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Neuroscience

माउस मस्तिष्क में विवो में एन्हांसर-आधारित अभिव्यक्ति संरचनाओं की एएवी तैनाती

Published: March 31, 2022
doi:
10.3791/62650
, ,
1Department of Psychiatry and Behavioral Sciences,University of California, Davis, 2Department of Neurobiology, Physiology and Behavior,University of California, Davis

Summary

यह प्रोटोकॉल एक उपन्यास आरएएवी-आधारित क्षणिक एन्हांसर-रिपोर्टर परख का वर्णन करता है। इस परख का उपयोग माउस मस्तिष्क में विवो में एन्हांसर-संचालित अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए किया जा सकता है।

Abstract

एन्हांसर प्रतिलेखन कारकों की एक विविध सरणी के लिए बाध्यकारी मंच हैं जो ऊतक- और सेल-प्रकार-विशिष्ट जीन के विशिष्ट अभिव्यक्ति पैटर्न को चलाते हैं। गैर-कोडिंग डीएनए और विभिन्न क्रोमैटिन राज्यों का आकलन करने के कई साधन जीनोम में एन्हांसर अनुक्रमों की उपस्थिति की भविष्यवाणी करने में उपयोगी साबित हुए हैं, लेकिन इन अनुक्रमों की गतिविधि को मान्य करना और उन अंगों और विकास चरणों को ढूंढना जिनमें वे सक्रिय हैं, एक श्रम-गहन प्रक्रिया है। एडेनो से जुड़े वायरस (एएवी) वैक्टर में हालिया प्रगति ने माउस ऊतकों में ट्रांसजेन के व्यापक वितरण को सक्षम किया है, जो ट्रांसजेनिक जानवर की आवश्यकता के बिना विवो एन्हांसर परीक्षण में सक्षम है। यह प्रोटोकॉल दिखाता है कि कैसे एक रिपोर्टर निर्माण जो न्यूनतम प्रमोटर के नियंत्रण में ईजीएफपी को व्यक्त करता है, जो अपने दम पर महत्वपूर्ण अभिव्यक्ति नहीं चलाता है, का उपयोग माउस मस्तिष्क में उम्मीदवार बढ़ाने वाले अनुक्रमों के गतिविधि पैटर्न का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। एक एएवी-पैक किए गए रिपोर्टर निर्माण को माउस मस्तिष्क में पहुंचाया जाता है और 1-4 सप्ताह के लिए इनक्यूबेट किया जाता है, जिसके बाद जानवर की बलि दी जाती है, और मस्तिष्क वर्गों को माइक्रोस्कोप के तहत देखा जाता है। ईजीएफपी उन कोशिकाओं में दिखाई देता है जिनमें परीक्षण किया गया एन्हांसर जीन अभिव्यक्ति शुरू करने के लिए पर्याप्त है, उस स्थान और विकास चरण को इंगित करता है जिसमें मस्तिष्क में एन्हांसर सक्रिय होता है। मानक क्लोनिंग विधियां, कम लागत वाली एएवी पैकेजिंग, और विवो डिलीवरी और मानक इमेजिंग रीडआउट में एएवी सीरोटाइप और विधियों का विस्तार इसे मस्तिष्क में जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करने के अध्ययन के लिए एक सुलभ दृष्टिकोण बनाता है।

