Denna analys använder musembryonala stamceller differentierade i embryoidkroppar odlade i 3D-kollagengel för att analysera de biologiska processerna som styr spirande angiogenes in vitro. Tekniken kan användas för att testa läkemedel, modellera sjukdomar och för att studera specifika gener i samband med deletioner som är embryoniskt dödliga.
De senaste framstegen inom inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) och genredigeringsteknik möjliggör utveckling av nya humana cellbaserade sjukdomsmodeller för fenotypiska läkemedelsupptäcktsprogram (PDD). Även om dessa nya produkter skulle kunna förutsäga säkerheten och effekten av prövningsläkemedel hos människor mer exakt, är deras utveckling till kliniken fortfarande starkt beroende av däggdjursdata, särskilt användningen av mussjukdomsmodeller. Parallellt med humana organoid- eller organ-på-chip-sjukdomsmodeller är utvecklingen av relevanta in vitro-musmodeller därför ett ouppfyllt behov av att utvärdera direkta läkemedelseffektivitets- och säkerhetsjämförelser mellan arter och in vivo– och in vitro-förhållanden. Här beskrivs en vaskulär groddanalys som använder musembryonala stamceller differentierade i embryoidkroppar (EB). Vaskulariserade EBs odlade på 3D-kollagengel utvecklar nya blodkärl som expanderar, en process som kallas spirande angiogenes. Denna modell rekapitulerar viktiga funktioner i in vivo spirande angiogenesbildning av blodkärl från ett befintligt vaskulärt nätverk – inklusive endotelspetscellval, endotelcellmigration och proliferation, cellvägledning, rörbildning och väggcellsrekrytering. Det är mottagligt för screening för läkemedel och gener som modulerar angiogenes och visar likheter med nyligen beskrivna tredimensionella (3D) vaskulära analyser baserade på human iPSC-teknik.
Under de senaste tre decennierna har målbaserad läkemedelsupptäckt (TDD) använts i stor utsträckning vid läkemedelsupptäckt av läkemedelsindustrin. TDD innehåller ett definierat molekylärt mål som spelar en viktig roll i en sjukdom och bygger på utvecklingen av relativt enkla cellodlingssystem och avläsningar för läkemedelsscreening1. De flesta typiska sjukdomsmodeller som används i TDD-program inkluderar traditionella cellodlingsmetoder som cancerceller eller odödliga cellinjer odlade inom konstgjorda miljöer och icke-fysiologiska substrat. Även om många av dessa modeller har gett livskraftiga verktyg för att identifiera framgångsrika läkemedelskandidater, kan användningen av sådana system vara tveksam på grund av deras dåliga sjukdomsrelevans2.
För de flesta sjukdomar är de underliggande mekanismerna verkligen komplexa och olika celltyper, oberoende signalvägar och flera uppsättningar gener visar sig ofta bidra till en specifik sjukdomsfenotyp. Detta gäller även för ärftliga sjukdomar där den primära orsaken är en mutation i en enda gen. Med den senaste tillkomsten av humaninducerad pluripotent stamcellsteknik (iPSC) och genredigeringsverktyg är det nu möjligt att generera 3D-organoider och organ-on-chip-sjukdomsmodeller som bättre kan rekapitulera in vivo mänsklig komplexitet 3,4. Utvecklingen av sådan teknik är förknippad med ett återupplivat intresse för fenotypiska läkemedelsupptäcktsprogram (PDD)1. PDD kan jämföras med empirisk screening, eftersom de inte förlitar sig på kunskap om identiteten hos ett specifikt läkemedelsmål eller en hypotes om dess roll i sjukdom. PDD-metoden erkänns nu alltmer för att starkt bidra till upptäckten av förstklassiga läkemedel5. Eftersom utvecklingen av human organoid- och organ-on-chip-teknik fortfarande är i sin linda förväntas iPSC-modeller (kompletterade med innovativa bild- och maskininlärningsverktyg6,7) inom en snar framtid tillhandahålla flera nya komplexa cellbaserade sjukdomsmodeller för läkemedelsscreening och tillhörande PDD-program för att övervinna den dåliga produktiviteten hos TDD-metoden8, 9.
