मल्टीपैमीटर ऑप्टोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म का उपयोग करके कैल्शियम आई आमद और एचआईवी-1 संक्रमण का एकल-सेल लक्षण वर्णन
Summary
यहां, हम एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जिसमें एक नैनोफ्लुइडिक डिवाइस पर तीव्र घटनाओं और उत्पादक एचआईवी-1 संक्रमण के लिए एकल कोशिकाओं की निगरानी की जाती है। इमेजिंग डेटा वायरस-होस्ट रिसेप्टर इंटरैक्शन और सिग्नलिंग पाथवे डायनामिक्स को परिभाषित करता है। यह नैनोफ्लुइडिक हाई-थ्रूपुट देशांतर एकल-कोशिका संस्कृति और इमेजिंग के लिए सिग्नलिंग काइनेटिक्स और आणविक बातचीत का अध्ययन करने के लिए पहली विधि है।
Abstract
एचआईवी-1 एक पुराने संक्रमण का कारण बनता है जो दुनिया भर में 37 मिलियन से अधिक लोगों को प्रभावित करता है। मानव इम्यूनोडेफिशिएंसी वायरस (एचआईवी) के साथ रहने वाले लोग एंटीरेट्रोवाइरल थेरेपी के बावजूद पुरानी सूजन से संबंधित कोमोर्बिडिटी का अनुभव करते हैं। हालांकि, इन भड़काऊ सिग्नलिंग को पूरी तरह से विशेषता नहीं दी गई है। सेलुलर सिग्नलिंग घटनाओं और डाउनस्ट्रीम जीन अभिव्यक्ति की सक्रियता पर प्रारंभिक प्रवेश घटनाओं की भूमिका एकल कोशिका स्तर पर कब्जा नहीं किया गया है । यहां लेखक एक ऐसी विधि का वर्णन करते हैं जो लाइव-सेल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के सिद्धांतों को एक स्वचालित एकल-सेल प्लेटफॉर्म पर लागू करती है जो उपयोगकर्ता-अनुकूलित समय पाठ्यक्रमों पर संस्कृतियों और छवियों की कोशिकाओं को संसाधित करती है, जिससे गतिशील सेलुलर प्रक्रियाओं के उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण की अनुमति होती है। यह परख जल्दी घटनाओं की एकल कोशिका लाइव फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी को ट्रैक कर सकती है जो तुरंत एचआईवी-1 संक्रमण का पालन करती है, विशेष रूप से कैल्शियम की आमद जो वायरस के संपर्क में आती है और फ्लोरोसेंट रिपोर्टर वायरस का उपयोग करके उत्पादक संक्रमण के विकास के साथ होती है। एमटी-4 कोशिकाओं को कैल्शियम के प्रति संवेदनशील डाई से भरा जाता है और एक नैनोफ्लुइडिक डिवाइस पर अलग कलम में सुसंस्कृत किया जाता है। सुसंस्कृत कोशिकाएं एचआईवी-1 रिपोर्टर वायरस (एचआईवी-1 एनएलसीआई) से संक्रमित होती हैं । नैनोफ्लुइडिक डिवाइस के ऊपर स्थित एक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप तीव्र एचआईवी-1 एक्सपोजर के बाद 8-मिनट के समय पाठ्यक्रम पर कैल्शियम की आमद को मापता है। एचआईवी-1 उत्पादक संक्रमण एक 4 दिन के अंतराल पर उन ही कोशिकाओं में मापा जाता है । इन समय पाठ्यक्रमों से इमेजिंग डेटा वायरस-मेजबान रिसेप्टर इंटरैक्शन और सिग्नलिंग मार्ग गतिशीलता को परिभाषित करने के लिए विश्लेषण किया जाता है। लेखक एकल-सेल छंटाई, संस्कृति, इमेजिंग और सॉफ्टवेयर स्वचालन में सक्षम उपन्यास ऑप्टोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म का उपयोग करके पारंपरिक इमेजिंग विधियों के लिए एक एकीकृत, स्केलेबल विकल्प प्रस्तुत करते हैं। यह परख विभिन्न परिस्थितियों में घटनाओं की गतिज को माप सकती है, जिसमें कोशिका प्रकार, एगोनिस्ट या विरोधी प्रभाव शामिल हैं, जबकि मापदंडों की एक सरणी को मापने के लिए। यह नैनोफ्लुइडिक हाई-थ्रूपुट देशांतर एकल-कोशिका संस्कृति और इमेजिंग के लिए पहली स्थापित विधि है: इस तकनीक को सेलुलर सिग्नलिंग काइनेटिक्स और गतिशील आणविक बातचीत का अध्ययन करने के लिए मोटे तौर पर अनुकूलित किया जा सकता है।
Introduction
