sous-jacents sont en effet complexes et divers types de cellules, des voies de signalisation indépendantes et de multiples ensembles de gènes contribuent souvent à un phénotype de maladie spécifique. Cela est également vrai pour les maladies héréditaires dont la cause principale est une mutation dans un seul gène. Avec l’avènement récent des technologies de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (CSPi) et des outils d’édition de gènes, il est maintenant possible de générer des organoïdes 3D et des modèles de maladies d’organes sur puce qui pourraient mieux récapituler la complexité humaine in vivo 3,4. Le développement de telles technologies est associé à un regain d’intérêt pour les programmes de découverte de médicaments phénotypiques (TED)1. Les TED peuvent être comparés au dépistage empirique, car ils ne reposent pas sur la connaissance de l’identité d’une cible médicamenteuse spécifique ou sur une hypothèse sur son rôle dans la maladie. L’approche PDD est maintenant de plus en plus reconnue comme contribuant fortement à la découverte de médicaments first-in-class5. Étant donné que le développement des technologies organoïdes et d’organes sur puce humains en est encore à ses balbutiements, on s’attend à ce que les modèles iPSC (complétés par des outils novateurs d’imagerie et d’apprentissage automatique6,7) fournissent, dans un proche avenir, de multiples nouveaux modèles de maladies complexes à base de cellules pour le dépistage de médicaments et les programmes de TED associés afin de surmonter la faible productivité de l’approche TDD8, 9.
Bien que les modèles organoïdes humains et d’organes sur puce puissent fournir des informations importantes sur la complexité de la maladie et l’identification de nouveaux médicaments, l’introduction de médicaments dans de nouvelles pratiques cliniques repose également fortement sur les données de modèles animaux pour évaluer leur efficacité et leur innocuité. Parmi eux, les souris génétiquement modifiées sont certainement les modèles de mammifères les plus préférés. Ils présentent de nombreux avantages car ils ont un temps de génération relativement court pour les mammifères, ont de nombreux phénotypes similaires aux maladies humaines et peuvent être facilement manipulés génétiquement. Ils sont donc largement utilisés dans les programmes de découverte de médicaments10. Cependant, combler le fossé entre les souris et les humains reste un défi important11. Le développement de modèles murins in vitro équivalents aux modèles organoïdes humains et aux modèles d’organes sur puce pourrait au moins partiellement combler cette lacune, car il permettra des comparaisons directes de l’efficacité et de l’innocuité des médicaments entre les données in vivo de souris et les données humaines in vitro.
Ici, un test de germination vasculaire dans les corps embryoïdes de souris (EB) est décrit. Les vaisseaux sanguins sont composés de cellules endothéliales (paroi interne des parois des vaisseaux), de cellules murales (cellules musculaires lisses vasculaires et péricytes)12. Ce protocole est basé sur la différenciation des cellules souches embryonnaires de souris (CSEm) en EB vascularisés à l’aide de gouttelettes suspendues qui récapitulent la différenciation de novo des cellules endothéliales et des cellules murales13,14. Les CSE de souris peuvent être facilement établies en culture à partir de blastocystes de souris isolés du jour 3.5 ayant des antécédents génétiques différents15. Ils offrent également des possibilités d’analyse clonale, de traçage de lignée et peuvent être facilement manipulés génétiquement pour générer des modèles de maladie13,16.
Comme les vaisseaux sanguins nourrissent tous les organes, il n’est pas surprenant que de nombreuses maladies, sinon toutes, soient associées à des changements dans la microvascularisation. Dans des conditions pathologiques, les cellules endothéliales peuvent adopter un état activé ou devenir dysfonctionnelles, entraînant la mort des cellules murales ou la migration loin des vaisseaux sanguins. Ceux-ci peuvent entraîner une angiogenèse excessive ou une raréfaction des vaisseaux, peuvent induire un flux sanguin anormal et une barrière vasculaire défectueuse conduisant à une extravasation des cellules immunitaires et à une inflammation12,17,18,19. La recherche pour le développement de médicaments modulant les vaisseaux sanguins est donc élevée, et de multiples acteurs moléculaires et concepts ont déjà été identifiés pour le ciblage thérapeutique. Dans ce contexte, le protocole décrit est particulièrement adapté à la construction de modèles de maladies et aux tests de médicaments, car il récapitule les principales caractéristiques de l’angiogenèse in vivo, notamment la sélection des cellules de l’extrémité endothéliale et de la tige, la migration et la prolifération des cellules endothéliales, le guidage des cellules endothéliales, la formation de tubes et le recrutement de cellules murales. Il présente également des similitudes avec les tests vasculaires 3D récemment décrits basés sur les technologies iPSC humaines20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit un test de germination vasculaire 3D basé sur EB en 3D impartial, robuste et reproductible, qui se prête au criblage de médicaments et de gènes modulant l’angiogenèse. Cette méthode offre des avantages par rapport à de nombreux tests bidimensionnels (2D) largement utilisés utilisant des cultures de cellules endothéliales telles que les cellules endothéliales veineuses ombilicales humaines (HUVEC) pour surveiller la migration (test de rayures latérales ou le test de chambre de Boyden)22,2…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions de la Nederlandse organisatie voor gezondheidsonderzoek en zorginnovatie (ZonMW 446002501), Health Holland (LSHM19057-H040), du Leading Fellows Programme Marie Skłodowska-Curie COFUND et de l’Association Maladie de Rendu-Osler (AMRO).
