Criblage chromosomique d’embryons humains préimplantatoires à l’aide de milieux de culture épuisés : prélèvement d’échantillons et analyse de la ploïdie chromosomique
Summary
La présente étude fait état d’un protocole de criblage chromosomique d’embryons humains qui utilise un milieu de culture épuisé, ce qui évite la biopsie embryonnaire et permet l’identification de la ploïdie chromosomique à l’aide du NGS. Le présent article présente la procédure détaillée, y compris la préparation du milieu de culture, l’amplification du génome entier (WGA), la préparation de la bibliothèque de séquençage de nouvelle génération (NGS) et l’analyse des données.
Abstract
Dans la fécondation clinique in vitro (FIV), la méthode prédominante pour le PGT-A nécessite la biopsie de quelques cellules du trophectoderme (TE). C’est la lignée qui forme le placenta. Cette méthode, cependant, nécessite des compétences spécialisées, est invasive et souffre de faux positifs et de faux négatifs, car le nombre de chromosomes dans le TE et la masse cellulaire interne (ICM), qui se développe dans le fœtus, ne sont pas toujours les mêmes. Le NICS, une technologie nécessitant le séquençage de l’ADN libéré dans le milieu de culture à la fois par TE et par ICM, peut offrir une solution à ces problèmes, mais il a déjà été démontré qu’il avait une efficacité limitée. La présente étude rend compte du protocole complet du NICS, qui comprend les méthodes d’échantillonnage des milieux de culture, l’amplification du génome entier (WGA) et la préparation de la bibliothèque, ainsi que l’analyse des données NGS par un logiciel d’analyse. Compte tenu des différents temps de cryoconservation dans les différents laboratoires d’embryons, les embryologistes disposent de deux méthodes de collecte du milieu de culture embryonnaire qui peuvent être sélectionnées en fonction des conditions réelles du laboratoire de FIV.
Introduction
Les techniques de procréation assistée (ART) sont de plus en plus utilisées pour le traitement de l’infertilité. Cependant, le taux de réussite des traitements antirétroviraux, tels que la FIV, a été limité et le taux de fausse couche est significativement plus élevé que celui de la population normale1. La principale cause de ces problèmes est les anomalies chromosomiques, qui existent couramment dans les embryons humains préimplantatoires2. Le PGT-A est une méthode efficace de dépistage de l’équilibre chromosomique des embryons avant l’implantation 3,4. Certaines études ont prouvé que le PGT-A peut réduire le taux d’avortement et améliorer le taux de grossesse 5,6,7,8. Cependant, le PGT-A nécessite une expertise technique complexe qui nécessite une formation et une expérience spécifiques. La procédure invasive de biopsie embryonnaire pourrait également causer des dommages aux embryons9. Des études ont montré que la biopsie du blastomère peut entraver le développement ultérieur et que le nombre de TE biopsiées peut affecter les taux d’implantation10. Bien que la question de la biosécurité à long terme de la biopsie embryonnaire n’ait pas encore été évaluée de manière approfondie chez l’homme, des études animales ont montré ses influences négatives sur le développement de l’embryon11,12,13.
Des rapports antérieurs indiquaient que des traces d’ADN étaient sécrétées dans le milieu de culture au cours du développement de l’embryon, et des efforts ont été faits pour effectuer un criblage chromosomique complet (CCS) à l’aide de milieux de culture embryonnaires épuisés 14,15,16,17,18. Cependant, les taux de détection et la précision des tests n’ont pas répondu aux exigences d’une utilisation clinique étendue. La présente étude a fait état d’une amélioration du test NICS pour augmenter les taux de détection ainsi que la précision du test NICS19. Au cours des dernières années, le liquide blastocoele (BF) a été étudié en tant qu’échantillon analytique de PGT-A mini-invasif. Cependant, la proportion d’amplification réussie à l’échelle du génome et d’ADN détectable dans les échantillons de liquide de blastocyste varie de 34,8 % à 82 %20,21,22. Le volume de BF rapporté dans diverses études varie de 0,3 nL à 1 μL. Compte tenu de la faible quantité d’ADN dans BF, il est possible d’augmenter la quantité d’ADN acellulaire en mélangeant le liquide du blastocyste et le milieu de culture pour améliorer le taux de réussite et la cohérence de la détection. Kuznyetsov et al.23 et Li et al.24 ont traité la zone pellucide avec un laser et ont libéré du liquide de blastocyste dans le milieu de culture pour améliorer la quantité totale d’ADN embryonnaire, et le taux d’amplification des échantillons combinés milieu/BF après WGA était de 100 % et 97,5 %, respectivement. Jiao et al.25 ont également obtenu un taux de réussite d’amplification de 100% en utilisant la même méthode.
La présente étude fait état d’un protocole détaillé qui comprend la préparation des échantillons de milieux usés, la préparation du NGS et l’analyse des données. En retirant soigneusement les cellules de cumulus des ovocytes, la présente étude a effectué une injection intracytoplasmique de spermatozoïdes uniques (ICSI) et une culture de blastocystes. Le support dépensé du jour 4, du jour 5 et du jour 6 a été collecté pour la préparation de la bibliothèque WGA et NGS. En utilisant la technologie NICS, la présente étude a rationalisé les étapes de préparation des bibliothèques WGA et NGS en environ 3 h et a obtenu des résultats CCS non invasifs en environ 9 h.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modifications et dépannage
Si les résultats du NICS sont contaminés par du matériel génétique parental, assurez-vous que toutes les cellules cumulus-corona radiata sont retirées et assurez-vous que l’ICSI est effectuée pour la fécondation. Les processus inadéquats de stockage du milieu ou de préparation des modèles sont évités, ce qui peut dégrader l’ADN. L’espace de travail a été purifié en profondeur avec des réactifs de décontamination DNase et RNa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Shiping Bo et Shujie Ma pour leur aide dans l’analyse des données NGS. Financement : ces travaux ont été financés par le Programme national de recherche et de développement clé (subvention n° 2018YFC1003100).
