Gebruik van in vivo postnatale elektroporatie om cerebellaire korrelneuronmorfologie en synapsontwikkeling te bestuderen
Summary
Hier beschrijven we een methode om synaptogenese van korrelneuronen in het cerebellum van de muis te visualiseren gedurende het tijdsverloop van de postnatale hersenontwikkeling wanneer deze cellen hun synaptische structuren verfijnen en synapsen vormen om zichzelf te integreren in het algehele hersencircuit.
Abstract
Neuronen ondergaan dynamische veranderingen in hun structuur en functie tijdens de ontwikkeling van de hersenen om geschikte verbindingen met andere cellen te vormen. Het cerebellum van knaagdieren is een ideaal systeem om de ontwikkeling en morfogenese van een enkel celtype, het cerebellaire granulaatneuron (CGN), in de loop van de tijd te volgen. Hier werd in vivo elektroporatie van voorlopers van korrelneuronen in het zich ontwikkelende cerebellum van de muis gebruikt om cellen spaarzaam te labelen voor latere morfologische analyses. De werkzaamheid van deze techniek wordt aangetoond in zijn vermogen om belangrijke ontwikkelingsstadia van CGN-rijping te laten zien, met een specifieke focus op de vorming van dendritische klauwen, gespecialiseerde structuren waar deze cellen het grootste deel van hun synaptische inputs ontvangen. Naast het verstrekken van snapshots van CGN-synaptische structuren tijdens de cerebellaire ontwikkeling, kan deze techniek worden aangepast om granulaatneuronen genetisch te manipuleren op een celautonome manier om de rol van elk interessant gen en het effect ervan op CGN-morfologie, klauwontwikkeling en synaptogenese te bestuderen.
Introduction
Hersenontwikkeling is een langdurig proces dat zich uitstrekt van embryogenese tot postnataal leven. Gedurende deze tijd integreren de hersenen een combinatie van intrinsieke en extrinsieke stimuli die de bedrading van synapsen tussen dendrieten en axonen vormen om uiteindelijk gedrag te sturen. Het cerebellum van knaagdieren is een ideaal modelsysteem om te bestuderen hoe synapsen zich ontwikkelen, omdat de ontwikkeling van een enkel neurontype, het cerebellaire granulaatneuron (CGN), kan worden gevolgd terwijl het overgaat van een voorlopercel naar een volwassen neuron. Dit is deels te wijten aan het feit dat een meerderheid van de cerebellaire cortex zich postnataal ontwikkelt, wat eenvoudige genetische manipulatie en cellabeling na de geboorte mogelijk maakt1.
Bij zoogdieren begint CGN-differentiatie aan het einde van de embryonale ontwikkeling wanneer een subset van proliferatieve cellen in de achterhersenen over de ruitvormige lip migreert om een secundaire kiemzone op het oppervlak van het cerebellum 2,3,4 te vormen. Hoewel ze volledig toegewijd zijn aan een korrelneuron voorloper (GNP) identiteit, blijven deze cellen zich vermenigvuldigen in het buitenste deel van de externe korrellaag (EGL) tot postnatale dag 14 (P14). Proliferatie van deze laag resulteert in een enorme uitbreiding van het cerebellum omdat deze cellen uitsluitend aanleiding geven tot CGN’s5. Zodra pasgeboren CGN’s de celcyclus in de EGL verlaten, migreren ze naar binnen naar de interne korrellaag (IGL), waarbij ze een axon achterlaten dat zich splitst en reist in de moleculaire laag van het cerebellum, waarbij parallelle vezels worden gevormd die synapseren op Purkinje-cellen6. De positie van deze vezels in de moleculaire laag is afhankelijk van de timing van de uitgang van de celcyclus.