Materials
| 2-mercaptoethanol | Milipore, Merck | 805740 | Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling |
| Agar Noble | Difco, BD Pharmigen | 214220 | |
| Alexa Fluo 555 goat anti rat IgG | Life technologies | A21434 | |
| APC conjugated rat anti-mouse PECAM-1 antibody (clone MEC13.3) | BD Biosciences | 551262 | |
| APC Rat IgG2a κ Isotype Control (Clone R35-95) | BD Biosciences | 553932 | |
| Axiovert 25 inverted phase contrast tissue culture microscope | ZEISS | ||
| Basic Fibroblast Growth Factor-2 (bFGF) | Peprotech | 450-33 | |
| Benchtop Centrifuge, Allegra X-15R | Beckman Coulter | 392932 | |
| Biosafety cabinet BioVanguard (Green Line) | Telstar | 133H401001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Cell counting chamber, Buerker, 0.100mm | Marienfeld | 640211 | |
| Cell culture dishes 60 x 15mm | Corning | 353802 | |
| Cell culture dishes, 35 x 10 mm | Corning | 353801 | |
| Cell culture plates 12-well | Corning | 3512 | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Biorad | 1855196 | |
| Chicken serum | Sigma-Aldrich | C5405 | |
| CHIR-99021 (CT99021) HCl | Selleckchem | S2924 | |
| Collagen I, High Concentration, Rat Tail, 100mg | Corning | 354249 | |
| Collagenase A | Roche | 10103586001 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope, TCS SP5 | Leica | ||
| Cover glasses, 24 × 50 mm | Vwr | 631-0146 | |
| DAPT γ‑secretase inhibitor | Sigma Aldrich | D5942 | |
| DC101 anti mouse VEGFR-2 Clone | BioXcell | BP0060 | |
| DC101 isotype rat IgG1 | BioXcell | BP0290 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438-5X | Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling |
| DPBS (10x), no calcium, no magnesium | Gibco, Thermofisher scientific | 14200067 | |
| EDTA 40 mM | Gibco, Thermofisher scientific | 15575-038 | |
| Embryonic stem-cell Fetal Bovine Serum | Gibco, Thermofisher scientific | 16141-079 | Should be lot-tested for maximum ES cell viability and growth. Heat inactivate at 60°C and store at −20 °C for up to 1 year |
| Eppendorf Microcentrifuge 5415R | Eppendorf AG | Z605212 | |
| Erythropoietin, human (hEPO), 250 U (2.5 µg) (1 mL) | Roche | 11120166001 | |
| ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein (10⁷ units 1 mL) | Milipore, Merck | ESG1107 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Falcon tubes 50 mL | Greiner Bio-0ne | 227270 | |
| Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P-200 | Greiner Bio-One | 739288 | |
| Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P10 | Greiner Bio-One | 771288 | |
| Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P1000 | Greiner Bio-One | 740288 | |
| FITC conjugated anti-α Smooth Muscle Actin (SMA) (clone 1A4) | Sigma Aldrich | F3777 | |
| FITC conjugated rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103107 | |
| FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody (clone RTK4530) | Biolegend | 400605 | |
| Fluorscent mounting media | DAKO | S3023 | |
| Gascompress | Cutisoft | 45846 | |
| Gauze Cutisoft 10 x 10 cm | Bsn Medical | 45844_00 | |
| Gel blotting paper, Grade GB003 | Whatman | WHA10547922 | |
| Gelatin solution, type B | Sigma-Aldrich | G1393-100 ml | |
| Glasgow's MEM (GMEM) | Gibco, Thermofisher scientific | 21710082 | |
| IHC Zinc Fixative | BD Pharmigen | 550523 | |
| IncuSafe CO2 Incubator | PHCBi | MCO-170AICUV-PE | |
| Interleukin-6, human (hIL-6) | Roche | 11138600001 | |
| L-Glutamine 200 mM | Gibco, Thermofisher scientific | 25030-024 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco, Thermofisher scientific | 11140035 | |
| Microscope slide box | Kartell Labware | 278 | |
| Microscope slide, Starfrost | Knittel glass | VS113711FKB.0 | |