पुरानी सूजन एचआईवी से जुड़ी प्रारंभिक रुग्णता और मृत्यु दर का एक प्रमुख कारण है1,2,3. ऐसे कई तंत्र हैं जिनके कारण एचआईवी भड़काऊ संकेतों को सक्रिय कर सकता है, और हाल के साक्ष्य एचआईवी प्रवेश में पी 2एक्स रिसेप्टर्स के लिए एक भूमिका का सुझाव देते हैं जो कैल्शियम-गेटिंग एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) रिसेप्टर्स3,4,5,6,7,8,9,10हैं। प्यूरिनेर्जिक रिसेप्टर्स (पी2Xआर) का पी2एक्स उपप्रकार इस सूजन के महत्वपूर्ण सुविधाप्रदाताओं हो सकता है। हालांकि, एचआईवी-P2XR इंटरैक्शन के आणविक तंत्र काफी हद तक अज्ञात हैं और जल्दी और देर से एचआईवी-1 वायरल जीवन चक्र चरणों को प्रभावित कर सकते हैं। एचआईवी से जुड़े पुरानी सूजन ड्राइविंग रास्तों और काइनेटिक्स को परिभाषित एचआईवी के साथ लोगों के लिए उपचार के विकल्प को आगे बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण है ।
यह आकलन करने के लिए कि क्या एचआईवी-1 सीधे P2X रिसेप्टर्स, P2XR सक्रियण और एचआईवी-1 संक्रमण को समानांतर रूप से मापा जाना चाहिए । P2XR गतिविधि और एचआईवी-1 संक्रमण के परख स्वतंत्र रूप से स्थापित किया गया है: सेलुलर कैल्शियम बाढ़ P2XR सक्रियण का एक संकेतक है, और एचआईवी-1 उत्पादक संक्रमण आरएनए बहुतायत द्वारा निर्धारित किया जा सकता है । फ्लोरेसेंस का पता लगाना फ्लोरो-4 कैल्शियम-सेंसिटिव डाई के साथ संभव है, और एचआईवी-1 संक्रमण की कल्पना म्हेरी फ्लोरोसेंट रिपोर्टर वायरसएचआईवी-एनएलसीआई 11,12,13,14, 15के साथ की जा सकती है।
क्योंकि P2X सक्रियण (तीव्र सेलुलर कैल्शियम आमद) और एचआईवी-1 संक्रमण (एचआईवी-1 आरएनए संश्लेषण) के ये संकेतक विभिन्न टाइमस्केल (मिनट बनाम दिन) पर होते हैं, इसमें एक उच्च थ्रूपुट विधि का अभाव है जो P2XR सक्रियण और एचआईवी-1 संक्रमण के युग्मित विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। प्रवाह साइटोमेट्री जैसी मानक उच्च-थ्रूपुट प्रयोगात्मक तकनीकें जनसंख्या विश्लेषण के लिए अनुमति देती हैं, लेकिन एकल कोशिकाओं में तीव्र और देशांतर घटनाओं के बीच संबंधों का आकलन नहीं कर सकतीं। वैकल्पिक रूप से, मानक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के साथ एकल-सेल इमेजिंग कम थ्रूपुट है। ये प्रयोगात्मक सीमाएं सीधे तीव्र और देशांतर सेलुलर घटनाओं के बीच संघों को मापने के लिए उपन्यास, उच्च-थ्रूपुट तकनीकों की आवश्यकता प्रस्तुत करती हैं।
वर्णित एक ऑप्टोफ्लुइडिक सिस्टम एक उपन्यास मंच है जो एकल-कोशिका छंटाई और अलगाव, संस्कृति, इमेजिंग और सॉफ्टवेयरस्वचालन16, 17,18,19में सक्षम है। यह प्रणाली पारंपरिक इमेजिंग विधियों की सीमाओं के लिए एक एकीकृत, उच्च थ्रूपुट विकल्प प्रस्तुत करती है। बीकन प्लेटफॉर्म में कार्बन डाइऑक्साइड (सीओ2)और तापमान नियंत्रित इनक्यूबेटर होता है जो चिप पर निहित कोशिकाओं का समर्थन करता है। चिप में फोटोसेंसिटिव ट्रांजिस्टर होते हैं जो लक्षित प्रकाश के जवाब में विद्युत ढाल उत्पन्न करते हैं। इसके परिणामस्वरूप डाइइलोथ्रोपोरेटिक बल का उपयोग नैनोफ्लुइडिक चिप में व्यक्तिगत कोशिकाओं को वांछित क्षेत्रों में ले जाने के लिए किया जाता है। कोशिकाओं को चिप पर कलम में हल किया जाता है, जो व्यक्तिगत कोशिकाओं को शारीरिक रूप से अलग करने के लिए एक बाधा प्रदान करते हैं । चिप भर में विकास मीडिया के निरंतर laminar प्रवाह कलम से सेल प्रवास रोकता है, जबकि पोषक तत्वों और प्रयोग विशिष्ट अभिकर्मकों के छोटे कण प्रसार के लिए अनुमति देता है । एक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप चिप के ऊपर बैठता है। सॉफ्टवेयर स्वचालन का उपयोग उपयोगकर्ता-निर्दिष्ट समय बिंदु पर चिप की छवियों को कैप्चर करने के लिए किया जाता है।