CGN’s die differentiëren verlaten eerst hun parallelle vezels naar de onderkant van de moleculaire laag, terwijl de axonen van CGN’s die later differentiëren geclusterd zijn op de bovenste 7,8. Zodra de CGN-cellichamen de IGL bereiken, beginnen ze dendrieten uit te werken en synapsen te vormen met nabijgelegen remmende en exciterende neuronen. De volwassen dendritische boom van een CGN vertoont een stereotiepe architectuur met vier hoofdprocessen. In de loop van de CGN-rijping vormen de structuren aan het einde van deze dendrieten een klauw die verrijkt wordt met postsynaptische eiwitten 9,10. Deze gespecialiseerde structuren, dendritische klauwen genoemd, bevatten de meerderheid van de synapsen op korrelneuronen en zijn belangrijk voor het ontvangen van zowel exciterende inputs van mosachtige vezelinnervaties afkomstig van de pons, als remmende inputs van lokale Golgi-cellen. Eenmaal volledig geconfigureerd, stellen de synaptische verbindingen van CGN’s deze cellen in staat om inputs van pre-cerebellaire kernen door te geven aan Purkinje-cellen, die vanuit de cerebellaire cortex naar de diepe cerebellaire kernen projecteren.
In vivo postnatale elektroporatie van BNP’s is voordelig ten opzichte van andere op etikettering gebaseerde methoden, zoals virale infectie en generatie van transgene muislijnen, omdat de expressie van gewenste constructies op een snelle tijdlijn kan worden bereikt en de methode zich richt op een kleine populatie cellen, nuttig bij het bestuderen van celautonome effecten. Deze methode is in eerdere studies gebruikt om de morfologische ontwikkeling van CGN’s te bestuderen; Deze studies hebben zich echter gericht op een enkel tijdstip of een kort tijdvenster 9,10,11,12,13. Deze etiketteringsmethode werd gecombineerd met beeldanalyse om de veranderingen in CGN-morfologie te documenteren die optreden gedurende het gehele tijdsverloop van CGN-differentiatie gedurende de eerste drie weken van het postnatale leven. Deze gegevens onthullen de dynamiek van CGN-dendrietontwikkeling die ten grondslag ligt aan de constructie van cerebellaire circuits.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cerebellaire korrelneuronen zijn de meest voorkomende neuronen in het zoogdierbrein, die bijna 60-70% uitmaken van de totale neuronenpopulatie in het knaagdierbrein 1,14. Het cerebellum is op grote schaal gebruikt om mechanismen van cellulaire proliferatie, migratie, dendrietvorming en synapsontwikkeling op te helderen 6,9,10,11,15,16,17,18,19,20 <sup class="x…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het werk werd ondersteund door NIH-subsidies R01NS098804 (A.E.W.), F31NS113394 (U.C.) en Duke University’s Summer Neuroscience Program (D.G.).
Materials
| Betadine | Purdue Production | 67618-150-17 | |
| Cemented 10 µL needle | Hamilton | 1701SN (80008) | 33 gauge, 1.27 cm (0.5 in), 4 point style |
| Chicken anti-GFP | Millipore Sigma | AB16901 | Our lab uses this antibody at a 1:1000 concentration |
| Cotton-tip applicator | |||
| Donkey anti-chicken Cy2 | Jackson ImmunoResearch | 703-225-155 | Our lab uses this antibody at a 1:500 concentration |
| Ethanol (200 proof) | Koptec | V1016 | |
| Electroporator ECM 830 | BTX Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Fast Green FCF | Sigma | F7252-5G | |
| FUGW plasmid | Addgene | 14883 | |
| Glass slides | VWR | 48311-703 | Superfrost plus |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Heating pad | Softheat | ||
| Hoescht 33342 fluorescent dye | Invitrogen | 62249 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Micro cover glass | VWR | 48382-138 | |
| Nail polish | Sally Hansen | Color 109 | |
| Normal goat serum | Gibco | 16210064 | |
| O.C.T. embedding compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Olympus MVX10 Dissecting Scope | Olympus | MVX10 | |
| P200 pipette reach tip | Fisherbrand | 02-707-138 | Used for needle spacer |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PBS pH 7.4 (10x) | Gibco | 70011-044 | |
| Simple Neurite Tracer | FIJI | https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer:_Basic_ Instructions |
|
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Surgical tools | RWD Life Science | Small scissors and tweezers | |
| Triton X-100 | Roche | 11332481001 | non-ionic detergent |
| Tweezertrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0489 | 5 mm, platinum plated tweezer-type electrodes |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Vectashield mounting media | Vectashield | H1000 | |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | |
| Zeiss 780 Upright Confocal | Zeiss | 780 |
References
- Altman, J., Bayer, S. A. . Development of the cerebellar system : in relation to its evolution, structure, and functions. , (1997).
