Salivkörtlar har föreslagits som en vävnad mål plats för genterapi, särskilt inom området vaccination genom genöverföring. Vi visar gen leverans i en icke-mänskliga primat modell med retrograd parotid infusion.
Salivkörtlar är ett attraktivt vävnadsmål för genterapi med lovande resultat som redan leder till mänskliga prövningar. De är i sig kapabla att utsöndra proteiner i blodomloppet och är lättillgängliga, vilket gör dem potentiellt överlägsna vävnadsplatser för substitutionshormonproduktion eller vaccination genom genöverföring. Föreslagna metoder för gen leverans inkluderar transkutan injektion och bakåtsträvande infusion genom salivary kanaler. Vi visar hur man utför retrograd salivary gland infusion (RSGI) i icke-mänskliga primater. Vi beskriver de viktiga anatomiska landmärken inklusive identifiering av parotid papilla, en atraumatic metod för cannulating och tätning Stensens kanal med hjälp av grundläggande tandverktyg, polyeten slangar och cyanoakrylat och lämplig infusionshastighet. Även om detta är den minst traumatiska leveransmetoden, är metoden fortfarande begränsad av volymen som kan levereras (<0,5 ml) och risken för trauma till kanalen och körteln. Vi visar med fluoroskopi att en infusat kan levereras helt i körteln, och ytterligare visa genom immunohistokemi transduktion av en typisk vektor och uttryck av den levererade genen.
Medan salivkörtlar är kända för sin exokrina produktion av saliv, har forskare länge erkänt sin förmåga att utsöndra proteiner direkt i blodomloppet1, vilket gör dem till ett potentiellt mål för genterapi för systemisk administrering, såsom ersättningshormoner eller antikroppsproduktion. Faktum är att salivkörtlar erbjuder flera fördelar jämfört med andra vävnadsmål, såsom den inneboende förmågan att producera proteiner för utsöndring (en egenskapsmuskler saknar), tung inkapsling som kan begränsa vektorspridning och väl differentierad vävnad som ger stabilitet för icke-integrerande vektorer. Dessutom, i händelse av en allvarlig biverkning, salivkörtlar är inte kritiska för livet och kan kirurgiskt avlägsnas. Även om de inte är omedelbart intuitiva, är parotidkörtlar också lättillgängliga från munnen genom deras huvudsakliga utsöndringskanal, Stensens kanal2.
Med tanke på fördelarna med salivvävnad för genterapi ökar intresset för att utforska detta vävnadsmål. Många studier har redan utförts på gnagare, hund och icke-mänskliga primatmodeller och minst en mänsklig klinisk prövning pågår3,4,5. För att ytterligare utforska och utveckla nyttan av detta vävnadsmål för genterapiändamål måste fler icke-mänskliga primatstudier utföras. Detta dokument beskriver en metod för att komma åt parotidkörtlarna genom Stensens kanal för att leverera en vektorerad gen för transduktion i den icke-mänskliga primatmodellen. För att synligt visa leveransen av infusate och anatomin av kanalen när den kommer in i körteln, fluoroskopi med hjälp av radiocontrast utfördes. För att visa framgångsrik transduktion av en vektor användes en Adenovirus serotyp 5 (Ad5) vektored egfp gen. Ad5 är en välbeskriven vektor som kan omvandla salivvävnad. Även om det är för immunogent för ultimat klinisk användning, valdes en Ad5 vektor för denna demonstrationsstudie för att säkerställa effektiv transduktion. Att utvärdera förbättrad grön fluorescerande protein (EGFP) produktion är en väl beskriven metod för att visa framgångsrik transkription och översättning av en vektor gen efter transduktion och gjordes här.
Här beskriver vi ett protokoll om bakåtsträvande infusion i parotidkörteln genom Stensens kanal. Den beskrivna metoden ger vägledning som potentiellt kan användas av forskare som utforskar nyttan av salivvävnad som en plats för genterapi och andra applikationer.
Det finns flera kritiska steg för att säkerställa att proceduren blir framgångsrik. Först och främst bör alla förfarandemässiga steg slutföras varsamt. Kraftfull bracing av munnen kan resultera i mandibular subluxatio…
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Cagney Gentry för hans audiovisuella stöd för att filma förfarandet. Vi vill också uppmärksamma Hefner VA medical center för akademiskt stöd i jakten på detta projekt.
500 µL U100 syringes with 30-gauge needles | Becton Dickinson | 328466 | fixed needle for less waste |
Adhesive (e.g., Ethicon Dermabond) | Various | Cyanoacrylate adhesive to seal and keep the tubing in the duct during infusion. | |
Atropine injectable solution | Patterson Veterinary | 07 869-6061 | Atropine inj. 0.54 mg/mL |
BD Ultra-Fine Insulin Syringes 30G | Walmart | N/A | Avilable in 0.5 mL and 1.0 mL sizes. |
Cyanoacrylate (medical glue) | Ethicon | DNX12 | Dermabond topical skin adhesive |
Dental loops with light | Amazon (DDP) | B012M3IV80 | Used to enhance visualization of Stensen's duct papilla |
Infant Lacrimal Dilator | Surgipro | SPOI-137 | |
Ketamine injectable solution | Patterson Veterinary | 07-803-6637 | Ketaset inj. 100 mg/mL |
Lacrimal Dilator | Surgipro | SPOI-132 | Used to dialate the Stensen's duct. |
Midazolam injectable solution | Patterson Veterinary | 07 890-6698 | Midazolam inj. 5mg/mL |
Pair of scissors | Amazon (DDP) | N/A | Used to cut PET10 tube |
Polyethylene Tubing (PE-10) | Scientific Comodities, Inc | BB31695-PE/1 | Tubing connecting the 30G syringe and inserted into the duct. |
Q-tips | Walmart | N/A | Used to spread cyanoacrylate on the cheek |
Size 10 Polyethylene Tube (PET 10) | Scientific Commodities | BB31695-PE/1 | low density polyethylene tubing |
Small Animal Mouth Opener | Amazon (DDP) | B01F3LVJXC | Used to keep the animal's mouth open. |
Tweezers | Amazon (DDP) | N/A | Used to insert PET10 tube into Stenson's duct |
Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 7646-86-7 | Included in plasmid DNA infusates |