Materials
| 1.5 mL EP tube, 0.2 mL PCR tube | Axygen | MCT-150-C, PCR-02-C | DNase/RNase free, Low Binding PCR tubes and 1.5 mL micro-centrifuge tubes are recommended. |
| 10 µL, 200 µL, 1000 µL DNase /RNase Free Tips | Axygen | T-300-R-S, T-200-Y-R-S, T-1000-B-R-S | This can be replaced by other brand/For sample transfer |
| 100 % ethanol | Sinopharm Chemical | 10009218 | This can be replaced by other brand/For DNA library purification |
| Barcode Primer1-48 | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For library amplificaton |
| BD Falcon Organ Culture Dish, Sterile | BD Bioscience | 363037 | This can be replaced by other brand/For embryo culture |
| BD Falcon Tissue culture Dishes (Easy Grip) , Sterile | BD Bioscience | 353001 | This can be replaced by other brand/For embryo culture |
| BD Falcon Tissue culture Dishes, Sterile | BD Bioscience | 353002 | This can be replaced by other brand/For embryo culture |
| Cell Lysis Buffer | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For culture medium pre-treatment |
| Cell Lysis Enzyme | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For culture medium pre-treatment |
| ChromGo software | Yikon Genomics | Data analysis | |
| CMPure Magbeads | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For library purification |
| Cryotop open systerm | KITAZATO BioPharma | 81110 | This can be replaced by other brand/For embryo vitrification |
| Distill water | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | To dissolve DNA |
| ES (Vitrification kit) | KITAZATO BioPharma | Reagent inVitrification kit | This can be replaced by other brand/For embryo vitrification |
| HOLDNIG | ORIGIO | MPH-MED-35 | This can be replaced by other brand/For ICSI |
| Hyaluronidase solution, 80 U/mL | SAGE | ART4007-A | This can be replaced by other brand/Digest oocyte-corona-cumulus complex |
| ICSI | ORIGIO | MPH-35-35 | This can be replaced by other brand/For ICSI |
| Illumina MiSeq® System | Illumina | SY-410-1001 | For library sequencing |
| Incubator | Labotect | Inkubator C16 | This can be replaced by other brand/For embryo culture |
| Library buffer | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For library amplificaton |
| Library Enzyme Mix | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For library amplificaton |
| Magnetic Stand | DynaMagTM-2 | 12321D | For library purification |
| Microscope | OLYMPUS | 1X71 | This can be replaced by other brand/For embryo observation |
| Mini-centrifuge | ESSENSCIEN | ELF6 | For separation |
| MT Enzyme Mix | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For culture medium pre-treatment |
| NICSInst library preparation kit | Yikon Genomics | KT1000800324 | Whole genome amplification and library construction |
| NICSInst Sample Prep Station | Yikon Genomics | ME1001003 | Amplificate DNA |
| Nunc IVF 4-Well Dish | Thermo Scientific | 144444 | This can be replaced by other brand/For embryo washing and blastocyst culture |
| Pasteur Pipette | Oirgio | MXL3-IND-135 | This can be replaced by other brand/For embryo tansfer |
| Pasteur pipettes | ORIGIO | PP-9-1000 | This can be replaced by other brand/For IVF laboratory |
| Pre-Lib Buffer | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | Pre-library preparation |
| Pre-Lib Enzyme | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | Pre-library preparation |
| Qubit® 3.0 Fluorometer | Thermo Scientific | Q33216 | For library quantification |
| Quinn's Advantage Blastocyst Medium | SAGE | ART-1029 | For embryo blastocyst stage culture |
| Quinn's Advantage Cleavage Medium | SAGE | ART-1026 | This can be replaced by other brand/For embryo cleavage stage culture |
| Quinn's Advantage Fertilization Medium | SAGE | ART-1020 | This can be replaced by other brand/For oocyte and sperm fertilization |
| Quinn's Advantage m-HTF Medium with HEPES | SAGE | ART-1023 | This can be replaced by other brand/For embryo clutrure |
| Quinn's Advantage SPS Serum protein Substitute Kit | SAGE | ART-3010 | This can be replaced by other brand/To denude the oocyte |
| Quinn's Advantage Tissue culture mineral oil | SAGE | ART-4008P | This can be replaced by other brand/To cover the culture medium |
| STRIPPER TIPS | ORIGIO | MXL3-IND-135 | This can be replaced by other brand/For denudating granulosa cells |
| Vitrification Cryotop Open systerm | KIZTAZATO | 81111 | This can be replaced by other brand/For embryo vitrification |
| Vitrification kit | KITAZATO BioPharma | VT101 | This can be replaced by other brand/For embryo vitrification |
| Vortexer | Qilinbeier | DNYS8 | Sample mix |
| VS (Vitrification kit) | KITAZATO BioPharma | Reagent inVitrification kit | This can be replaced by other brand/For embryo vitrification |
| ZILOS-tk Laser System | Hamilton Thorne | CLASS 1 laser | This can be replaced by other brand/For artificial blastocoele collapse |
References
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