Introduction

एन्हांसर जीनोमिक सीआईएस-नियामक तत्व हैं जो प्रतिलेखन कारक बाध्यकारी साइटों के रूप में काम करते हैं और एक लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति को स्थानिक रूप से विशिष्ट तरीके से चला सकते हैं। वे विभिन्न सेल प्रकारों, ऊतकों और विकास के चरणों में अलग-अलग सक्रिय हैं और रोग जोखिम से संबंधित जीनोमिक भिन्नता 3,4 के सब्सट्रेट हो सकते हैं। इस प्रकार, जीनोमिक्स के भीतर ट्रांसलेशनल और बुनियादी विज्ञान अनुप्रयोगों दोनों में प्रगति के लिए एन्हांसर फ़ंक्शन की गतिशीलता को समझने की आवश्यकता महत्वपूर्ण है। एन्हांसर गतिविधि की सिलिको भविष्यवाणियां परिकल्पना उत्पन्न करने के लिए उत्कृष्ट संसाधनों के रूप में काम कर सकती हैंताकि क्षमता 5,6 को बढ़ाया जा सके। इस तरह की अनुमानित एन्हांसर गतिविधि को कार्यात्मक गतिविधि की पूरी समझ के लिए अतिरिक्त सत्यापन और पूछताछ की आवश्यकता हो सकती है। एन्हांसर रिपोर्टर परख विभिन्न प्रकार की प्रणालियों में इस उद्देश्य के लिए मूल्यवान साबित हुए हैं, कोशिकाओं से जानवरों तक 7,8,9। विवो संदर्भ में एक लचीले और लागत प्रभावी क्षणिक में इन अध्ययनों का विस्तार करने की दिशा में, यह प्रोटोकॉल प्रसवोत्तर माउस मस्तिष्क में एक अस्थानिक रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति को चलाने की उनकी क्षमता के लिए कथित एन्हांसर अनुक्रमों का परीक्षण करने के लिए विवो एएवी-आधारित विधियों के उपयोग का वर्णन करता है। विधियों के इस परिवार में एकल उम्मीदवार अनुक्रमों या समानांतर पुस्तकालय स्क्रीनिंग से पूछताछ करने के लिए उपयोगिता है और यह बुनियादी और अनुवाद अनुसंधान के लिए प्रासंगिक है।

यह विधि एक एकल प्लास्मिड में एक रिपोर्टर जीन (यहां ईजीएफपी) के साथ एक कथित एन्हांसर उम्मीदवार डीएनए अनुक्रम को जोड़ती है, जो एक न्यूनतम प्रमोटर के नियंत्रण में है जो अकेले महत्वपूर्ण अभिव्यक्ति नहीं चलाता है। प्लास्मिड को पुनः संयोजक एएवी (आरएएवी) में पैक किया जाता है और एक पशु मॉडल में इंजेक्ट किया जाता है। जबकि यहां आवेदन मस्तिष्क के लिए है, विभिन्न आरएएवी सीरोटाइप विभिन्न ऊतक प्रकारों में संक्रमण को सक्षम करते हैं ताकि इस दृष्टिकोण को अन्य प्रणालियों10 तक बढ़ाया जा सके। समय की अवधि के बाद, मस्तिष्क को रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति के लिए एकत्र और परख किया जा सकता है। नियंत्रण की तुलना में मजबूत अभिव्यक्ति इंगित करती है कि परीक्षण किए गए उम्मीदवार अनुक्रम जीन की अभिव्यक्ति को “बढ़ाने” में सक्षम था (चित्रा 1)। यह सरल डिजाइन मस्तिष्क में विवो में एन्हांसर गतिविधि के लिए एक अनुक्रम का परीक्षण करने के लिए एक आसान और स्पष्ट दृष्टिकोण प्रदान करता है।

