Selección de nanocuerpos inhibitorios dirigidos al transportador mediante electrofisiología basada en membrana sólida soportada (SSM)
Summary
Los nanocuerpos son herramientas importantes en biología estructural y suponen un gran potencial para el desarrollo de terapias. Sin embargo, la selección de nanocuerpos con propiedades inhibitorias puede ser un desafío. Aquí demostramos el uso de electrofisiología basada en membranas sólidas soportadas (SSM) para la clasificación de nanocuerpos inhibitorios y no inhibitorios dirigidos a transportadores de membrana electrogénicos.
Abstract
Los anticuerpos de dominio único (nanocuerpos) se han utilizado ampliamente en estudios mecanicistas y estructurales de proteínas y representan un enorme potencial como herramientas para desarrollar terapias clínicas, muchas de las cuales dependen de la inhibición de proteínas de membrana como los transportadores. Sin embargo, la mayoría de los métodos utilizados para determinar la inhibición de la actividad de transporte son difíciles de realizar en rutinas de alto rendimiento y dependen de la disponibilidad de sustratos etiquetados, lo que complica el cribado de grandes bibliotecas de nanocuerpos. La electrofisiología de membrana sólidamente soportada (SSM) es un método de alto rendimiento, utilizado para caracterizar transportadores electrogénicos y medir su cinética e inhibición de transporte. Aquí mostramos la implementación de la electrofisiología basada en SSM para seleccionar nanocuerpos inhibitorios y no inhibitorios dirigidos a un transportador secundario electrogénico y para calcular constantes inhibitorias de nanocuerpos. Esta técnica puede ser especialmente útil para seleccionar nanocuerpos inhibitorios dirigidos a transportadores para los que no se dispone de sustratos marcados.
Introduction
Los anticuerpos están compuestos por dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras que son responsables de la unión del antígeno. Los camélidos tienen anticuerpos de cadena pesada que exhiben una afinidad similar por su antígeno cognado en comparación con los anticuerpos convencionales1,2. El dominio variable único (VHH) de los anticuerpos de cadena pesada solo conserva el potencial completo de unión al antígeno y se ha demostrado que es muy estable1,2. Estas moléculas aisladas de VHH o “nanocuerpos” se han implementado en estudios relacionados con la bioquímica de proteínas de membrana como herramientas para estabilizar conformaciones3,4,como inhibidores5,6,como agentes de estabilización7,y como artilugios para la determinación deestructuras 8,9,10 . Los nanocuerpos pueden generarse mediante la inmunización de camélidos para el preenriquecimiento de células B que codifican nanocuerpos específicos del objetivo y el posterior aislamiento de las células B, seguido de la clonación de la biblioteca de nanocuerpos y la selección por pantalla defagos 11,12,13. Una forma alternativa de generar nanocuerpos se basa en métodos de selección in vitro que se basan en la construcción de bibliotecas y la selección por pantalla de fagos, pantalla de ribosomas o pantalla de levadura14,15,16, 17,18,19,20. Estos métodos in vitro requieren grandes tamaños de biblioteca, pero se benefician de evitar la inmunización animal y favorecen la selección de nanocuerpos dirigidos a proteínas con una estabilidad relativamente baja.
El pequeño tamaño de los nanocuerpos, su alta estabilidad y solubilidad, su fuerte afinidad de antígenos, su baja inmunogenicidad y su producción relativamente fácil, los convierten en fuertes candidatos para el desarrollo de terapias21,22,23. En particular, los nanocuerpos que inhiben la actividad de múltiples proteínas de membrana son activos potenciales para aplicaciones clínicas5,24,25,26. En el caso de los transportadores de membrana, para evaluar si un nanocuerpo tiene actividad inhibitoria, es necesario desarrollar un ensayo que permita la detección de sustratos transportados y/o cosustratos. Tales ensayos generalmente involucran moléculas etiquetadas o el diseño de métodos de detección específicos del sustrato, que pueden carecer de una aplicación universal. Además, la identificación de nanocuerpos inhibitorios generalmente requiere la detección de un gran número de aglutinantes. Por lo tanto, un método que se pueda utilizar en un modo de alto rendimiento y que no dependa de sustratos etiquetados es esencial para esta selección.
