Mikroinjeksjonsmetode for anopheles gambiae embryoer
Summary
Mikroinjeksjonsteknikker er avgjørende for å introdusere eksogene gener i myggens genomer. Denne protokollen forklarer en metode som brukes av James-laboratoriet til å mikroinjekt DNA-konstruksjoner til Anopheles gambiae embryoer for å generere transformerte mygg.
Abstract
Embryomikroinjeksjonsteknikker er avgjørende for mange molekylære og genetiske studier av insektarter. De gir et middel til å introdusere eksogene DNA-fragmenter som koder gener av interesse, samt gunstige egenskaper i insektets bakterie på en stabil og arvelig måte. De resulterende transgene stammene kan studeres for fenotypiske endringer som følge av uttrykket av det integrerte DNA-et for å svare på grunnleggende spørsmål eller brukes i praktiske applikasjoner. Selv om teknologien er grei, krever den undersøkerens tålmodighet og praksis for å oppnå et ferdighetsnivå som maksimerer effektiviteten. Vist her er en metode for mikroinjeksjon av embryoer av den afrikanske malaria mygg, Anopheles gambiae. Målet er å levere med mikroinjeksjon eksogent DNA til embryoet slik at det kan tas opp i de utviklende bakteriecellene (pole). Uttrykk fra injisert DNA av transposaser, integraser, rekombinasjoner eller andre nukleaser (for eksempel CRISPR-assosierte proteiner, Cas) kan utløse hendelser som fører til kovalent innsetting i kromosomer. Transgen an. gambiae generert fra disse teknologiene har blitt brukt til grunnleggende studier av immunsystemkomponenter, gener involvert i blodfôring og elementer i det olfaktoriske systemet. I tillegg har disse teknikkene blitt brukt til å produsere An. gambiae stammer med egenskaper som kan bidra til å kontrollere overføringen av malariaparasitter.
Introduction
Mikroinjeksjonsteknikker har blitt brukt til å eksperimentelt manipulere organismer siden tidlig på 1900-tallet1. Mikroinjeksjon har blitt brukt til å studere både grunnleggende biologiske funksjoner og/eller innføre viktige endringer i biologien til en ønsket organisme. Mikroinjeksjonsteknikken har vært av spesiell interesse for vektorbiologer og har blitt mye brukt til å manipulere vektorgenomer2-11. Transgenese eksperimenter i leddyr vektorer ofte tar sikte på å gjøre vektorer mindre effektive til å overføre patogener ved enten å vedta endringer som reduserer en vektors kondisjon eller øke ildfasthet til patogener de overfører. Mygg overfører en rekke menneskelige patogener og har en betydelig innvirkning på sykelighet og dødelighet over hele verden. Anopheles-slekten av mygg overfører de menneskelige malaria parasittiske patogener, Plasmodium spp. Genteknologiske eksperimenter med Anopheles har som mål å bedre forstå biologien og redusere vektorkapasiteten til disse myggene i arbeidet med å utvikle nye malaria elimineringsstrategier.
Myggvektorene som bidrar med de mest malariainfeksjoner over hele verden er i Anopheles gambiae artskomplekset. Imidlertid har flertallet av vellykkede transgeneseforsøk blitt utført på malariavektoren til det indiske subkontinentet, Anopheles stephensi. Mens mange laboratorietilpassede Anopheles gambiae stammer eksisterer, antall transgene Anopheles gambiae spp. linjer rapportert i litteraturen ikke sammenlignet med anopheles stephensi. Det antas at Anopheles gambiae embryo er vanskeligere å injisere og oppnå vellykket transgenese enn Anopheles stephensi, selv om årsakene til disse forskjellene er ukjente. Denne protokollen beskriver en metode som har vist seg å være konsekvent vellykket for å oppnå transgenese av Anopheles gambiae embryoer via mikroinjeksjon. Protokollen er basert på en metode tidligere utviklet av Hervé Bossin og Benedict12 med noen ytterligere detaljer og endringer lagt til som har vist seg å øke effektiviteten av transgenese.
Protocol
Representative Results
Discussion
Med økt tilgjengelighet av presise og fleksible genteknologier som CRISPR/Cas9, kan transgene organismer utvikles på en enklere og mer stabil måte enn tidligere mulig. Disse verktøyene har gjort det mulig for forskere å lage transgene stammer av myggvektorer som er svært nær å oppnå de ønskede egenskapene til enten ildfasthet mot patogener (befolkningsmodifisering) eller arvelig sterilitet (befolkningsundertrykkelse). Men for å utvikle de mest sikre og stabile genetisk modifiserte myggene som er mulig, må ytt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er takknemlige til Drusilla Stillinger, Kiona Parker, Parrish Powell og Madeline Nottoli for mygghold. Finansieringen ble gitt av University of California, Irvine Malaria Initiative. AAJ er professor i Donald Bren ved University of California, Irvine.
