Método de microinjeção para embriões anofelinos gambiae
Summary
Técnicas de microinjeção são essenciais para introduzir genes exógenos nos genomas dos mosquitos. Este protocolo explica um método usado pelo laboratório James para microinjetar construções de DNA em embriões Anopheles gambiae para gerar mosquitos transformados.
Abstract
Técnicas de microinjeção de embriões são essenciais para muitos estudos moleculares e genéticos de espécies de insetos. Eles fornecem um meio de introduzir fragmentos de DNA exógenos codificando genes de interesse, bem como traços favoráveis na germinação de insetos de forma estável e hereitária. As cepas transgênicas resultantes podem ser estudadas para alterações fenotípicas resultantes da expressão do DNA integrado para responder a perguntas básicas ou usadas em aplicações práticas. Embora a tecnologia seja simples, requer paciência e prática do investigador para alcançar um nível de habilidade que maximize a eficiência. Mostrado aqui é um método de microinjeção de embriões do mosquito africano da malária, Anopheles gambiae. O objetivo é entregar por microinjeção DNA exógeno ao embrião para que possa ser tomado nas células germinas em desenvolvimento (polo). A expressão do DNA injetado de transposases, integrases, recombinases ou outros nucleases (por exemplo, proteínas associadas ao CRISPR, Cas) pode desencadear eventos que levam à sua inserção covalente em cromossomos. A gambiae transgênica gerada a partir dessas tecnologias tem sido usada para estudos básicos de componentes do sistema imunológico, genes envolvidos na alimentação sanguínea e elementos do sistema olfativo. Além disso, essas técnicas têm sido utilizadas para produzir cepas de An. gambiae com características que podem ajudar a controlar a transmissão de parasitas da malária.
Introduction
Técnicas de microinjeção têm sido usadas para manipular experimentalmenteorganismos desde o início dos anos 1900. A microinjeção tem sido usada para estudar ambas as funções biológicas básicas e/ou introduzir mudanças importantes na biologia de um organismo desejado. A técnica de microinjeção tem sido de particular interesse para biólogos vetoriais e tem sido amplamente utilizada para manipular genomas vetoriais2-11. Experimentos de transgênese em vetores de artrópodes muitas vezes visam tornar os vetores menos eficientes na transmissão de patógenos, promulgando alterações que diminuem a aptidão de um vetor ou aumentam a refratabilidade aos patógenos que transmitem. Os mosquitos transmitem uma variedade de patógenos humanos e têm um impacto significativo na morbidade e mortalidade em todo o mundo. O gênero Anopheles de mosquitos transmite os patógenos parasiticos da malária humana, Plasmodium spp. Experimentos de engenharia genética com Anopheles têm como objetivo entender melhor a biologia e reduzir a capacidade vectorial desses mosquitos nos esforços para desenvolver novas estratégias de eliminação da malária.
Os vetores de mosquitos que mais contribuem para as infecções por malária no mundo estão no complexo de espécies anopheles gambiae. No entanto, a maioria dos experimentos bem sucedidos de transgênese foram realizados no vetor da malária do subcontinente indiano, Anopheles stephensi. Embora existam muitas cepas de Anopheles gambiae adaptadas em laboratório, o número de linhas transgênicas de Anopheles gambiae spp. relatadas na literatura não se compara à de Anopheles stephensi. Acredita-se que o embrião anofelino gambiae é mais difícil de injetar e alcançar transgênese bem sucedida do que Anopheles stephensi, embora as razões para essas diferenças sejam desconhecidas. Este protocolo descreve um método que tem sido consistentemente bem sucedido na obtenção de transgênese de embriões anofelinos gambiae via microinjeção. O protocolo é baseado em um método anteriormente desenvolvido por Hervé Bossin e Mark Benedict12 com alguns detalhes adicionais e alterações adicionadas que foram encontrados para aumentar a eficiência da transgênese.
Protocol
Representative Results
Discussion
Com o aumento da disponibilidade de tecnologias precisas e flexíveis de engenharia genética, como o CRISPR/Cas9, organismos transgênicos podem ser desenvolvidos de forma mais simples e estável do que antes possível. Essas ferramentas permitiram aos pesquisadores criar cepas transgênicas de vetores de mosquitos que estão muito perto de alcançar as propriedades desejadas de refratria a patógenos (modificação populacional) ou esterilidade heredital (supressão populacional). No entanto, para desenvolver os mosqui…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Somos gratos a Drusilla Stillinger, Kiona Parker, Parrish Powell e Madeline Nottoli pela criação de mosquitos. O financiamento foi fornecido pela Iniciativa irvine malária da Universidade da Califórnia. AAJ é um professor donald bren na Universidade da Califórnia, Irvine.
Materials
| 10x Microinjection Buffer | – | – | 1 mM NaHPO4 buffer, pH 6.8, 50 mM KCl |
| Blotting membrane (Zeta-Probe GT Genomic Tested Blotting Membrane) | Bio-Rad | Neatly and straightly cut into 2×1 cm piece | |
| Conical tubes 50 ml (disposable centrifuge tube, polypropylene) | Fisher Brand | Ends cut | |
| De-ionized or double-distilled water (ddH20) | Mili-Q | In a wash bottle | |
| Dissecting microscope | Leica | Leica MZ12 | For embryo alignment |
| Forceps | No. 5 size | ||
| Glass container | Pyrex | No. 3140 | 125 x 65 |
| Glass slide | Fisher Brand | No. 12-549-3 | 75×26 mm |
| Incubator | Barnsted Lab-line | Model No. 150 | 28 °C |
| KCl | 50 mM | ||
| Latex dental film | Crosstex International | No. 19302 | |
| Microinjector | Sutter Instrument | XenoWorks Digital Microinjector | |
| Microloader Pipette tips | Eppendorf | 20 µL microloader epT.I.P.S. | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | XenoWorks Micromanipulator | |
| Micropipette | Rainin | 20 µL | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Sutter P-2000 micropipette puller | |
| Microscope | Leica | DM 1000 LED or M165 FC | For microinjection |
| Minimum fiber filter paper | Fisher Brand | No. 05-714-4 | Chromatography Paper, Thick |
| Mosquitoes | MR4, BEI Resources | Anopheles gambiae, mated adult females, blood-fed 4-5 days post-eclosion | |
| NaHPO4 buffer | 1 mM, ph 6.8 | ||
| Nylon mesh | |||
| Paint brush | Blick | No. 05831-7040 | Fine, size 4/0 |
| Petri dish | Plastic, (60×15 mm, 90×15 mm) | ||
| Sodium acetate | 3M | ||
| Quartz glass capillaries | Sutter Instrument | No. QF100-70-10 | With filament, 1 mm OD, ID 0.7 10 cm length |
| Water PCR grade | Roche | No. 03315843001 |
References
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