- Rahimi-Balaei, M., Bergen, H., Kong, J., Marzban, H. Neuronal migration during development of the cerebellum. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 484 (2018).
- Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. Embryonic precursor cells from the rhombic lip are specified to a cerebellar granule neuron identity. Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).
- Hatten, M. E., Heintz, N. Mechanisms of neural patterning and specification in the developing cerebellum. Annual Review of Neuroscience. 18, 385-408 (1995).
- Ben-Arie, N., et al. Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons. Nature. 390 (6656), 169-172 (1997).
- Borghesani, P. R., et al. BDNF stimulates migration of cerebellar granule cells. Development. 129 (6), 1435-1442 (2002).
- Espinosa, J. S., Luo, L. Timing neurogenesis and differentiation: insights from quantitative clonal analyses of cerebellar granule cells. Journal of Neuroscience. 28 (10), 2301-2312 (2008).
- Markwalter, K. H., Yang, Y., Holy, T. E., Bonni, A. Sensorimotor coding of vermal granule neurons in the developing mammalian cerebellum. Journal of Neuroscience. 39 (34), 6626-6643 (2019).
- Shalizi, A., et al. PIASx is a MEF2 SUMO E3 ligase that promotes postsynaptic dendritic morphogenesis. Journal of Neuroscience. 27 (37), 10037-10046 (2007).
- Shalizi, A., et al. A Calcium-regulated MEF2 sumoylation switch controls poststynaptic differentiation. Science. 311 (5763), 1012-1017 (2006).
- Konishi, Y., Stegmuller, J., Matsuda, T., Bonni, S., Bonni, A. Cdh1-APC controls axonal growth and patterning in the mammalian brain. Science. 303 (5660), 1026-1030 (2004).
- Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), e51070 (2014).
- Yang, Y., et al. Chromatin remodeling inactivates activity genes and regulates neural coding. Science. 353 (6296), 300-305 (2016).
- Herculano-Houzel, S. Coordinated scaling of cortical and cerebellar numbers of neurons. Frontiers in Neuroanatomy. 4, 12 (2010).
- Wilson, P. M., Fryer, R. H., Fang, Y., Hatten, M. E. Astn2, a novel member of the astrotactin gene family, regulates the trafficking of ASTN1 during glial-guided neuronal migration. Journal of Neuroscience. 30 (25), 8529-8540 (2010).
- Kokubo, M., et al. BDNF-mediated cerebellar granule cell development is impaired in mice null for CaMKK2 or CaMKIV. Journal of Neuroscience. 29 (28), 8901-8913 (2009).
- Schwartz, P. M., Borghesani, P. R., Levy, R. L., Pomeroy, S. L., Segal, R. A. Abnormal cerebellar development and foliation in BDNF-/- mice reveals a role for neurotrophins in CNS patterning. Neuron. 19 (2), 269-281 (1997).
- Segal, R. A., Pomeroy, S. L., Stiles, C. D. Axonal growth and fasciculation linked to differential expression of BDNF and NT3 receptors in developing cerebellar granule cells. Journal of Neuroscience. 15 (7), 4970-4981 (1995).
- Zhou, P., et al. Polarized signaling endosomes coordinate BDNF-induced chemotaxis of cerebellar precursors. Neuron. 55 (1), 53-68 (2007).
- Dhar, M., Hantman, A. W., Nishiyama, H. Developmental pattern and structural factors of dendritic survival in cerebellar granule cells in vivo. Scientific Reports. 8 (1), 17561 (2018).
- Ito, M. Synaptic plasticity in the cerebellar cortex and its role in motor learning. Canadian Journal of Neurological Sciences. 20, 70-74 (1993).
- Jorntell, H., Hansel, C. Synaptic memories upside down: bidirectional plasticity at cerebellar parallel fiber-Purkinje cell synapses. Neuron. 52 (2), 227-238 (2006).
- Nakanishi, S. Genetic manipulation study of information processing in the cerebellum. Neuroscience. 162 (3), 723-731 (2009).
- Chang, C. H., et al. Atoh1 controls primary cilia formation to allow for SHH-triggered granule neuron progenitor proliferation. Developmental Cell. 48 (2), 184-199 (2019).
