Fremstilling af pseudotypede H5 aviær influenzavirus med calciumphosphattransfektionsmetode og måling af antistofneutraliserende aktivitet
Summary
Her beskriver vi en protokol for pseudovirusemballage og måling af antistofneutraliserende aktivitet.
Abstract
Siden 1996 har A/gås/Guangdong/1/96-afstamning højpatogen aviær influenza (HPAI) H5-vira forårsaget influenzaudbrud hos fjerkræ og vilde fugle. Lejlighedsvis bliver mennesker også ofre for det, hvilket resulterer i høj dødelighed. Ikke desto mindre hindres HPAI-virusforskning ofte, da den skal håndteres inden for laboratorier med biosikkerhedsniveau 3. For at løse dette problem vedtages pseudovirus som et alternativ til vildtypevirus i nogle eksperimenter med H5 HPAI-undersøgelser. Pseudovirus viser sig at være de ideelle værktøjer til at studere neutraliserende antistoffer mod H5 HPAI-vira. Denne protokol beskriver procedurer og kritiske trin i H5 HPAI-pseudoviruspræparater og pseudovirusneutraliseringsassays. Det diskuterer også fejlfinding, begrænsning og ændringer af disse assays.
Introduction
Siden 1996 har A/gås/Guangdong/1/96-afstamning højpatogen aviær influenza (HPAI) H5-vira forårsaget kontinuerlige influenzaudbrud hos fjerkræ og vilde fugle, hvilket tegner sig for enorme socioøkonomiske tab i den globale fjerkræindustri. Nogle gange bliver mennesker også smittet med det, der står over for en høj dødelighed 1,2. HPAI-virusforskning hindres imidlertid ofte, da den ikke kan håndteres uden for laboratorier med biosikkerhedsniveau 3. For at løse dette problem vedtages pseudovirus som et alternativ til vildtypevirus i nogle eksperimenter med H5 HPAI-undersøgelser. Pseudovirus er sikre nok til at praktisere i laboratorier med biosikkerhedsniveau 2.
H5 HPAI-pseudovira tilhører kimære vira, der består af surrogatviruskerner, lipidhylstre med overfladeglycoproteiner fra influenzavirus og reportergener. Pseudoviruskerner er normalt afledt af lentiviral human immundefektvirus (HIV), retrovirus såsom murine leukæmivirus (MLV) og vesikulær stomatitisvirus (VSV)3. Specifikt anvendes HIV-1-emballagesystemet i vid udstrækning til at producere influenzapseudovirus, hvor de primære gener, der leveres, er gag og pol. HIV gag genet udtrykker kerneproteiner. Pol-genet udtrykker integrasen og revers transkriptase, som begge er nødvendige for ekspressionen af reportergenet i transducerede celler. Ved at efterligne surrogatvirusets genom omfavnes reportergenet i pseudoviruskernen i RNA-form. Reportergenet vil udtrykke proteinet i værtsceller. Genekspressionsniveauerne for reportergener kan bruges til at måle pseudovirusinfektionseffektivitet 3,4. Den primære reporter er firefly luciferase til måling af de relative luminescensenheder (RLU) eller relativ luciferase aktivitet (RLA) i transducerede celler. Andre journalister som lacZ, Gaussia og Renilla luciferase bruges også, kun i mindre grad5.
Pseudovirus er ideelle værktøjer til at studere neutraliserende antistoffer mod H5 HAPI-vira. For at måle den neutraliserende antistofstyrke anvendes pseudovirusneutraliseringsassays (PN) 6. Hemagglutinin (HA) og neuraminidase (NA) er glycoproteiner på overfladen af influenza A-virus 7,8. HA består af et kugleformet hoveddomæne til receptorbinding og et stamdomæne til membranfusion. NA-proteinet har sialidaseaktiviteten til at lette virusfrigivelsen 7,8. Et PN-assay kan måle neutraliserende antistoffer rettet mod HA-proteiner. Neutraliserende antistoffer rettet mod hoved- og stammeregionen af HA kan også påvises ved viral vedhæftning og indgangsassays. Sammenlignet med vildtypevirus har pseudovirusneutraliseringseksperimenter mere følsomme detektionsværdier, kan håndteres sikkert i et niveau 2-biosikkerhedslaboratorium og er generelt lettere at betjene i praksis.
Denne protokol præsenterer detaljeret procedurerne og de kritiske trin i H5 HPAI-pseudoviruspræparater og PN-assays. Det diskuterer også fejlfinding, begrænsning og ændringer af disse assays. I denne undersøgelse blev A/Thailand/1(KAN)-1/2004(TH)-stammen fra H5N1 HPAI-vira anvendt som eksempel. For at opnå immunsera, der anvendes i assays, valgte denne protokol HA-proteinet, der stammer fra TH-stammen, som immunogen til immunisering af mus.
Protocol
Representative Results
Discussion
HEK293FT celler bruges normalt som emballageceller til fremstilling af pseudovirus. Regelmæssig mycoplasma-detektion er afgørende under cellekulturen. Mycoplasma-kontaminering kan drastisk reducere pseudovirusudbyttet og nogle gange tæt på nul. Sammenlignet med andre kontamineringer fører mycoplasmakontamineringer ikke til ændringer i pH-værdien eller turbiditet af cellekulturmediet. Selv en høj koncentration af mycoplasma er ikke synlig med blotte øjne eller under et mikroskop. Tre populære metoder til mycopla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af forskningsbevillinger fra Innovation Capacity Building Project of Jiangsu-provinsen (BM2020019), Shenzhen Scientific and Technological Project (nr. JSGG20200225150702770), strategisk prioriteret forskningsprogram fra det kinesiske videnskabsakademi (XDB29030103), Guangdong videnskabelige og teknologiske projekt (nr. 2020B1111340076) og Shenzhen Bay Laboratory Open Research Program (nr. SZBL202002271003).
