Implementazione AAV di costrutti di espressione basati su enhancer in vivo nel cervello di topo

Summary

Questo protocollo descrive un nuovo test di enhancer-reporter transitorio basato su rAAV. Questo test può essere utilizzato per indurre l’espressione guidata dal potenziatore in vivo nel cervello del topo.

Abstract

Gli enhancer sono piattaforme di legame per una vasta gamma di fattori di trascrizione che guidano specifici modelli di espressione di geni specifici del tipo di tessuto e della cellula. Molteplici mezzi per valutare il DNA non codificante e vari stati della cromatina si sono dimostrati utili nel predire la presenza di sequenze enhancer nel genoma, ma convalidare l’attività di queste sequenze e trovare gli organi e gli stadi di sviluppo in cui sono attivi è un processo ad alta intensità di lavoro. I recenti progressi nei vettori del virus adeno-associato (AAV) hanno permesso la consegna diffusa di transgeni ai tessuti del topo, consentendo test di potenziatori in vivo senza la necessità di un animale transgenico. Questo protocollo mostra come un costrutto reporter che esprime EGFP sotto il controllo di un promotore minimo, che non guida l’espressione significativa da solo, può essere utilizzato per studiare i modelli di attività delle sequenze di potenziatori candidati nel cervello del topo. Un costrutto reporter confezionato AAV viene consegnato al cervello del topo e incubato per 1-4 settimane, dopo di che l’animale viene sacrificato e le sezioni cerebrali vengono osservate al microscopio. EGFP appare nelle cellule in cui il potenziatore testato è sufficiente per avviare l’espressione genica, individuando la posizione e lo stadio di sviluppo in cui il potenziatore è attivo nel cervello. I metodi di clonazione standard, l’imballaggio AAV a basso costo e l’espansione dei sierotipi e dei metodi AAV per la consegna in vivo e la lettura standard dell’imaging rendono questo un approccio accessibile per lo studio di come l’espressione genica è regolata nel cervello.

Introduction

Gli enhancer sono elementi cis-regolatori genomici che fungono da siti di legame del fattore di trascrizione e possono guidare l’espressione di un gene bersaglio in modo spazio-temporale specifico ^1,2. Sono differenzialmente attivi in diversi tipi cellulari, tessuti e stadi di sviluppo e possono essere substrati della variazione genomica correlata al rischio di malattia ^3,4. Pertanto, la necessità di comprendere le dinamiche della funzione enhancer è fondamentale per il progresso nelle applicazioni sia traslazionali che scientifiche di base all’interno della genomica. In silico le previsioni dell’attività dell’enhancer possono servire come risorse eccellenti per generare ipotesi come capacità di enhancer ^5,6. Tale attività di enhancer prevista può richiedere ulteriori validazioni e interrogazioni per una piena comprensione dell’attività funzionale. I saggi Enhancer reporter si sono dimostrati preziosi per questo scopo in una varietà di sistemi, dalle cellule agli animali ^7,8,9. Per estendere questi studi in un contesto transitorio in vivo flessibile ed economico, questo protocollo descrive l’uso di metodi basati su AAV in vivo per testare sequenze di potenziatori putativi per la loro capacità di guidare l’espressione di un gene reporter ectopico nel cervello postnatale del topo. Questa famiglia di metodi ha utilità per interrogare singole sequenze candidate o screening di librerie parallele ed è rilevante per la ricerca di base e traslazionale.

Questo metodo combina in un singolo plasmide una presunta sequenza di DNA candidato enhancer con un gene reporter (qui EGFP), sotto il controllo di un promotore minimo che da solo non guida l’espressione significativa. Il plasmide viene confezionato in AAV ricombinante (rAAV) e iniettato in un modello animale. Mentre l’applicazione qui è al cervello, vari sierotipi rAAV consentono l’infezione attraverso diversi tipi di tessuto in modo che questo approccio possa essere esteso ad altri sistemi¹⁰. Dopo un periodo di tempo, il cervello può essere raccolto e analizzato per l’espressione del gene reporter. L’espressione forte, rispetto ai controlli, indica che la sequenza candidata testata è stata in grado di “migliorare” l’espressione del gene (Figura 1). Questo semplice design offre un approccio semplice e chiaro per testare una sequenza per l’attività del potenziatore in vivo nel cervello.