एक अनुक्रम की एन्हांसर क्षमता के लिए परीक्षण के अलावा, इस विधि को सेल-प्रकार एन्हांसर गतिविधि निर्धारित करने के लिए तकनीकों के साथ जोड़ा जा सकता है। अंतर बढ़ाने वाली गतिविधि का निर्धारण करने के लिए अनुक्रम-आधारित दृष्टिकोणों में, डीएनए और आरएनए अनुक्रमण से पहले सेल-प्रकार-विशिष्ट मार्करों पर कोशिकाओं को छांटने से शोधकर्ताओं को यह निर्धारित करने की अनुमति मिल सकती है कि क्या विभिन्न सेल प्रकार अंतर बढ़ाने वाली गतिविधि दिखाते हैं, जैसा कि गिसेलब्रेक्ट एट अल.11 में वर्णित किया गया था। इमेजिंग-आधारित दृष्टिकोणों में, सेल-प्रकार-विशिष्ट मार्करों के साथ सह-लेबलिंग छवियां इस बात की जांच करने की अनुमति देती हैं कि क्या एन्हांसर-संचालित प्रतिदीप्ति का प्रदर्शन करने वाली कोशिकाएं 12,13,14,15,16 की रुचि के सेल-प्रकार मार्कर भी प्रदर्शित करती हैं। एन्हांसर रिपोर्टर परख एन्हांसर क्षमता पर प्रभाव के लिए एन्हांसर में जोखिम से जुड़े एलील भिन्नता के प्रत्यक्ष परीक्षण को सक्षम करता है। जीनोम-वाइड एसोसिएशन स्टडीज (जीडब्ल्यूएएस) में पहचाने गए जोखिम लोकी का विशाल बहुमत जीनोम17 के गैर-कोडिंग क्षेत्रों में निहित है। इन जोखिम लोकी के कार्यात्मक एनोटेशन अध्ययन से संकेत मिलता है कि एक बड़ा हिस्सासंभवतः 18,19,20 को बढ़ाने के रूप में कार्य करता है। विवो में एमपीआरए तैनाती मस्तिष्क12,21 में एन्हांसर गतिविधि के लिए इन जोखिम से जुड़े वेरिएंट के परीक्षण की अनुमति दे सकती है। अंत में, विभिन्न समय बिंदुओं पर वितरण और संग्रह विकास के चरणों में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं जिसके दौरान एक एन्हांसर सक्रिय होता है।

एन्हांसर-रिपोर्टर प्लास्मिड डिजाइन विविध हैं और प्रयोगात्मक लक्ष्यों के अनुरूप अनुकूलित किया जा सकता है। न्यूनतम प्रमोटरों के लिए कई विकल्प हैं जिनका उपयोग एन्हांसर अनुसंधान में किया गया है, जैसे कि मानव β-ग्लोबिन न्यूनतम प्रमोटर22 और माउस एचएसपी 68 न्यूनतम प्रमोटर23। इन प्रमोटरों को अभिव्यक्ति के निम्न स्तर को चलाने के लिए जाना जाता है जब तक कि उन्हें सक्रिय करने के लिए एक एन्हांसर तत्व के साथ युग्मित न किया जाए। इसके विपरीत, संवैधानिक प्रमोटर तत्व ट्रांसजीन की मजबूत अभिव्यक्ति को चलाते हैं, जो सकारात्मक नियंत्रण के लिए उपयोगी होता है या मजबूत अभिव्यक्ति की पृष्ठभूमि के खिलाफ एन्हांसर फ़ंक्शन के लिए परीक्षण करता है। संवैधानिक प्रमोटरों के लिए आम विकल्पों में सीएजी, चिकन β-एक्टिन प्रमोटर से प्राप्त एक हाइब्रिड प्रमोटर और साइटोमेगालोवायरस तत्काल-प्रारंभिक एन्हांसर24, या मानव ईएफ 1 –25 शामिल हैं। चूंकि एन्हांसर को द्विदिश रूप से काम करने के लिए जाना जाता है, इसलिए न्यूनतम प्रमोटर के सापेक्ष एन्हांसर का अभिविन्यास और स्थान लचीला होता है (चित्रा 2 ए)। पारंपरिक एन्हांसर-रिपोर्टर परख प्रमोटर के अपस्ट्रीम में एन्हांसर को रखते हैं और लाइब्रेरी डिलीवरी में, रिपोर्टर जीन के डाउनस्ट्रीम में एक बारकोड अनुक्रम शामिल होता है ताकि अनुक्रमण को परीक्षण किए गए एन्हांसर27 के साथ जोड़ा जा सके। हालांकि, एन्हांसर को रिपोर्टर जीन के खुले रीडिंग फ्रेम में भी रखा जा सकता है और अपने स्वयं के बारकोड अनुक्रम के रूप में काम किया जा सकता है, जैसा कि STARR-seq28 में किया गया है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल स्टार-सेक परख डिजाइन का उपयोग करता है, उम्मीदवार एन्हांसर अनुक्रम को रिपोर्टर जीन के 3 ‘यूटीआर में रखता है। जबकि STARR-seq अभिविन्यास अधिक सुव्यवस्थित क्लोनिंग का लाभ प्रदान करता है, यह पारंपरिक दृष्टिकोण की तुलना में कम अच्छी तरह से समझा जाता है और संरचनाओं के बीच परिवर्तनीय आरएनए स्थिरता को प्रेरित कर सकता है। वर्णित विधियों को आसानी से या तो STARR-seq या पारंपरिक अभिविन्यास के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जिसमें क्लोनिंग प्रक्रिया में मामूली परिवर्तन होते हैं जिन्हें कहीं और वर्णित किया गया है।

