Fremstilling av pseudotypede H5 fugleinfluensavirus med kalsiumfosfattransfeksjonsmetode og måling av antistoffnøytraliserende aktivitet
Summary
Her beskriver vi en protokoll for pseudovirusemballasje og måling av antistoffnøytraliserende aktivitet.
Abstract
Siden 1996 har A/goose/Guangdong/1/96-line høypatogen fugleinfluensa (HPAI) H5-virus forårsaket influensautbrudd hos fjørfe og ville fugler. Av og til blir mennesker også offer for det, noe som resulterer i høy dødelighet. Likevel blir HPAI-virusforskning ofte hindret, med tanke på at det må håndteres innenfor biosikkerhetsnivå 3-laboratorier. For å løse dette problemet blir pseudovirus vedtatt som et alternativ til villtypevirus i noen eksperimenter av H5 HPAI-studier. Pseudovirus viser seg å være de ideelle verktøyene for å studere nøytraliserende antistoffer mot H5 HPAI-virus. Denne protokollen beskriver prosedyrene og kritiske trinnene for H5 HPAI-pseudoviruspreparater og pseudovirusnøytraliseringsanalyser. Den diskuterer også feilsøking, begrensning og modifikasjoner av disse analysene.
Introduction
Siden 1996 har A/goose/Guangdong/1/96-lineage høypatogen aviær influensa (HPAI) H5-virus forårsaket kontinuerlige influensautbrudd hos fjærfe og ville fugler, og står for enorme sosioøkonomiske tap i den globale fjærfeindustrien. Noen ganger blir mennesker også smittet med det, med en høy dødelighet 1,2. Imidlertid er HPAI-virusforskning ofte hindret, gitt at det ikke kan håndteres utenfor biosikkerhetsnivå 3-laboratorier. For å løse dette problemet blir pseudovirus vedtatt som et alternativ til villtypevirus i noen eksperimenter av H5 HPAI-studier. Pseudovirus er trygge nok til å praktisere i biosikkerhetsnivå 2 laboratorier.
H5 HPAI-pseudovirus tilhører kimære virus som består av surrogatviruskjerner, lipidkonvolutter med overflateglykoproteiner fra influensavirus og reportergener. Pseudoviruskjerner er vanligvis avledet fra lentiviralt humant immunsviktvirus (HIV), retrovirus som murine leukemivirus (MLV) og vesikulær stomatittvirus (VSV)3. Spesielt er HIV-1-emballasjesystemet mye brukt til å produsere influensapseudovirus, hvor de primære genene som tilbys er gag og pol. HIV gag genet uttrykker kjerneproteiner. Pol-genet uttrykker integrasen og revers transkriptase, som begge er nødvendige for ekspresjonen av reportergenet i transduserte celler. Ved å etterligne genomet til surrogatviruset, blir reportergenet omfavnet i pseudoviruskjernen i RNA-form. Reportergenet vil uttrykke proteinet i vertsceller. Genuttrykksnivåene til reportergener kan brukes til å måle pseudovirusinfeksjonseffektivitet 3,4. Den primære reporteren er firefly luciferase for å måle de relative luminescensenhetene (RLU) eller relativ luciferaseaktivitet (RLA) i transduserte celler. Andre reportere som lacZ, Gaussia og Renilla luciferase brukes også, bare i mindre grad5.
Pseudovirus er ideelle verktøy for å studere nøytraliserende antistoffer mot H5 HAPI-virus. For å måle den nøytraliserende antistoffpotensen brukes pseudovirusnøytralisering (PN) analyser6. Hemagglutinin (HA) og neuraminidase (NA) er glykoproteiner på overflaten av influensa A-viruset 7,8. HA består av et kulehodedomene for reseptorbinding og et stammedomene for membranfusjon. NA-proteinet har sialidaseaktiviteten for å lette virusfrigjøring 7,8. En PN-analyse kan måle nøytraliserende antistoffer rettet mot HA-proteiner. Nøytraliserende antistoffer rettet mot hode- og stammeregionen av hyaluronsyre kan også påvises ved virale feste- og inngangsanalyser. Sammenlignet med villtypevirus har pseudovirusnøytraliseringseksperimenter mer følsomme deteksjonsverdier, kan håndteres trygt i et nivå 2 biosikkerhetslaboratorium, og er generelt lettere å betjene i praksis.
Denne protokollen presenterer i detalj prosedyrene og kritiske trinnene i H5 HPAI-pseudoviruspreparater og PN-analyser. Den diskuterer også feilsøking, begrensning og modifikasjoner av disse analysene. I denne studien ble A/Thailand/1(KAN)-1/2004(TH)-stammen fra H5N1 HPAI-virus brukt som eksempel. For å oppnå immunsera som brukes i analyser, valgte denne protokollen HA-proteinet som stammer fra TH-stammen som immunogen for å immunisere mus.
Protocol
Representative Results
Discussion
HEK293FT celler brukes vanligvis som pakkeceller for å produsere pseudovirus. Regelmessig mykoplasmadeteksjon er viktig under cellekulturen. Mycoplasma forurensning kan drastisk redusere pseudovirus utbytter og noen ganger nær null. Sammenlignet med andre forurensninger fører mykoplasmakontaminasjoner ikke til endringer i pH-verdien eller turbiditet i cellemediet. Selv en høy konsentrasjon av mykoplasma er ikke synlig med blotte øyne eller under et mikroskop. Tre populære metoder for mykoplasmadeteksjon er mykoplas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av forskningsmidler fra Innovation Capacity Building Project of Jiangsu-provinsen (BM2020019), Shenzhen Scientific and Technological Project (nr. JSGG20200225150702770), strategisk prioritert forskningsprogram for Det kinesiske vitenskapsakademiet (XDB29030103), Guangdong vitenskapelig og teknologisk prosjekt (nr. 2020B1111340076) og Shenzhen Bay Laboratory Open Research Program (nr. SZBL202002271003).