Oltre a testare la capacità di enhancer di una sequenza, questo metodo può essere combinato con tecniche per determinare l’attività del potenziatore di tipo cellulare. Negli approcci basati sulla sequenza per determinare l’attività del potenziatore differenziale, l’ordinamento delle cellule su marcatori specifici del tipo di cellula prima del sequenziamento del DNA e dell’RNA può consentire ai ricercatori di determinare se diversi tipi di cellule mostrano attività di potenziatore differenziale, come è stato descritto in Gisselbrecht et ^al.11. Negli approcci basati sull’imaging, la co-etichettatura delle immagini con marcatori specifici del tipo di cellula consente di esaminare se le cellule che mostrano fluorescenza guidata dal potenziatore mostrano anche marcatori di tipo cellulare di interesse 12,13,14,15,16. I saggi dei reporter enhancer consentono di testare direttamente la variazione allelica associata al rischio nei potenziatori per gli effetti sulla capacità del potenziatore. La stragrande maggioranza dei loci di rischio identificati negli studi di associazione genome-wide (GWAS) si trova in regioni non codificanti del genoma¹⁷. Studi di annotazione funzionale di questi loci di rischio indicano che una grande porzione probabilmente agisce come potenziatori^18,19,20. Il dispiegamento di MPRA in vivo può consentire di testare queste varianti associate al rischio per l’attività del potenziatore nel cervello^12,21. Infine, la consegna e la raccolta in diversi momenti possono offrire approfondimenti sulle fasi di sviluppo durante le quali un potenziatore è attivo.

I design dei plasmidi enhancer-reporter sono diversi e possono essere personalizzati per soddisfare obiettivi sperimentali. Ci sono diverse opzioni per i promotori minimi che sono stati utilizzati nella ricerca sugli enhancer, come il promotore minimo umano β-globina²² e il promotore minimo Hsp68 del topo²³. Questi promotori sono noti per guidare bassi livelli di espressione a meno che non siano accoppiati con un elemento enhancer per attivarli. Al contrario, gli elementi promotori costitutivi guidano una forte espressione del transgene, utile per il controllo positivo o per testare la funzione enhancer su uno sfondo di espressione robusta. Le scelte comuni per i promotori costitutivi includono CAG, un promotore ibrido derivato dal promotore di pollo β-actina e dal citomegalovirus immediate-early enhancer²⁴, o EF1α²⁵ umano. Poiché è noto che i potenziatori funzionano in modo bidirezionale²⁶, l’orientamento e la posizione del potenziatore rispetto al promotore minimo sono flessibili (Figura 2A). I tradizionali saggi enhancer-reporter posizionano il enhancer a monte del promotore e, nelle consegne in libreria, includono una sequenza di codici a barre a valle del gene reporter per associare le letture di sequenziamento con il enhancer²⁷ testato. Tuttavia, gli enhancer possono anche essere posizionati nel frame di lettura aperto del gene reporter e fungere da sequenza di codici a barre, come viene fatto in STARR-seq²⁸. Il protocollo qui descritto utilizza il disegno del saggio STARR-seq, posizionando la sequenza del potenziatore candidato nel 3′ UTR del gene reporter. Mentre l’orientamento STARR-seq offre il vantaggio di una clonazione più snella, è meno compreso rispetto all’approccio convenzionale e può indurre stabilità variabile dell’RNA tra i costrutti. I metodi descritti possono essere facilmente adattati sia allo STARR-seq che all’orientamento convenzionale con piccole modifiche al processo di clonazione che sono state descritte altrove^27,29.

Diversi metodi di erogazione di AAV possono essere impiegati per personalizzare ulteriormente questa tecnica per adattarla agli obiettivi sperimentali (Figura 2B). Le iniezioni intracraniche dirette, descritte ulteriormente in questo protocollo, forniscono un’alta concentrazione di virus direttamente al cervello³⁰. Ciò fornisce un’elevata efficienza di trasduzione centrata nel sito di iniezione, rendendola una tecnica eccellente per esperimenti che cercano di massimizzare la densità delle cellule trasdotte su un’area di tessuto. L’iniezione stereotassica può aiutare a standardizzare il sito di iniezione tra gli animali per una trasduzione localizzata riproducibile. Le iniezioni intracraniche sono più semplici negli animali postnatali precoci. Come tecnica alternativa, le iniezioni sistemiche possono fornire transgeni utilizzando AAV con sierotipi in grado di attraversare la barriera emato-encefalica³¹. Le iniezioni di vene della coda consentono al virus di circolare in tutto il corpo, consentendo la consegna generalizzata attraverso molti tessuti¹⁰. Le iniezioni retro-orbitali sono un’altra tecnica di iniezione sistemica che trasporta il virus dietro l’occhio nel seno retroorbitale³². Ciò offre un percorso più diretto per l’AAV dal sistema venoso al cervello, con conseguente maggiore concentrazione di cellule trasdotte nel cervello rispetto alle iniezioni in più vasi sanguigni periferici³³.

