Anopheles गाम्बिया भ्रूण के लिए Microinjection विधि
Summary
मच्छरों के जीनोम में बहिर्जात जीन को पेश करने के लिए माइक्रोइंजेक्शन तकनीकें आवश्यक हैं। यह प्रोटोकॉल जेम्स प्रयोगशाला द्वारा परिवर्तित मच्छरों को उत्पन्न करने के लिए एनोफिलीज़ गैम्बिया भ्रूण में डीएनए निर्माणों को माइक्रोइंजेक्ट करने के लिए उपयोग की जाने वाली एक विधि की व्याख्या करता है।
Abstract
भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन तकनीक कीट प्रजातियों के कई आणविक और आनुवंशिक अध्ययनों के लिए आवश्यक हैं। वे बहिर्जात डीएनए टुकड़ों को एक स्थिर और वंशानुगत तरीके से कीट जर्मलाइन में ब्याज के जीन के साथ-साथ अनुकूल लक्षणों को एन्कोडिंग करने का एक साधन प्रदान करते हैं। परिणामी ट्रांसजेनिक उपभेदों का अध्ययन बुनियादी सवालों के जवाब देने या व्यावहारिक अनुप्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले एकीकृत डीएनए की अभिव्यक्ति के परिणामस्वरूप फेनोटाइपिक परिवर्तनों के लिए किया जा सकता है। यद्यपि तकनीक सीधी है, लेकिन इसे दक्षता को अधिकतम करने वाले कौशल के स्तर को प्राप्त करने के लिए अन्वेषक धैर्य और अभ्यास की आवश्यकता होती है। यहाँ दिखाया गया है अफ्रीकी मलेरिया मच्छर, Anopheles gambiaeके भ्रूण के microinjection के लिए एक विधि है। इसका उद्देश्य भ्रूण को माइक्रोइंजेक्शन बहिर्जात डीएनए द्वारा वितरित करना है ताकि इसे विकासशील जर्मलाइन (पोल) कोशिकाओं में लिया जा सके। ट्रांसपोसेस, इंटीग्रेसेस, रीकॉम्बिनेज, या अन्य न्यूक्लिएज (उदाहरण के लिए CRISPR-संबद्ध प्रोटीन, कैस) के इंजेक्ट किए गए डीएनए से अभिव्यक्ति उन घटनाओं को ट्रिगर कर सकती है जो गुणसूत्रों में इसके सहसंयोजक सम्मिलन का कारण बनती हैं। इन प्रौद्योगिकियों से उत्पन्न ट्रांसजेनिक एन गाम्बिया का उपयोग प्रतिरक्षा प्रणाली के घटकों, रक्त-भोजन में शामिल जीन और घ्राण प्रणाली के तत्वों के बुनियादी अध्ययन के लिए किया गया है। इसके अलावा, इन तकनीकों का उपयोग लक्षणों के साथ ए. गाम्बिया उपभेदों का उत्पादन करने के लिए किया गया है जो मलेरिया परजीवी के संचरण को नियंत्रित करने में मदद कर सकते हैं।
Introduction
1900 के दशक की शुरुआत से जीवों में प्रयोगात्मक रूप से हेरफेर करने के लिए माइक्रोइंजेक्शनतकनीकोंका उपयोग किया जा रहा है। माइक्रोइंजेक्शन का उपयोग दोनों बुनियादी जैविक कार्यों का अध्ययन करने और / या वांछित जीव के जीव विज्ञान में महत्वपूर्ण परिवर्तनों को पेश करने के लिए किया गया है। माइक्रोइंजेक्शन तकनीक वेक्टर जीवविज्ञानियों के लिए विशेष रुचि की रही है और व्यापक रूप से वेक्टर जीनोम2-11में हेरफेर करने के लिए उपयोग की गई है। आर्थ्रोपोड वैक्टर में ट्रांसजेनेसिस प्रयोगों का उद्देश्य अक्सर वैक्टर को रोगजनकों को प्रसारित करने में कम कुशल बनाना होता है, जो या तो उन परिवर्तनों को लागू करते हैं जो वेक्टर की फिटनेस को कम करते हैं या रोगजनकों के लिए अपवर्तकता को बढ़ाते हैं जो वे संचारित करते हैं। मच्छर विभिन्न प्रकार के मानव रोगजनकों को प्रसारित करते हैं और दुनिया भर में रुग्णता और मृत्यु दर पर महत्वपूर्ण प्रभाव डालते हैं। मच्छरों का एनोफिलीज जीनस मानव मलेरिया परजीवी रोगजनकों, प्लास्मोडियम एसपीपी को प्रसारित करता है। एनोफिलीज़ के साथ जेनेटिक इंजीनियरिंग प्रयोगों का उद्देश्य जीव विज्ञान को बेहतर ढंग से समझना और उपन्यास मलेरिया उन्मूलन रणनीतियों को विकसित करने के प्रयासों में इन मच्छरों की वेक्टरीय क्षमता को कम करना है।