सभी सेल लक्षण वर्णन एकल सेल चयन और हेरफेर के लिए एक ऑप्टोफ्लुइड सिस्टम का उपयोग करके किया गया था। इस प्रणाली में एकीकृत यांत्रिक, माइक्रोफ्लुइडिक और ऑप्टिकल घटक होते हैं जो एकल-कोशिका हेरफेर, परख, संस्कृति और इमेजिंग को सक्षम करते हैं। कोशिकाओं को डिस्पोजेबल नैनोफ्लुइडिक डिवाइस पर लोड और सुसंस्कृत किया जाता है जिसमें 3,500 व्यक्तिगत कक्ष (कलम) होते हैं, प्रत्येक उप-नैनोलीटर मात्रा रखने में सक्षम होता है। कोशिकाओं को प्रकाश-प्रेरित डाइइलेक्टोफोरेटिक “पिंजरों” का उपयोग करके कलम के भीतर तैनात किया जा सकता है और तापमान के तहत सुसंस्कृत-और सीओ2-नियंत्रितस्थितियों । माइक्रोफ्लुइडिक्स सेल कल्चर या ड्रग ट्रीटमेंट के लिए चिप पर मीडिया या बफ़र्स के परफ्यूजन की इजाजत देते हैं । एक एक्ट्यूएटेड सुई इनक्यूबेटेड और बंद अच्छी प्लेटों से कोशिकाओं के आयात और निर्यात के लिए अनुमति देता है। चिप क्षेत्र को सेलुलर फेनोटाइप या कार्यात्मक विश्लेषण की विशेषता के लिए ब्राइटफील्ड और फ्लोरोसेंट चैनलों (डीएपीआई, फिटसी, टेड, या Cy5 सहित) में 4x या 10x आवर्धन पर चित्रित किया जा सकता है। पूरी प्रणाली सॉफ्टवेयर का उपयोग करके स्वचालित है जिसका उपयोग प्रीडिजाइन किए गए वर्कफ़्लो या कस्टम प्रयोगों के लिए किया जा सकता है।
एचआईवी-1 संक्रमण और P2XR के बीच संबंधों का अध्ययन किया गया है, लेकिन समानांतर में इन बातचीत को सीधे चित्रित करने के लिए एक उच्च थ्रूपुट प्रक्रिया की सूचना नहीं दी गई है । यहां, लेखकों को एक पद्धति का वर्णन करने के लिए तीव्र कैल्शियम बाढ़ और बाद में एचआईवी-1 एकल कोशिका के स्तर पर उत्पादक संक्रमण ट्रैकिंग के माध्यम से एचआईवी-P2XR बातचीत का अध्ययन । विशेष रूप से, यह एक उपन्यास उपकरण स्थापित करता है जो एकल कोशिकाओं में कई लक्ष्यों के प्रत्यक्ष, उच्च-थ्रूपुट, देशांतर माप की अनुमति देता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
एकल कोशिकाओं में कैल्शियम की आमद और एचआईवी-1 उत्पादक संक्रमण के बीच संबंधों का अध्ययन करने के लिए वर्णित पद्धति को अन्य पीड़ावादियों या ब्याज के विरोधी के जवाब में इंट्रासेलुलर कैल्शियम काइनेटिक्स क?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम डॉ बेंजामिन चेन के साथ वैज्ञानिक चर्चाओं के लिए आभारी हैं । इस काम को K08AI120806 (THS), R01DA052255 (THS और KB), और R21AI152833 (THS और KB) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| Beacon Optofluidic System | Berkeley Lights | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | ||
| FIJI | Open-source software | PMID: 22743772, 22930834 | |
| Fluo-4 Calcium Imaging Kit | Thermo Fisher | F10489 | |
| HIV-1 NLCINL4-3 | Laboratory of Benjamin Chen | PMID: 28148796 | |
| Hyclone Pennecillin Streptomycin solution | GE Healthcare Life sciences | SV30010 | |
| MT-4 cells | NIH AIDS Reagent | ARP-120 | |
| OptoSelect 3500 chip | Berkeley Lights | ||
| Pipettor Tips | Denville Scientific | P3020-CPS | |
| Prism 9.0.0 | GraphPad | ||
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Serological Pipettes | Fisher Brand | 13-678-11E | |
| Tissue Culture Hood | Various models | ||
| T75 flasks | Corning | 3073 | |
References
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