Materials
| 1% Chiken Erythrocyte | Bio-channel | BC-RBC-C001 | Reagent |
| 96-well cell culture plates (flat-bottom) | Thermo fisher scientific | 167008 | consumable material |
| 96-well cell culture plates (round-bottom) | Thermo fisher scientific | 163320 | consumable material |
| Allegra X-15R | Beckman coulter | — | Equipment/Centrifuge |
| BD Insulin Syringes | BD | 324910 | consumable material |
| Calcium Chloride Anhydrous | AMRESCO | 1B1110-500G | Reagent |
| chloroquine diphosphate | Selleck | S4157 | Reagent |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12100-046 | Reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | Reagent |
| HEK293FT | Gibco | R700-07 | Cell line |
| HEPES FREE ACID | AMRESCO | 0511-250G | Reagent |
| HIV-1 p24 Antigen ELISA | ZeptoMetrix | 801111 | Reagent kit |
| Luciferase Assay System Freezer Pack | Promega | E4530 | Reagent kit |
| MDCK.1 | ATCC | CRL-2935 | Cell line |
| Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo fisher scientific | 509-GRD-Q | consumable material |
| Nunc Conical Centrifuge Tubes 15 mL | Thermo fisher scientific | 339650 | consumable material |
| Nunc Conical Centrifuge Tubes 50 mL | Thermo fisher scientific | 339652 | consumable material |
| Nunc EasYFlask 75 cm2 | Thermo fisher scientific | 156499 | consumable material |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Reagent |
| Pipette Tips (10 μL) | Thermo fisher scientific | TF102-10-Q | consumable material |
| Pipette Tips (100 μL) | Thermo fisher scientific | TF113-100-Q | consumable material |
| Pipette Tips (1000 μL) | Thermo fisher scientific | TF112-1000-Q | consumable material |
| Serological pipets (5 mL) | Thermo fisher scientific | 170355N | consumable material |
| Serological pipets (10 mL) | Thermo fisher scientific | 170356N | consumable material |
| Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-072 | Reagent |
| Varioskan Flash | Thermo fisher scientific | — | Equipment/Microplate reader |
| Water Jacket Incubator | Thermo fisher scientific | 3111 | Equipment/Cell incubator |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | 57-33-0 | Reagent |
References
- Wang, G., et al. DNA prime and virus-like particle boost from a single H5N1 strain elicits broadly neutralizing antibody responses against head region of h5 hemagglutinin. The Journal of Infectious Diseases. 209 (5), 676-685 (2014).
- Wang, G., Yin, R., Zhou, P., Ding, Z. Combination of the immunization with the sequence close to the consensus sequence and two DNA prime plus one VLP boost generate H5 hemagglutinin specific broad neutralizing antibodies. Plos One. 12 (5), 0176854 (2017).
- Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses. Reviews in Medical Virology. 28 (1), 1963 (2018).
- Duvergé, A., Negroni, M. Pseudotyping lentiviral vectors: When the clothes make the virus. Viruses. 12 (11), 1311 (2020).
- Carnell, G. W., Ferrara, F., Grehan, K., Thompson, C. P., Temperton, N. J. Pseudotype-based neutralization assays for influenza: A systematic analysis. Frontiers in Immunology. 6 (161), (2015).
- Trombetta, C., Perini, D., Mather, S., Temperton, N., Montomoli, E. Overview of serological techniques for influenza vaccine evaluation: Past, present and future. Vaccines. 2 (4), 707-734 (2014).
- Wei, C. J., et al. Next-generation influenza vaccines: opportunities and challenges. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (4), 239-252 (2020).
- Krammer, F., et al. Influenza. Nature Reviews Disease Primers. 4 (3), (2018).
- Wei, C. J., et al. Induction of broadly neutralizing H1N1 influenza antibodies by vaccination. Science. 27 (329), 1060-1064 (2010).
- Chernov, V. M., Chernova, O. A., Sanchez-Vega, J. T., Kolpakov, A. I., Ilinskaya, O. N. Mycoplasma contamination of cell cultures vesicular traffic in bacteria and control over infectious agents. Acta Naturae. 6 (3), 41-51 (2014).
- Michael, R. G., Joseph, S. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , (2012).
- Kumar, P., Nagarajan, A., Uchil, P. D. Transfection of mammalian cells with calcium phosphate-DNA coprecipitates. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (10), (2019).
- Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. Calcium phosphate transfection. Current Protocols in Molecular Biology. 9, (2003).
- Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. Transfection of DNA into eukaryotic cells. Current Protocols in Molecular Biology. 9, 11-19 (1996).
- Kachkin, D. V., Khorolskaya, J. I., Ivanova, J. S., Rubel, A. A. An efficient method for isolation of plasmid DNA for transfection of mammalian cell cultures. Methods and Protocols. 3 (4), 69 (2020).
- . Luciferase assay system Available from: https://www.promega.com.cn/products/luciferase-assays/reporter-assays/luciferase-assay-system (2021)
- . Corning 96-Well Solid Black or White Polystyrene Microplates Available from: https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates (2021)