मच्छर वैक्टर जो दुनिया भर में सबसे अधिक मलेरिया संक्रमण का योगदान करते हैं, वे एनोफिलीज़ गैम्बिया प्रजाति परिसर में हैं। हालांकि, अधिकांश सफल ट्रांसजेनेसिस प्रयोग भारतीय उपमहाद्वीप के मलेरिया वेक्टर, एनोफिलीज स्टीफेंसीपर किए गए हैं। जबकि बहुत सारे प्रयोगशाला-अनुकूलित एनोफिलीज़ गैम्बिया उपभेद मौजूद हैं, साहित्य में रिपोर्ट की गई ट्रांसजेनिक एनोफिलीज़ गाम्बिया एसपीपी लाइनों की संख्या एनोफिलीज़ स्टीफेंसीकी तुलना में नहीं है। यह माना जाता है कि एनोफिलीज़ गैम्बिया भ्रूण को एनोफिलीज़ स्टीफेंसी कीतुलना में सफल ट्रांसजेनेसिस को इंजेक्ट करना और प्राप्त करना अधिक कठिन है, हालांकि इन मतभेदों के कारण अज्ञात हैं। यह प्रोटोकॉल एक ऐसी विधि का वर्णन करता है जो माइक्रोइंजेक्शन के माध्यम से एनोफिलीज़ गैम्बिया भ्रूण के ट्रांसजेनेसिस को प्राप्त करने में लगातार सफल साबित हुआ है। प्रोटोकॉल एक विधि पर आधारित है जो पहले हर्वे बोसिन और मार्क बेनेडिक्ट12 द्वारा विकसित की गई थी, जिसमें कुछ अतिरिक्त विवरण और परिवर्तन जोड़े गए थे जो ट्रांसजेनेसिस की दक्षता बढ़ाने के लिए पाए गए हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
CRISPR / Cas9 जैसी सटीक और लचीली आनुवंशिक इंजीनियरिंग प्रौद्योगिकियों की बढ़ती उपलब्धता के साथ, ट्रांसजेनिक जीवों को पहले से अधिक सरल और स्थिर तरीके से विकसित किया जा सकता है। इन उपकरणों ने शोधकर्ताओं को मच्?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम मच्छर पालन के लिए Drusilla Stillinger, Kiona Parker, Parrish पॉवेल और Madeline Nottoli के आभारी हैं। वित्त पोषण कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, इरविन मलेरिया पहल द्वारा प्रदान किया गया था। AAJ कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, इरविन में एक डोनाल्ड ब्रेन प्रोफेसर है।
Materials
| 10x Microinjection Buffer | – | – | 1 mM NaHPO4 buffer, pH 6.8, 50 mM KCl |
| Blotting membrane (Zeta-Probe GT Genomic Tested Blotting Membrane) | Bio-Rad | Neatly and straightly cut into 2×1 cm piece | |
| Conical tubes 50 ml (disposable centrifuge tube, polypropylene) | Fisher Brand | Ends cut | |
| De-ionized or double-distilled water (ddH20) | Mili-Q | In a wash bottle | |
| Dissecting microscope | Leica | Leica MZ12 | For embryo alignment |
| Forceps | No. 5 size | ||
| Glass container | Pyrex | No. 3140 | 125 x 65 |
| Glass slide | Fisher Brand | No. 12-549-3 | 75×26 mm |
| Incubator | Barnsted Lab-line | Model No. 150 | 28 °C |
| KCl | 50 mM | ||
| Latex dental film | Crosstex International | No. 19302 | |
| Microinjector | Sutter Instrument | XenoWorks Digital Microinjector | |
| Microloader Pipette tips | Eppendorf | 20 µL microloader epT.I.P.S. | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | XenoWorks Micromanipulator | |
| Micropipette | Rainin | 20 µL | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Sutter P-2000 micropipette puller | |
| Microscope | Leica | DM 1000 LED or M165 FC | For microinjection |
| Minimum fiber filter paper | Fisher Brand | No. 05-714-4 | Chromatography Paper, Thick |
| Mosquitoes | MR4, BEI Resources | Anopheles gambiae, mated adult females, blood-fed 4-5 days post-eclosion | |
| NaHPO4 buffer | 1 mM, ph 6.8 | ||
| Nylon mesh | |||
| Paint brush | Blick | No. 05831-7040 | Fine, size 4/0 |
| Petri dish | Plastic, (60×15 mm, 90×15 mm) | ||
| Sodium acetate | 3M | ||
| Quartz glass capillaries | Sutter Instrument | No. QF100-70-10 | With filament, 1 mm OD, ID 0.7 10 cm length |
| Water PCR grade | Roche | No. 03315843001 |
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