प्रयोगात्मक लक्ष्यों (चित्रा 2 बी) को फिट करने के लिए इस तकनीक को और अनुकूलित करने के लिए एएवी वितरण के विभिन्न तरीकों को नियोजित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में आगे वर्णित प्रत्यक्ष इंट्राक्रैनील इंजेक्शन, सीधे मस्तिष्क30 में वायरस की उच्च सांद्रता प्रदान करते हैं। यह इंजेक्शन की साइट पर केंद्रित एक उच्च पारगमन दक्षता देता है, जिससे यह ऊतक के एक क्षेत्र में ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं के घनत्व को अधिकतम करने के लिए प्रयोगों के लिए एक उत्कृष्ट तकनीक बन जाती है। स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य स्थानीयकृत पारगमन के लिए जानवरों में इंजेक्शन की साइट को मानकीकृत करने में मदद कर सकता है। इंट्राक्रैनील इंजेक्शन शुरुआती प्रसवोत्तर जानवरों में सबसे सरल हैं। एक वैकल्पिक तकनीक के रूप में, प्रणालीगत इंजेक्शन रक्त-मस्तिष्क बाधा 31 को पार करने में सक्षम सीरोटाइप के साथ एएवी का उपयोग करके ट्रांसजेन वितरित करसकते हैं। टेल-वेन इंजेक्शन वायरस को पूरे शरीर में प्रसारित करने की अनुमति देता है, जिससे कई ऊतकों में सामान्यीकृत वितरण सक्षम होताहै। रेट्रो-ऑर्बिटल इंजेक्शन एक और प्रणालीगत इंजेक्शन तकनीक है जो रेट्रो-ऑर्बिटल साइनस32 में आंख के पीछे वायरस पहुंचाता है। यह शिरापरक प्रणाली से मस्तिष्क तक एएवी के लिए एक अधिक सीधा मार्ग प्रदान करता है, जिसके परिणामस्वरूप मस्तिष्क में ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं की उच्च सांद्रता अधिक परिधीय रक्त वाहिकाओं में इंजेक्शन की तुलना मेंहोती है।

