Infusione retrograda della ghiandola parotide attraverso il dotto di Stensen in un primate non umano per la consegna di geni vettoriali
Summary
Le ghiandole salivari sono state proposte come sito bersaglio tissutale per la terapia genica, specialmente nell’area della vaccinazione mediante trasferimento genico. Dimostriamo la consegna genica in un modello di primate non umano utilizzando l’infusione retrograda di parotidi.
Abstract
Le ghiandole salivari sono un bersaglio tissutale attraente per la terapia genica con risultati promettenti che già portano a studi sull’uomo. Sono intrinsecamente in grado di secernere proteine nel flusso sanguigno e sono facilmente accessibili, rendendoli siti tissutali potenzialmente superiori per la produzione di ormoni sostitutivi o la vaccinazione mediante trasferimento genico. I metodi suggeriti per la somministrazione genica includono l’iniezione transcutanea e l’infusione retrograda attraverso i dotti salivari. Dimostriamo come eseguire l’infusione retrograda delle ghiandole salivari (RSGI) in primati non umani. Descriviamo gli importanti punti di riferimento anatomici tra cui l’identificazione della papilla parotide, un metodo atraumatico di cannulazione e sigillatura del dotto di Stensen utilizzando strumenti dentali di base, tubi in polietilene e cianoacrilato e la velocità appropriata di infusione. Mentre questo è il metodo di consegna meno traumatico, il metodo è ancora limitato dal volume in grado di essere consegnato (<0,5 ml) e dal potenziale trauma al dotto e alla ghiandola. Dimostriamo usando la fluoroscopia che un infusato può essere completamente consegnato nella ghiandola e dimostriamo ulteriormente con l'immunoistochimica la trasduzione di un vettore tipico e l'espressione del gene consegnato.
Introduction
Mentre le ghiandole salivari sono ben note per la loro produzione esocrina di saliva, i ricercatori hanno da tempo riconosciuto la loro capacità di secernere proteine direttamente nel flusso sanguigno1, rendendole un potenziale bersaglio per la terapia genica per la somministrazione sistemica, come ormoni sostitutivi o produzione di anticorpi. In effetti, le ghiandole salivari offrono diversi vantaggi rispetto ad altri bersagli tissutali, come la capacità intrinseca di produrre proteine per la secrezione (una proprietà che manca ai muscoli), l’incapsulamento pesante che può limitare la diffusione del vettore e il tessuto ben differenziato che fornisce stabilità per i vettori non integranti. Inoltre, in caso di evento avverso grave, le ghiandole salivari non sono critiche per la vita e possono essere rimosse chirurgicamente. Sebbene non siano immediatamente intuitive, le ghiandole parotidi sono anche facilmente accessibili dalla bocca attraverso il loro principale dotto escretore, il dotto di Stensen2.
Dati i vantaggi del tessuto salivare per la terapia genica, c’è un crescente interesse nell’esplorare questo bersaglio tissutale. Numerosi studi sono già stati condotti in modelli di primati roditori, canini e non umani e almeno uno studio clinico umano è in corso3,4,5. Per esplorare ulteriormente e sviluppare l’utilità di questo bersaglio tissutale ai fini della terapia genica, saranno necessari ulteriori studi sui primati non umani. Questo articolo descrive un metodo per accedere alle ghiandole parotidi attraverso il dotto di Stensen per fornire un gene vettoriale per la trasduzione nel modello di primate non umano. Per dimostrare visibilmente la consegna dell’infuso e l’anatomia del dotto quando entra nella ghiandola, è stata eseguita la fluoroscopia con radiocontrasto. Per dimostrare la trasduzione riuscita di un vettore, è stato utilizzato un gene egfp vettoriale di sierotipo 5 (Ad5) adenovirus. Ad5 è un vettore ben descritto in grado di trasdurre il tessuto salivare. Sebbene sia troppo immunogenico per l’uso clinico finale, per questo studio dimostrativo è stato scelto un vettore Ad5 per assicurare una trasduzione efficiente. La valutazione della produzione di Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) è un metodo ben descritto per dimostrare il successo della trascrizione e della traduzione di un gene vettoriale dopo la trasduzione ed è stato fatto qui.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui descriviamo un protocollo di infusione retrograda nella ghiandola parotide attraverso il dotto di Stensen. La metodologia descritta offre una guida che può potenzialmente essere utilizzata dai ricercatori che esplorano l’utilità del tessuto salivare come sito per la terapia genica e altre applicazioni.
Ci sono diversi passaggi critici per garantire il successo della procedura. Innanzitutto, tutte le fasi procedurali dovrebbero essere completate delicatamente. Un rinforzo forzato della bo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vogliono ringraziare il signor Cagney Gentry per il suo supporto audiovisivo nelle riprese della procedura. Vogliamo anche riconoscere il centro medico Hefner VA per il supporto accademico nel perseguimento di questo progetto.
Materials
| 500 µL U100 syringes with 30-gauge needles | Becton Dickinson | 328466 | fixed needle for less waste |
| Adhesive (e.g., Ethicon Dermabond) | Various | Cyanoacrylate adhesive to seal and keep the tubing in the duct during infusion. | |
| Atropine injectable solution | Patterson Veterinary | 07 869-6061 | Atropine inj. 0.54 mg/mL |
| BD Ultra-Fine Insulin Syringes 30G | Walmart | N/A | Avilable in 0.5 mL and 1.0 mL sizes. |
| Cyanoacrylate (medical glue) | Ethicon | DNX12 | Dermabond topical skin adhesive |
| Dental loops with light | Amazon (DDP) | B012M3IV80 | Used to enhance visualization of Stensen's duct papilla |
| Infant Lacrimal Dilator | Surgipro | SPOI-137 | |
| Ketamine injectable solution | Patterson Veterinary | 07-803-6637 | Ketaset inj. 100 mg/mL |
| Lacrimal Dilator | Surgipro | SPOI-132 | Used to dialate the Stensen's duct. |
| Midazolam injectable solution | Patterson Veterinary | 07 890-6698 | Midazolam inj. 5mg/mL |
| Pair of scissors | Amazon (DDP) | N/A | Used to cut PET10 tube |
| Polyethylene Tubing (PE-10) | Scientific Comodities, Inc | BB31695-PE/1 | Tubing connecting the 30G syringe and inserted into the duct. |
| Q-tips | Walmart | N/A | Used to spread cyanoacrylate on the cheek |
| Size 10 Polyethylene Tube (PET 10) | Scientific Commodities | BB31695-PE/1 | low density polyethylene tubing |
| Small Animal Mouth Opener | Amazon (DDP) | B01F3LVJXC | Used to keep the animal's mouth open. |
| Tweezers | Amazon (DDP) | N/A | Used to insert PET10 tube into Stenson's duct |
| Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 7646-86-7 | Included in plasmid DNA infusates |
References
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