Materials
| 1% Chiken Erythrocyte | Bio-channel | BC-RBC-C001 | Reagent |
| 96-well cell culture plates (flat-bottom) | Thermo fisher scientific | 167008 | consumable material |
| 96-well cell culture plates (round-bottom) | Thermo fisher scientific | 163320 | consumable material |
| Allegra X-15R | Beckman coulter | — | Equipment/Centrifuge |
| BD Insulin Syringes | BD | 324910 | consumable material |
| Calcium Chloride Anhydrous | AMRESCO | 1B1110-500G | Reagent |
| chloroquine diphosphate | Selleck | S4157 | Reagent |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12100-046 | Reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | Reagent |
| HEK293FT | Gibco | R700-07 | Cell line |
| HEPES FREE ACID | AMRESCO | 0511-250G | Reagent |
| HIV-1 p24 Antigen ELISA | ZeptoMetrix | 801111 | Reagent kit |
| Luciferase Assay System Freezer Pack | Promega | E4530 | Reagent kit |
| MDCK.1 | ATCC | CRL-2935 | Cell line |
| Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo fisher scientific | 509-GRD-Q | consumable material |
| Nunc Conical Centrifuge Tubes 15 mL | Thermo fisher scientific | 339650 | consumable material |
| Nunc Conical Centrifuge Tubes 50 mL | Thermo fisher scientific | 339652 | consumable material |
| Nunc EasYFlask 75 cm2 | Thermo fisher scientific | 156499 | consumable material |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Reagent |
| Pipette Tips (10 μL) | Thermo fisher scientific | TF102-10-Q | consumable material |
| Pipette Tips (100 μL) | Thermo fisher scientific | TF113-100-Q | consumable material |
| Pipette Tips (1000 μL) | Thermo fisher scientific | TF112-1000-Q | consumable material |
| Serological pipets (5 mL) | Thermo fisher scientific | 170355N | consumable material |
| Serological pipets (10 mL) | Thermo fisher scientific | 170356N | consumable material |
| Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-072 | Reagent |
| Varioskan Flash | Thermo fisher scientific | — | Equipment/Microplate reader |
| Water Jacket Incubator | Thermo fisher scientific | 3111 | Equipment/Cell incubator |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | 57-33-0 | Reagent |
References
- Wang, G., et al. DNA prime and virus-like particle boost from a single H5N1 strain elicits broadly neutralizing antibody responses against head region of h5 hemagglutinin. The Journal of Infectious Diseases. 209 (5), 676-685 (2014).
- Wang, G., Yin, R., Zhou, P., Ding, Z. Combination of the immunization with the sequence close to the consensus sequence and two DNA prime plus one VLP boost generate H5 hemagglutinin specific broad neutralizing antibodies. Plos One. 12 (5), 0176854 (2017).
- Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses. Reviews in Medical Virology. 28 (1), 1963 (2018).
- Duvergé, A., Negroni, M. Pseudotyping lentiviral vectors: When the clothes make the virus. Viruses. 12 (11), 1311 (2020).
- Carnell, G. W., Ferrara, F., Grehan, K., Thompson, C. P., Temperton, N. J. Pseudotype-based neutralization assays for influenza: A systematic analysis. Frontiers in Immunology. 6 (161), (2015).
- Trombetta, C., Perini, D., Mather, S., Temperton, N., Montomoli, E. Overview of serological techniques for influenza vaccine evaluation: Past, present and future. Vaccines. 2 (4), 707-734 (2014).
- Wei, C. J., et al. Next-generation influenza vaccines: opportunities and challenges. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (4), 239-252 (2020).
- Krammer, F., et al. Influenza. Nature Reviews Disease Primers. 4 (3), (2018).
- Wei, C. J., et al. Induction of broadly neutralizing H1N1 influenza antibodies by vaccination. Science. 27 (329), 1060-1064 (2010).
- Chernov, V. M., Chernova, O. A., Sanchez-Vega, J. T., Kolpakov, A. I., Ilinskaya, O. N. Mycoplasma contamination of cell cultures vesicular traffic in bacteria and control over infectious agents. Acta Naturae. 6 (3), 41-51 (2014).
- Michael, R. G., Joseph, S. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , (2012).
- Kumar, P., Nagarajan, A., Uchil, P. D. Transfection of mammalian cells with calcium phosphate-DNA coprecipitates. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (10), (2019).
- Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. Calcium phosphate transfection. Current Protocols in Molecular Biology. 9, (2003).
- Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. Transfection of DNA into eukaryotic cells. Current Protocols in Molecular Biology. 9, 11-19 (1996).
- Kachkin, D. V., Khorolskaya, J. I., Ivanova, J. S., Rubel, A. A. An efficient method for isolation of plasmid DNA for transfection of mammalian cell cultures. Methods and Protocols. 3 (4), 69 (2020).
- . Luciferase assay system Available from: https://www.promega.com.cn/products/luciferase-assays/reporter-assays/luciferase-assay-system (2021)
- . Corning 96-Well Solid Black or White Polystyrene Microplates Available from: https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates (2021)
