Screening cromosomico di embrioni umani preimpianto mediante l'utilizzo di terreno di coltura esausto: raccolta del campione e analisi della ploidia cromosomica
Summary
Il presente studio riporta un protocollo per lo screening cromosomico di embrioni umani che utilizza un terreno di coltura esausto, che evita la biopsia embrionale e consente l’identificazione della ploidia cromosomica utilizzando NGS. Il presente articolo presenta la procedura dettagliata, compresa la preparazione del terreno di coltura, l’amplificazione dell’intero genoma (WGA), la preparazione della libreria di sequenziamento di nuova generazione (NGS) e l’analisi dei dati.
Abstract
Nella fecondazione clinica in vitro (FIV), il metodo prevalente per la PGT-A richiede la biopsia di alcune cellule del trofoectoderma (TE). Questo è il lignaggio che forma la placenta. Questo metodo, tuttavia, richiede competenze specialistiche, è invasivo e soffre di falsi positivi e negativi perché il numero di cromosomi nella TE e nella massa cellulare interna (ICM), che si sviluppa nel feto, non sono sempre gli stessi. La NICS, una tecnologia che richiede il sequenziamento del DNA che viene rilasciato nel terreno di coltura sia da TE che da ICM, può offrire una via d’uscita a questi problemi, ma in precedenza ha dimostrato di avere un’efficacia limitata. Il presente studio riporta il protocollo completo del NICS, che include i metodi di campionamento del terreno di coltura, l’amplificazione dell’intero genoma (WGA) e la preparazione della libreria, e l’analisi dei dati NGS tramite software di analisi. Considerando i diversi tempi di crioconservazione nei diversi laboratori di embrioni, gli embriologi hanno due metodi per raccogliere il terreno di coltura embrionale che possono essere selezionati in base alle condizioni effettive del laboratorio di fecondazione in vitro.
Introduction
Le tecnologie di riproduzione assistita (PMA) sono sempre più utilizzate per il trattamento dell’infertilità. Tuttavia, il tasso di successo della fecondazione assistita, come la fecondazione in vitro, è stato limitato e il tasso di aborto è significativamente superiore a quellodella popolazione normale. La causa principale di questi problemi sono le anomalie cromosomiche, che esistono comunemente negli embrioni umani preimpianto2. La PGT-A è un metodo efficace per lo screening dell’equilibrio cromosomico degli embrioni prima dell’impianto 3,4. Alcuni studi hanno dimostrato che la PGT-A può ridurre il tasso di aborto e migliorare il tasso di gravidanza 5,6,7,8. Tuttavia, il PGT-A richiede competenze tecniche complesse che richiedono una formazione e un’esperienza specifiche. Anche la procedura invasiva di biopsia embrionale potrebbe potenzialmente causare danni agli embrioni9. Gli studi hanno dimostrato che la biopsia dei blastomeri può ostacolare lo sviluppo successivo e il numero di TE sottoposti a biopsia può influenzare i tassi di impianto10. Sebbene il problema della biosicurezza a lungo termine della biopsia embrionale non sia ancora stato valutato a fondo nell’uomo, gli studi sugli animali hanno dimostrato le sue influenze negative sullo sviluppo embrionale11,12,13.
Rapporti precedenti hanno indicato che tracce di materiali di DNA sono state secrete nel terreno di coltura durante lo sviluppo embrionale e sono stati compiuti sforzi per eseguire uno screening cromosomico completo (CCS) utilizzando il terreno di coltura embrionaleesausto 14,15,16,17,18. Tuttavia, i tassi di rilevamento e l’accuratezza dei test non hanno soddisfatto i requisiti per un uso clinico estensivo. Il presente studio ha riportato un miglioramento nel test NICS per aumentare i tassi di rilevamento e l’accuratezza del test NICS19. Negli ultimi anni, il liquido blastocele (BF) è stato studiato come campione analitico di PGT-A minimamente invasivo. Tuttavia, la percentuale di amplificazione dell’intero genoma e di DNA rilevabile nei campioni di liquido di blastocisti varia dal 34,8% all’82%20,21,22. Il volume di BF riportato in vari studi varia da 0,3 nL a 1 μL. In considerazione della bassa quantità di DNA nel BF, è possibile aumentare la quantità di DNA libero da cellule mescolando il liquido della blastocisti e il terreno di coltura per migliorare il tasso di successo e la coerenza del rilevamento. Kuznyetsov et al.23 e Li et al.24 hanno trattato la zona pellucida con un laser e hanno rilasciato il liquido della blastocisti nel terreno di coltura per migliorare la quantità totale di DNA embrionale e il tasso di amplificazione dei campioni combinati di terreno / BF dopo WGA era rispettivamente del 100% e del 97,5%. Anche Jiao et al.25 hanno ottenuto un tasso di successo dell’amplificazione del 100% utilizzando lo stesso metodo.
Il presente studio riporta un protocollo dettagliato che include la preparazione del campione di terreno esausto, la preparazione NGS e l’analisi dei dati. Rimuovendo con cura le cellule del cumulo dagli ovociti, il presente studio ha eseguito l’iniezione intracitoplasmatica di singoli spermatozoi (ICSI) e la coltura di blastocisti. Il giorno 4-giorno 5/giorno 6 è stato raccolto per la preparazione della libreria WGA e NGS. Utilizzando la tecnologia NICS, il presente studio ha semplificato le fasi di preparazione delle librerie WGA e NGS in circa 3 ore e ha ottenuto risultati CCS in modo non invasivo in circa 9 ore.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modifiche e risoluzione dei problemi
Se i risultati del NICS sono contaminati da materiale genetico parentale, assicurarsi che tutte le cellule del cumulo-corona radiata siano state rimosse e assicurarsi che l’ICSI venga eseguita per la fecondazione. Si evitano processi impropri di conservazione del terreno o di preparazione del modello, che possono degradare il DNA. Lo spazio di lavoro è stato accuratamente purificato con reagenti di decontaminazione DNasi e RNasi. Per evita…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare Shiping Bo e Shujie Ma per la loro assistenza nell’analisi dei dati NGS. Finanziamento: questo lavoro è stato sostenuto dal National Key Research and Development Program (Grant No. 2018YFC1003100).