La electrofisiología basada en SSM es una técnica extremadamente sensible y altamente resuelta en el tiempo que permite la detección del movimiento de cargas a través de membranas (por ejemplo, unión / transporte deiones) 27,28. Esta técnica se ha aplicado para caracterizar transportadores electrogénicos, que son difíciles de estudiar utilizando otras técnicas de electrofisiología debido al relativo bajo recambio de estas proteínas29,30,31,32,33,34,35. La electrofisiología SSM no requiere el uso de sustratos etiquetados, es adecuada para el cribado de alto rendimiento y se pueden utilizar proteoliposomas o vesículas de membrana que contengan el transportador de interés. Aquí, demostramos que la electrofisiología basada en SSM se puede utilizar para clasificar nanocuerpos dirigidos al transportador con propiedades inhibitorias y no inhibitorias. Como prueba de principio, describimos la reconstitución de un transportador bacteriano de colina en liposomas, seguido de pasos detallados para la inmovilización de proteoliposomas en los sensores SSM. A continuación, describimos cómo realizar mediciones electrofisiológicas basadas en SSM del transporte de colina y cómo determinar la concentración efectiva medio máxima (EC50). Luego mostramos cómo usar la electrofisiología basada en SSM para detectar múltiples nanocuerpos e identificar inhibidores del transporte de colina. Finalmente, describimos cómo determinar las concentraciones inhibitorias medias máximas (IC50)de nanocuerpos inhibitorios seleccionados.
Protocol
Representative Results
Discussion
La técnica presentada aquí clasifica los nanocuerpos con propiedades inhibitorias y no inhibitorias dirigidas a los transportadores electrogénicos. La evaluación del transporte del sustrato es posible debido a la detección del movimiento de cargas a través del transportador incrustado en la membrana de los proteoliposomas. Algunos de los pasos críticos durante la configuración de un experimento son la reconstitución de proteínas activas en liposomas, la preparación de monocapas estables en chips SSM y la recup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Cedric A. J. Hutter y Markus A. Seeger del Instituto de Microbiología Médica de la Universidad de Zurich, y a Gonzalo Cebrero de Biozentrum de la Universidad de Basilea por su colaboración en la generación de nanocuerpos sintéticos (sybodies). Agradecemos a Maria Barthmes y Andre Bazzone de NANION Technologies por su asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional Suiza para la Ciencia (SNSF) (PP00P3_170607 y NANION Research Grant Initiative a C.P.).
Materials
| 1-octadecanethiol solution | Sigma Aldrich | O1858-25ML | |
| 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850356C-25mg | |
| Bio-Beads SM-2 Adsorbent (Polystyrene adsorbent beads) | BioRad | #152-3920 | |
| PD 10 Desalting Columns | GE Healthcare | GE17-0851-01 | |
| Filter 200 nm membrane | Whatman Nucleopore | WHA800282 | |
| 2-Propanol | Merck | 33539-1L-R | |
| n-Decane | Sigma Aldrich | 8034051000 | |
| n-dodecyl-ß-D-maltoside (DDM) | Avanti Polar Lipids | 850520P-25g | |
| Sodium Chloride | AppliChem | 131659.1211 | |
| (SSM setup) SURFE2R N1 | Nanion | —– | |
| SURFE2R N1 Single Sensor Chips | Nanion | # 161001 | |
| Trizma Base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| E. coli Polar Lipid Extract | Avanti Polar Lipids | 100600C | |
| Egg PC L-α-phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051C |
References
- Braden, B. C., Goldman, E. R., Mariuzza, R. A., Poljak, R. J. Anatomy an antibody molecule: structure, kinetics, thermodynamics, and mutational studies of the antilysozyme antibody D1.3. Immunology Reviews. 163, 45-57 (1998).
- Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
- Perez, C., et al. Structural basis of inhibition of lipid-linked oligosaccharide flippase PglK by a conformational nanobody. Science Reports. 7, 46641 (2017).
- Grahl, A., Abiko, L. A., Isogai, S., Sharpe, T., Grzesiek, S. A high-resolution description of beta1-adrenergic receptor functional dynamics and allosteric coupling from backbone NMR. Nature Communication. 11, 2216 (2020).
- Schenck, S., et al. Generation and characterization of anti-VGLUT nanobodies acting as inhibitors of transport. Biochemistry. 56, 3962-3971 (2017).
- Mireku, S. A., Sauer, M. M., Glockshuber, R., Locher, K. P. Structural basis of nanobody-mediated blocking of BtuF, the cognate substrate-binding protein of the Escherichia coli vitamin B12 transporter BtuCD. Science Reports. 7, 14296 (2017).
- Manglik, A., Kobilka, B. K., Steyaert, J. Nanobodies to study G protein-coupled receptor structure and function. Annual Reviews of Pharmacology Toxicology. 57, 19-37 (2017).
- Rasmussen, S. G., et al. Structure of a nanobody-stabilized active state of the beta(2) adrenoceptor. Nature. 469 (2), 175-180 (2011).
- Jiang, X., et al. Crystal structure of a LacY-nanobody complex in a periplasmic-open conformation. Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 113, 12420-12425 (2016).
- Geertsma, E. R., et al. Structure of a prokaryotic fumarate transporter reveals the architecture of the SLC26 family. Nature Structural Molecular Biology. 22, 803-808 (2015).
- Harmsen, M. M., De Haard, H. J. Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments. Applied Microbiology and Biotechnology. 77, 13-22 (2007).