Medan humana organoid- och organ-on-chip-modeller kan ge viktiga insikter om sjukdomskomplexitet och identifiering av nya läkemedel, är läkemedelsföring i ny klinisk praxis också starkt beroende av data från djurmodeller för att bedöma deras effektivitet och säkerhet. Bland dem är genetiskt modifierade möss verkligen de mest föredragna däggdjursmodellerna. De har många fördelar eftersom de har en relativt kort generationstid för däggdjur, har många liknande fenotyper som mänskliga sjukdomar och lätt kan manipuleras genetiskt. De används därför i stor utsträckning i program för läkemedelsupptäckt10. Att överbrygga klyftan mellan möss och människor är dock fortfarande en viktig utmaning11. Utvecklingen av in vitro-musmodeller som motsvarar humana organoid- och organ-on-chip-modeller skulle åtminstone delvis kunna fylla denna lucka, eftersom det kommer att möjliggöra direkta jämförelser av läkemedelseffektivitet och säkerhet mellan in vivo-data från möss och in vitro-data från människa.
Här beskrivs en vaskulär groddanalys i musembryoidkroppar (EB). Blodkärl består av endotelceller (inre beklädnad av kärlväggar), väggmålningar (vaskulära glattmuskelceller och pericyter)12. Detta protokoll är baserat på differentiering av musembryonala stamceller (mESC) till vaskulariserade EB med hjälp av hängande droppar som rekapitulerar de novo endotelcell- och väggcellsdifferentiering13,14. Mus ESC kan lätt etableras i kultur från isolerad dag 3.5 musblastocyster med olika genetisk bakgrund15. De ger också möjligheter till klonanalys, härstamningsspårning och kan enkelt manipuleras genetiskt för att generera sjukdomsmodeller13,16.
Eftersom blodkärlen ger näring åt alla organ är det inte förvånande att många sjukdomar, om inte alla, är förknippade med förändringar i mikrovaskulaturen. Vid patologiska tillstånd kan endotelceller anta ett aktiverat tillstånd eller kan bli dysfunktionellt vilket resulterar i väggcellsdöd eller migration bort från blodkärlen. Dessa kan resultera i överdriven angiogenes eller i kärlsällsynthet, kan inducera onormalt blodflöde och defekt blodkärlsbarriär som leder till extravasering av immunceller och inflammation12,17,18,19. Forskningen för utveckling av läkemedel som modulerar blodkärl är därför hög, och flera molekylära aktörer och koncept har redan identifierats för terapeutisk inriktning. I detta sammanhang är det beskrivna protokollet särskilt lämpligt för att bygga sjukdomsmodeller och för läkemedelstestning eftersom det rekapitulerar viktiga egenskaper hos in vivo-spirande angiogenes, inklusive endotelspets och stjälkcellsval, endotelcellsmigration och proliferation, endotelcellsvägledning, rörbildning och väggcellsrekrytering. Det visar också likheter med nyligen beskrivna 3D-vaskulära analyser baserade på human iPSC-teknik20.
Detta protokoll beskriver en opartisk, robust och reproducerbar 3D EB-baserad vaskulär groddanalys som är mottaglig för screening för läkemedel och gener som modulerar angiogenes. Denna metod erbjuder fördelar jämfört med många allmänt använda tvådimensionella (2D) analyser som använder endotelcellkulturer såsom humana navelvenendotelceller (HUVEC) för att övervaka migration (lateral scratch assay eller Boyden chamber assay)22,23 eller proliferation (räkning av cellanta…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av bidrag från Nederlandse organisatie voor gezondheidsonderzoek en zorginnovatie (ZonMW 446002501), Health Holland (LSHM19057-H040), Leading Fellows Programme Marie Skłodowska-Curie COFUND och av Association Maladie de Rendu-Osler (AMRO).