Materials
| 10x Microinjection Buffer | – | – | 1 mM NaHPO4 buffer, pH 6.8, 50 mM KCl |
| Blotting membrane (Zeta-Probe GT Genomic Tested Blotting Membrane) | Bio-Rad | Neatly and straightly cut into 2×1 cm piece | |
| Conical tubes 50 ml (disposable centrifuge tube, polypropylene) | Fisher Brand | Ends cut | |
| De-ionized or double-distilled water (ddH20) | Mili-Q | In a wash bottle | |
| Dissecting microscope | Leica | Leica MZ12 | For embryo alignment |
| Forceps | No. 5 size | ||
| Glass container | Pyrex | No. 3140 | 125 x 65 |
| Glass slide | Fisher Brand | No. 12-549-3 | 75×26 mm |
| Incubator | Barnsted Lab-line | Model No. 150 | 28 °C |
| KCl | 50 mM | ||
| Latex dental film | Crosstex International | No. 19302 | |
| Microinjector | Sutter Instrument | XenoWorks Digital Microinjector | |
| Microloader Pipette tips | Eppendorf | 20 µL microloader epT.I.P.S. | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | XenoWorks Micromanipulator | |
| Micropipette | Rainin | 20 µL | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Sutter P-2000 micropipette puller | |
| Microscope | Leica | DM 1000 LED or M165 FC | For microinjection |
| Minimum fiber filter paper | Fisher Brand | No. 05-714-4 | Chromatography Paper, Thick |
| Mosquitoes | MR4, BEI Resources | Anopheles gambiae, mated adult females, blood-fed 4-5 days post-eclosion | |
| NaHPO4 buffer | 1 mM, ph 6.8 | ||
| Nylon mesh | |||
| Paint brush | Blick | No. 05831-7040 | Fine, size 4/0 |
| Petri dish | Plastic, (60×15 mm, 90×15 mm) | ||
| Sodium acetate | 3M | ||
| Quartz glass capillaries | Sutter Instrument | No. QF100-70-10 | With filament, 1 mm OD, ID 0.7 10 cm length |
| Water PCR grade | Roche | No. 03315843001 |
References
- Feramisco, J., Perona, R., Lacal, J. C., Lacal, J. C., Feramisco, J., Perona, R. Needle Microinjection: A Brief History. Microinjection. Methods and Tools in Biosciences and Medicine. , (1999).
- Windbichler, N., et al. A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in the human malaria mosquito. Nature. 473 (7346), 212-215 (2011).
- Meredith, J. M., et al. Site-specific integration and expression of an anti-malarial gene in transgenic Anopheles gambiae significantly reduces Plasmodium infections. PLoS One. 6 (1), 14587 (2011).
- Hammond, A., et al. CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2016).
- Carballar-Lejarazu, R., et al. Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (37), 22805-22814 (2020).
- Simões, M. L., et al. The Anopheles FBN9 immune factor mediates Plasmodium species-specific defense through transgenic fat body expression. Develomental & Comparative Immunology. 67, 257-265 (2017).
- Arik, A. J., et al. Increased Akt signaling in the mosquito fat body increases adult survivorship. FASEB Journal. 4, 1404-1413 (2015).
- Riabinina, O., et al. Organization of olfactory centres in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature Communications. 7, 13010 (2016).
- Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
- Dong, Y., Simões, M. L., Dimopoulos, G. Versatile transgenic multistage effector-gene combinations for Plasmodium falciparum suppression in Anopheles. Science Advances. 6 (20), (2020).
- Grossman, G. L., et al. Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element. Insect Molecular Biology. 6, 597-604 (2001).
- Benedict, M. Q. Methods in Anopheles research. Chapter 3: Specific Anopheles techniques. 3.1 Embryonic Techniques. 3.1.1 Microinjection methods for Anopheles Embryos. BEI resources. , (2015).
- Pham, T. B., et al. Experimental population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles stephensi. PLoS Genetics. 15 (12), 1008440 (2019).
- Benedict, M. Q., et al. Pragmatic selection of larval mosquito diets for insectary rearing of Anopheles gambiae and Aedes aegypti. PLoS One. 15 (3), 0221838 (2020).
- Carballar-Lejarazú, R., James, A. A. Population modification of Anopheline species to control malaria transmission. Pathogens and Global Health. 111 (8), 424-435 (2017).