- Pardon, E., et al. A general protocol for the generation of nanobodies for structural biology. Nature Protocols. 9, 674-693 (2014).
- Nguyen, V. K., Desmyter, A., Muyldermans, S. Functional heavy-chain antibodies in Camelidae. Advances in Immunology. 79, 261-296 (2001).
- Zimmermann, I., et al. Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins. Elife. 7, 34317 (2018).
- McMahon, C., et al. Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies. Nature Structural Molecular Biology. 25, 289-296 (2018).
- Olichon, A., de Marco, A. Preparation of a naive library of camelid single domain antibodies. Methods in Molecular Biology. 911, 65-78 (2012).
- Moutel, S., et al. NaLi-H1: A universal synthetic library of humanized nanobodies providing highly functional antibodies and intrabodies. Elife. 5, 16228 (2016).
- Yan, J., Li, G., Hu, Y., Ou, W., Wan, Y. Construction of a synthetic phage-displayed nanobody library with CDR3 regions randomized by trinucleotide cassettes for diagnostic applications. Journal of Translational Medicine. 12, 343 (2014).
- Sabir, J. S., et al. Construction of naive camelids VHH repertoire in phage display-based library. Comptes Rendus Biologies. 337, 244-249 (2014).
- Yau, K. Y., et al. Selection of hapten-specific single-domain antibodies from a non-immunized llama ribosome display library. Journal of Immunology Methods. 281, 161-175 (2003).
- vander Linden, R. H., et al. Comparison of physical chemical properties of llama VHH antibody fragments and mouse monoclonal antibodies. Biochimica et Biophysica Acta. 1431, 37-46 (1999).
- Dumoulin, M., et al. Single-domain antibody fragments with high conformational stability. Protein Science. 11, 500-515 (2002).
- Iezzi, M. E., Policastro, L., Werbajh, S., Podhajcer, O., Canziani, G. A. Single-domain antibodies and the promise of modular targeting in cancer imaging and treatment. Frontiers in Immunology. 9, 273 (2018).
- Yu, X., et al. Nanobodies derived from camelids represent versatile biomolecules for biomedical applications. Biomaterials Science. 8, 3559-3573 (2020).
- Jahnichen, S., et al. CXCR4 nanobodies (VHH-based single variable domains) potently inhibit chemotaxis and HIV-1 replication and mobilize stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 107, 20565-20570 (2010).
- Nguyen, V. S., et al. Inhibition of type VI secretion by an anti-TssM llama nanobody. PLoS One. 10, 0122187 (2015).
- Bazzone, A., Barthmes, M., Fendler, K. SSM-Based Electrophysiology for Transporter Research. Methods in Enzymology. 594, 31-83 (2017).
- Schulz, P., Garcia-Celma, J. J., Fendler, K. SSM-based electrophysiology. Methods. 46, 97-103 (2008).
- Barthmes, M., Liao, J., Jiang, Y., Bruggemann, A., Wahl-Schott, C. Electrophysiological characterization of the archaeal transporter NCX_Mj using solid supported membrane technology. Journal of General Physiology. 147, 485-496 (2016).
- Watzke, N., Diekert, K., Obrdlik, P. Electrophysiology of respiratory chain complexes and the ADP-ATP exchanger in native mitochondrial membranes. Biochemistry. 49, 10308-10318 (2010).
- Zuber, D., et al. Kinetics of charge translocation in the passive downhill uptake mode of the Na+/H+ antiporter NhaA of Escherichia coli. Biochim Biophys Acta. 1709, 240-250 (2005).
- Garcia-Celma, J. J., Smirnova, I. N., Kaback, H. R., Fendler, K. Electrophysiological characterization of LacY. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 106, 7373-7378 (2009).
- Bazzone, A., Madej, M. G., Kaback, H. R., Fendler, K. pH regulation of electrogenic sugar/H+ symport in MFS sugar permeases. PLoS One. 11, 0156392 (2016).
- Williamson, G., et al. A two-lane mechanism for selective biological ammonium transport. Elife. 9, 57183 (2020).
- Mirandela, G. D., Tamburrino, G., Hoskisson, P. A., Zachariae, U., Javelle, A. The lipid environment determines the activity of the Escherichia coli ammonium transporter AmtB. FASEB Journal. 33, 1989-1999 (2019).
- Kaplan, R. S., Pedersen, P. L. Determination of microgram quantities of protein in the presence of milligram levels of lipid with amido black 10B. Annals of Biochemistry. 150, 97-104 (1985).
- Kermani, A. A., et al. The structural basis of promiscuity in small multidrug resistance transporters. Nature Communication. 11, 6064 (2020).
- Weitz, D., et al. Functional and structural characterization of a prokaryotic peptide transporter with features similar to mammalian PEPT1. Journal of Biological Chemistry. 282, 2832-2839 (2007).