2-mercaptoethanol | Milipore, Merck | 805740 | Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling |
Agar Noble | Difco, BD Pharmigen | 214220 | |
Alexa Fluo 555 goat anti rat IgG | Life technologies | A21434 | |
APC conjugated rat anti-mouse PECAM-1 antibody (clone MEC13.3) | BD Biosciences | 551262 | |
APC Rat IgG2a κ Isotype Control (Clone R35-95) | BD Biosciences | 553932 | |
Axiovert 25 inverted phase contrast tissue culture microscope | ZEISS | ||
Basic Fibroblast Growth Factor-2 (bFGF) | Peprotech | 450-33 | |
Benchtop Centrifuge, Allegra X-15R | Beckman Coulter | 392932 | |
Biosafety cabinet BioVanguard (Green Line) | Telstar | 133H401001 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
Cell counting chamber, Buerker, 0.100mm | Marienfeld | 640211 | |
Cell culture dishes 60 x 15mm | Corning | 353802 | |
Cell culture dishes, 35 x 10 mm | Corning | 353801 | |
Cell culture plates 12-well | Corning | 3512 | |
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Biorad | 1855196 | |
Chicken serum | Sigma-Aldrich | C5405 | |
CHIR-99021 (CT99021) HCl | Selleckchem | S2924 | |
Collagen I, High Concentration, Rat Tail, 100mg | Corning | 354249 | |
Collagenase A | Roche | 10103586001 | |
Confocal Laser Scanning Microscope, TCS SP5 | Leica | ||
Cover glasses, 24 × 50 mm | Vwr | 631-0146 | |
DAPT γ‑secretase inhibitor | Sigma Aldrich | D5942 | |
DC101 anti mouse VEGFR-2 Clone | BioXcell | BP0060 | |
DC101 isotype rat IgG1 | BioXcell | BP0290 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438-5X | Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling |
DPBS (10x), no calcium, no magnesium | Gibco, Thermofisher scientific | 14200067 | |
EDTA 40 mM | Gibco, Thermofisher scientific | 15575-038 | |
Embryonic stem-cell Fetal Bovine Serum | Gibco, Thermofisher scientific | 16141-079 | Should be lot-tested for maximum ES cell viability and growth. Heat inactivate at 60°C and store at −20 °C for up to 1 year |
Eppendorf Microcentrifuge 5415R | Eppendorf AG | Z605212 | |
Erythropoietin, human (hEPO), 250 U (2.5 µg) (1 mL) | Roche | 11120166001 | |
ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein (10⁷ units 1 mL) | Milipore, Merck | ESG1107 | |
Falcon tubes 15 mL | Greiner Bio-One | 188271 | |
Falcon tubes 50 mL | Greiner Bio-0ne | 227270 | |
Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P-200 | Greiner Bio-One | 739288 | |
Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P10 | Greiner Bio-One | 771288 | |
Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P1000 | Greiner Bio-One | 740288 | |
FITC conjugated anti-α Smooth Muscle Actin (SMA) (clone 1A4) | Sigma Aldrich | F3777 | |
FITC conjugated rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103107 | |
FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody (clone RTK4530) | Biolegend | 400605 | |
Fluorscent mounting media | DAKO | S3023 | |
Gascompress | Cutisoft | 45846 | |
Gauze Cutisoft 10 x 10 cm | Bsn Medical | 45844_00 | |
Gel blotting paper, Grade GB003 | Whatman | WHA10547922 | |
Gelatin solution, type B | Sigma-Aldrich | G1393-100 ml | |
Glasgow's MEM (GMEM) | Gibco, Thermofisher scientific | 21710082 | |
IHC Zinc Fixative | BD Pharmigen | 550523 | |
IncuSafe CO2 Incubator | PHCBi | MCO-170AICUV-PE | |
Interleukin-6, human (hIL-6) | Roche | 11138600001 | |
L-Glutamine 200 mM | Gibco, Thermofisher scientific | 25030-024 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco, Thermofisher scientific | 11140035 | |
Microscope slide box | Kartell Labware | 278 | |
Microscope slide, Starfrost | Knittel glass | VS113711FKB.0 | |