इस तकनीक का एक और लचीला पहलू रीडआउट की विधि है। मोटे तौर पर, विकल्पों को रिपोर्टर-आधारित या अनुक्रमण-आधारित (चित्रा 2 सी) के रूप में वर्णित किया जा सकता है। निर्माण के खुले रीडिंग फ्रेम में जीएफपी जैसे फ्लोरोसेंट रिपोर्टर को शामिल करने से किसी भी ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति होती है जहां उम्मीदवार एन्हांसर ने अभिव्यक्ति को प्रेरित किया। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री जैसी लेबलिंग और इमेजिंग तकनीक सिग्नल प्रवर्धन को सक्षम करती है। अनुक्रमण-आधारित रीडआउट तकनीकों में ऊतक से एकत्र किए गए आरएनए में वितरित निर्माण से अनुक्रमों की पहचान करना शामिल है। शुरू में वितरित किए गए वायरल डीएनए की मात्रा को निर्धारित करके, व्यक्त आरएनए बनाम वितरित डीएनए की तुलना का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है कि एक परीक्षण किया गया एन्हांसर अनुक्रम ट्रांसजेन की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति को चलाने में सक्षम था, उदाहरण के लिए, बड़े पैमाने पर समानांतर रिपोर्टर परख (एमपीआरए) के संदर्भ में। एमपीआरए एक साथ गतिविधि के लिए हजारों उम्मीदवार एन्हांसर का परीक्षण करने के लिए इन तकनीकों का एक शक्तिशाली विस्तार प्रदान करते हैं और जीनोमिक्स अनुसंधान 12,27,34,35,36 में बड़े पैमाने पर वर्णित किया गया है। व्यक्तिगत रूप से के बजाय बैच में उम्मीदवार बढ़ाने वालों के लिए क्लोनिंग, पैकेजिंग, डिलीवरी और अनुक्रमण चरणों को निष्पादित करके उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग प्राप्त की जाती है।

उम्मीदवार एन्हांसर चयन लचीलेपन के लिए एक और अवसर प्रदान करता है (चित्रा 2 डी)। उदाहरण के लिए, इस परख का उपयोग एक विशिष्ट जीन के एन्हांसर की पहचान करने के लिए किया जा सकता है, रुचि के गैर-कोडिंग डीएनए क्षेत्रों के कार्य का पता लगाने के लिए, या विशिष्ट सेल प्रकार या विकास चरणों को निर्धारित करने के लिए जिसके दौरान एक एन्हांसर सक्रिय है – जिनमें से सभी बुनियादी विज्ञान और रोग अनुसंधान दोनों में लक्ष्यों की सेवा करते हैं। आम तौर पर, उम्मीदवार एन्हांसर चयन एन्हांसर गतिविधि की सिलिको भविष्यवाणियों से प्रेरित होता है। आमतौर पर, सिलिको भविष्यवाणियों में हिस्टोन संशोधनों के लिए CHIP-seq शामिल होता है जो संभावित एन्हांसर को इंगित करता है, जैसे H3K27ac37 और क्रोमैटिन एक्सेसिबिलिटी मैपिंग38। अंत में, अनुसंधान का एक बढ़ता हुआ क्षेत्र कृत्रिम रूप से डिज़ाइन किए गए एन्हांसर तत्वों की फ़ंक्शन-आधारित स्क्रीनिंग है, जो इस अध्ययन को सक्षम करता है कि एन्हांसर अनुक्रम फ़ंक्शन39 को कैसे निर्देशित करता है और विशिष्ट गुणों के साथ एन्हांसरका डिजाइन 40 है।

Protocol

इस प्रोटोकॉल को यूसी डेविस संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (प्रोटोकॉल # 22339) और यूसी डेविस संस्थागत जैव सुरक्षा समिति (बीयूए-आर 1903) द्वारा अनुमोदित किया गया है। इस प्रोटोकॉल का परीक्षण प्रसवोत्तर दिन 0-1…

Representative Results

इन विधियों का उपयोग करते हुए, प्रसवोत्तर माउस मस्तिष्क में एन्हांसर गतिविधि के लिए जीन CACNA1C 19,49,50 के मनोवैज्ञानिक जोखिम से जुड़े तीसरे इंट्रॉन में 915 बीपी अनुक्रम का परीक्षण किया गया थ…

Discussion

यह प्रोटोकॉल प्रसवोत्तर माउस मस्तिष्क में एन्हांसर-संचालित ट्रांसजेन की तैनाती के लिए एक आरएएवी-आधारित विधि का वर्णन करता है। इस सामान्यीकृत प्रोटोकॉल में, एक उम्मीदवार एन्हांसर, एक न्यूनतम प्रमोट?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