| Mm_Cdh5_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00110467 | |
| Mm_Eng_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00148981 | |
| Mm_Epha4_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00093576 | |
| Mm_Ephb2_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00154014 | |
| Mm_Flt1_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00096292 | |
| Mm_Flt4_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00099064 | |
| Mm_Gapdh_3_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT01658692 | |
| Mm_Kdr_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00097020 | |
| Mm_Notch1_1_SG QuantiTect Primer | Qiagen | QT00156982 | |
| Mm_Nr2f2_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00153104 | |
| Mm_Pecam1_1_SG QuantiTect Primer | Qiagen | QT01052044 | |
| Mm_Tek_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00114576 | |
| Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts (2 M) | Gibco, Thermofisher scientific | A24903 | Store vials in liquid nitrogen (195.79 °C) indefinitely |
| Mouse embryonic stem cell line 7AC5/EYFP (ATCC SCRC-1033) | ATCC | SCRC-1033 | Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Hadjantonakis, A. K., et al. Mechanisms of Development. 76 (1–2), 79–90 (1998)]. |
| Mouse embryonic stem cell lines Acvrl1 +/- and Acvrl1 +/+ | Generated at Leiden University Medical Centre [Thalgott, J.H. et al. Circulation. 138 (23), 2698–2712 (2018)]. | ||
| Mouse embryonic stem cells line E14 | Provided by M Letarte laboratory and generated according to Cho, S. K., et al. Blood. 98 (13), 3635–3642 (2001). | ||
| Mouse embryonic stem cells line R1 (ATCC SCRC-1011) | ATCC | SCRC-1011 | Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Nagy, A., et al. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8424–8428 (1993)]. |
| Mouse embryonic stem cells line Z/Red (strain 129/Ola) | Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada [Vintersten, K., et al. Genesis. 40 (4), 241–246 (2004)]. | ||
| NanoDrop 1000 UV/VIS Spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific | ND-1000 | |
| PD0325901 | Selleckchem | S1036 | |
| PDGF-BB, Recombinant Human | Peprotech | 100-14B | |
| Pecam-1 antibody, Rat Anti-Mouse | BD Biosciences | 550274 | |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco, Thermofisher scientific | 15140122 | |
| Petri dish, PS, 94/16 mm, standard ,with vents, sterile | Greiner Bio-One | 633181 | |
| Pipetboy acu 2 | Integra-Biosciences | 155 019 | |
| Pipetman G Multichannel P8 x 200G | Gilson | F144072 | |
| Pipetman G Starter Kit, 4 Pipette Kit, P2G, P20G, P200G, P1000G | Gilson | F167360 | |
| Recombinant Human BMP-4 Protein | R&D Systems | 314-BP | |
| RNeasy Plus mini Kit | QIAGEN | 74134 | |
| Serological pipettes, 10 mL | Greiner Bio-One | 607 180 | |
| Serological pipettes, 25 mL | Greiner Bio-One | 760 180 | |
| Serological pipettes, 5 mL | Greiner Bio-One | 606 180 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Merck | 106498 | |
| Sodium pyruvate 100 mM | Gibco, Thermofisher scientific | 11360039 | |
| Test tubes 5ml round-bottom with cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
| Thermal cycler, T100 | Biorad | 1861096 | |
| Triton X-100 (BioXtra) | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco, Thermofisher scientific | 15250061 | |
| Trypsin (2.5%) | Gibco, Thermofisher scientific | 15090046 | |
| Vacuum Filter/Storage Bottle System, 500 mL | Corning | 430758 | |
| VEGFA165 , recombinant murine | Peprotech | 450-32 | |
| Water, Sterile | Fresenius-Kabi | B230531 | |
| Waterbath, Lab-Line Digital | Thermo Fischer Scientific | 18052A |
References
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