Mm_Cdh5_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00110467 | |
Mm_Eng_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00148981 | |
Mm_Epha4_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00093576 | |
Mm_Ephb2_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00154014 | |
Mm_Flt1_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00096292 | |
Mm_Flt4_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00099064 | |
Mm_Gapdh_3_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT01658692 | |
Mm_Kdr_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00097020 | |
Mm_Notch1_1_SG QuantiTect Primer | Qiagen | QT00156982 | |
Mm_Nr2f2_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00153104 | |
Mm_Pecam1_1_SG QuantiTect Primer | Qiagen | QT01052044 | |
Mm_Tek_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00114576 | |
Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts (2 M) | Gibco, Thermofisher scientific | A24903 | Store vials in liquid nitrogen (195.79 °C) indefinitely |
Mouse embryonic stem cell line 7AC5/EYFP (ATCC SCRC-1033) | ATCC | SCRC-1033 | Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Hadjantonakis, A. K., et al. Mechanisms of Development. 76 (1–2), 79–90 (1998)]. |
Mouse embryonic stem cell lines Acvrl1 +/- and Acvrl1 +/+ | Generated at Leiden University Medical Centre [Thalgott, J.H. et al. Circulation. 138 (23), 2698–2712 (2018)]. | ||
Mouse embryonic stem cells line E14 | Provided by M Letarte laboratory and generated according to Cho, S. K., et al. Blood. 98 (13), 3635–3642 (2001). | ||
Mouse embryonic stem cells line R1 (ATCC SCRC-1011) | ATCC | SCRC-1011 | Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Nagy, A., et al. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8424–8428 (1993)]. |
Mouse embryonic stem cells line Z/Red (strain 129/Ola) | Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada [Vintersten, K., et al. Genesis. 40 (4), 241–246 (2004)]. | ||
NanoDrop 1000 UV/VIS Spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific | ND-1000 | |
PD0325901 | Selleckchem | S1036 | |
PDGF-BB, Recombinant Human | Peprotech | 100-14B | |
Pecam-1 antibody, Rat Anti-Mouse | BD Biosciences | 550274 | |
Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco, Thermofisher scientific | 15140122 | |
Petri dish, PS, 94/16 mm, standard ,with vents, sterile | Greiner Bio-One | 633181 | |
Pipetboy acu 2 | Integra-Biosciences | 155 019 | |
Pipetman G Multichannel P8 x 200G | Gilson | F144072 | |
Pipetman G Starter Kit, 4 Pipette Kit, P2G, P20G, P200G, P1000G | Gilson | F167360 | |
Recombinant Human BMP-4 Protein | R&D Systems | 314-BP | |
RNeasy Plus mini Kit | QIAGEN | 74134 | |
Serological pipettes, 10 mL | Greiner Bio-One | 607 180 | |
Serological pipettes, 25 mL | Greiner Bio-One | 760 180 | |
Serological pipettes, 5 mL | Greiner Bio-One | 606 180 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Merck | 106498 | |
Sodium pyruvate 100 mM | Gibco, Thermofisher scientific | 11360039 | |
Test tubes 5ml round-bottom with cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
Thermal cycler, T100 | Biorad | 1861096 | |
Triton X-100 (BioXtra) | Sigma Aldrich | T9284 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco, Thermofisher scientific | 15250061 | |
Trypsin (2.5%) | Gibco, Thermofisher scientific | 15090046 | |
Vacuum Filter/Storage Bottle System, 500 mL | Corning | 430758 | |
VEGFA165 , recombinant murine | Peprotech | 450-32 | |
Water, Sterile | Fresenius-Kabi | B230531 | |
Waterbath, Lab-Line Digital | Thermo Fischer Scientific | 18052A |