अनुक्रमण यूसी डेविस डीएनए टेक्नोलॉजीज कोर में किया गया था। हम आरएएवी पैकेजिंग पर प्रशिक्षण के लिए यूसी डेविस में लिन तियान की प्रयोगशाला को धन्यवाद देते हैं और उदारतापूर्वक हमें एएवी हेल्पर और रेप / कैप प्लास्मिड उपहार में देते हैं। इस काम को एनआईएच / एनआईजीएमएस आर 35 जीएम 119831 द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

10x Citrate Buffer Sigma-Aldrich C9999-1000ML
5'-gatcactctcggcatggac-3' Integrated DNA Technologies N/A: Custom designed Forward primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.
5'-gatggctggcaactagaagg-3' Integrated DNA Technologies N/A: Custom designed Reverse primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.
Agarose VWR VWRVN605-500G
Aspirator tube assemblies Sigma-Aldrich A5177-5EA for mouth-driven delivery of rAAV
Bacteriological petri dishes Thermo Fisher Scientific 08-757-100D
Carbenicillin Sigma-Aldrich C1389-5G
Chicken IgY anti-GFP Thermo Fisher Scientific A10262
Confocal microscope Zeiss LSM900 The images were taken on the LSM800 model, but Zeiss launched the LSM900 model in recent years to replace LSM800.
Conical centrifuge tubes 15 mL Thermo Fisher Scientific 12-565-269
Cryomolds Thermo Fisher Scientific NC9806558 These molds are suitable for P28 mouse brain. Other sizes may be more suitable for larger or smaller tissues.
DAPI Sigma-Aldrich D9542-10MG
Dissecting scissors, 4.5" VWR 82027-578
Donkey anti-chicken AlexaFlour-488 Jackson ImmunoResearch 703-545-155
Dulbecco's PBS 1x Thermo Fisher Scientific MT21031CV
Eppendorf Microcentrifuge tubes 2.0 mL Thermo Fisher Scientific 22431048
Falcon round-bottom tubes 14 mL Thermo Fisher Scientific 352059
Fast Green dye Grainger F0099-1G
Fine detail paint brush set Artbrush Tower B014GWCLFO
Gibson Assembly Master Mix NEB E2611S
Glass capillary tubes Drummond Scientific Company 5-000-2005
HiSpeed Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12663 Commercial plasmid maxi prep kit
HyClone HyPure Molecular Biology Grade Water VWR SH30538.03
IV butterfly infusion set with 12" tubing and 25G needle Thermo Fisher Scientific 26708
Kimwipes Kimberly Clark 34155 Lint-free wipe
LB Agar Thermo Fisher Scientific BP1425-500 LB agar pre-mix for selective media
McPherson Vannas iris scissor Integra LifeSciences 360-215
Mineral oil Sigma Life Science 69794-500ML
NEB Stable Competent E. coli NEB C3040I
NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Takara 740609.5 Kit for enzymatic reaction cleanup and gel extraction
OCT medium VWR 25608-930
Orbital shaker Cole Parmer 60-100
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127-500G
PCR strip tubes 0.2 mL VWR 490003-692
Peristaltic pump Gilson F155005
Phosphate buffered saline (PBS) 10x Thermo Fisher Scientific 70011044
Phusion Hot Start II High Fidelity DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific F549L
Powdered milk Sunny Select
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36934
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28106
rCutSmart Buffer NEB B6004S Buffer for restriction digest with PacI, AscI, and XmaI
Restriction enzyme: AscI NEB R0558L
Restriction enzyme: PacI NEB R0547L
Restriction enzyme: XmaI NEB R0180L
SOC outgrowth medium NEB B0920S Recovery medium after transformation
Sucrose (RNase/DNase free) Millipore Sigma 033522.5KG
TAE buffer Apex 20-194
Transfer tubing Gilson F1179941 For peristaltic pump
Triton X100 Sigma-Aldrich X100-100ML
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System Thermo Fisher Scientific A1460 Plasmid mini prep kit
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Warren, T. L., Lambert, J. T., Nord, A. S. AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain. J. Vis. Exp. (181), e62650, doi:10.3791/62650 (2022).
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