Materials
| 1.5 mL EP tube, 0.2 mL PCR tube | Axygen | MCT-150-C, PCR-02-C | DNase/RNase free, Low Binding PCR tubes and 1.5 mL micro-centrifuge tubes are recommended. |
| 10 µL, 200 µL, 1000 µL DNase /RNase Free Tips | Axygen | T-300-R-S, T-200-Y-R-S, T-1000-B-R-S | This can be replaced by other brand/For sample transfer |
| 100 % ethanol | Sinopharm Chemical | 10009218 | This can be replaced by other brand/For DNA library purification |
| Barcode Primer1-48 | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For library amplificaton |
| BD Falcon Organ Culture Dish, Sterile | BD Bioscience | 363037 | This can be replaced by other brand/For embryo culture |
| BD Falcon Tissue culture Dishes (Easy Grip) , Sterile | BD Bioscience | 353001 | This can be replaced by other brand/For embryo culture |
| BD Falcon Tissue culture Dishes, Sterile | BD Bioscience | 353002 | This can be replaced by other brand/For embryo culture |
| Cell Lysis Buffer | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For culture medium pre-treatment |
| Cell Lysis Enzyme | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For culture medium pre-treatment |
| ChromGo software | Yikon Genomics | Data analysis | |
| CMPure Magbeads | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For library purification |
| Cryotop open systerm | KITAZATO BioPharma | 81110 | This can be replaced by other brand/For embryo vitrification |
| Distill water | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | To dissolve DNA |
| ES (Vitrification kit) | KITAZATO BioPharma | Reagent inVitrification kit | This can be replaced by other brand/For embryo vitrification |
| HOLDNIG | ORIGIO | MPH-MED-35 | This can be replaced by other brand/For ICSI |
| Hyaluronidase solution, 80 U/mL | SAGE | ART4007-A | This can be replaced by other brand/Digest oocyte-corona-cumulus complex |
| ICSI | ORIGIO | MPH-35-35 | This can be replaced by other brand/For ICSI |
| Illumina MiSeq® System | Illumina | SY-410-1001 | For library sequencing |
| Incubator | Labotect | Inkubator C16 | This can be replaced by other brand/For embryo culture |
| Library buffer | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For library amplificaton |
| Library Enzyme Mix | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For library amplificaton |
| Magnetic Stand | DynaMagTM-2 | 12321D | For library purification |
| Microscope | OLYMPUS | 1X71 | This can be replaced by other brand/For embryo observation |
| Mini-centrifuge | ESSENSCIEN | ELF6 | For separation |
| MT Enzyme Mix | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For culture medium pre-treatment |
| NICSInst library preparation kit | Yikon Genomics | KT1000800324 | Whole genome amplification and library construction |
| NICSInst Sample Prep Station | Yikon Genomics | ME1001003 | Amplificate DNA |
| Nunc IVF 4-Well Dish | Thermo Scientific | 144444 | This can be replaced by other brand/For embryo washing and blastocyst culture |
| Pasteur Pipette | Oirgio | MXL3-IND-135 | This can be replaced by other brand/For embryo tansfer |
| Pasteur pipettes | ORIGIO | PP-9-1000 | This can be replaced by other brand/For IVF laboratory |
| Pre-Lib Buffer | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | Pre-library preparation |
| Pre-Lib Enzyme | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | Pre-library preparation |
| Qubit® 3.0 Fluorometer | Thermo Scientific | Q33216 | For library quantification |
| Quinn's Advantage Blastocyst Medium | SAGE | ART-1029 | For embryo blastocyst stage culture |
| Quinn's Advantage Cleavage Medium | SAGE | ART-1026 | This can be replaced by other brand/For embryo cleavage stage culture |
| Quinn's Advantage Fertilization Medium | SAGE | ART-1020 | This can be replaced by other brand/For oocyte and sperm fertilization |
| Quinn's Advantage m-HTF Medium with HEPES | SAGE | ART-1023 | This can be replaced by other brand/For embryo clutrure |
| Quinn's Advantage SPS Serum protein Substitute Kit | SAGE | ART-3010 | This can be replaced by other brand/To denude the oocyte |
| Quinn's Advantage Tissue culture mineral oil | SAGE | ART-4008P | This can be replaced by other brand/To cover the culture medium |
| STRIPPER TIPS | ORIGIO | MXL3-IND-135 | This can be replaced by other brand/For denudating granulosa cells |
| Vitrification Cryotop Open systerm | KIZTAZATO | 81111 | This can be replaced by other brand/For embryo vitrification |
| Vitrification kit | KITAZATO BioPharma | VT101 | This can be replaced by other brand/For embryo vitrification |
| Vortexer | Qilinbeier | DNYS8 | Sample mix |
| VS (Vitrification kit) | KITAZATO BioPharma | Reagent inVitrification kit | This can be replaced by other brand/For embryo vitrification |
| ZILOS-tk Laser System | Hamilton Thorne | CLASS 1 laser | This can be replaced by other brand/For artificial blastocoele collapse |
References
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