Un altro aspetto flessibile di questa tecnica è il metodo di lettura. In generale, le opzioni possono essere descritte come basate su reporter o sequenziali (Figura 2C). L’incorporazione di un reporter fluorescente come GFP nel frame di lettura aperto del costrutto si traduce nell’espressione della proteina fluorescente in qualsiasi cellula trasdotta in cui il candidato enhancer ha guidato l’espressione. Le tecniche di etichettatura e imaging come l’immunoistochimica consentono l’amplificazione del segnale. Le tecniche di lettura basate sul sequenziamento comportano l’identificazione di sequenze dal costrutto consegnato nell’RNA raccolto dal tessuto. Quantificando la quantità di DNA virale che è stata inizialmente consegnata, il confronto tra RNA espresso e DNA consegnato può essere utilizzato per determinare il grado in cui una sequenza enhancer testata era in grado di guidare una maggiore espressione del transgene, ad esempio, nel contesto di un saggio reporter massively parallel (MPRA). Gli MPRA offrono una potente espansione di queste tecniche per testare fino a migliaia di candidati potenziatori per l’attività contemporaneamente e sono stati ampiamente descritti nella ricerca genomica 12,27,34,35,36. Lo screening a throughput più elevato si ottiene eseguendo fasi di clonazione, confezionamento, consegna e sequenziamento per i potenziatori candidati in batch anziché singolarmente.

La selezione del potenziatore dei candidati offre un’altra opportunità di flessibilità (Figura 2D). Ad esempio, questo test può essere utilizzato per identificare i potenziatori di un gene specifico, per accertare la funzione delle regioni di interesse del DNA non codificanti o per determinare specifici tipi di cellule o fasi di sviluppo durante le quali un potenziatore è attivo – tutti elementi che servono obiettivi sia nella scienza di base che nella ricerca sulle malattie. Generalmente, la selezione del potenziatore candidato è guidata dalle previsioni in silico dell’attività del potenziatore. Comunemente, le previsioni in silico includono ChIP-seq per le modifiche degli istoni che indicano probabili potenziatori, come H3K27ac³⁷ e la mappatura dell’accessibilità della cromatina³⁸. Infine, un’area di ricerca crescente è lo screening basato sulla funzione di elementi enhancer progettati sinteticamente, consentendo studi su come la sequenza enhancer dirige la funzione³⁹ e la progettazione di enhancer con proprietà specifiche⁴⁰.

Protocol

Questo protocollo è stato approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali della UC Davis (Protocollo #22339) e dal Comitato istituzionale per la biosicurezza della UC Davis (BUA-R1903). Questo protocollo è stato testato su topi C57BL/6J di entrambi i sessi al giorno postnatale 0-1. 1. Clonare la sequenza del candidato enhancer nel plasmide vettore AAV. NOTA: vengono forniti i protocolli rappresentativi, ma la strategia di clon…

Representative Results

Utilizzando questi metodi, una sequenza di 915 bp nel terzo introne associato al rischio psichiatrico del gene CACNA1C19,49,50 è stata testata per l’attività del potenziatore nel cervello del topo postnatale. Questa sequenza è stata scoperta in un MPRA di 345 sequenze di potenziatori candidati centrate sul rischio psichiatrico e neurologico SNPs12 e gli esperimenti di caratterizzazione sono de…

Discussion

Questo protocollo descrive un metodo basato su rAAV per il dispiegamento di transgeni guidati da enhancer nel cervello postnatale del topo. In questo protocollo generalizzato, un potenziatore candidato, un promotore minimo, un gene reporter e una sequenza di codici a barre opzionale vengono clonati in una spina dorsale del plasmide AAV. Questi esperimenti possono essere fatti con una singola sequenza di potenziatore candidato o con molte sequenze in parallelo. Il plasmide viene confezionato in un rAAV e consegnato al cer…

Materials

10x Citrate Buffer	Sigma-Aldrich	C9999-1000ML
5'-gatcactctcggcatggac-3'	Integrated DNA Technologies	N/A: Custom designed	Forward primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.
5'-gatggctggcaactagaagg-3'	Integrated DNA Technologies	N/A: Custom designed	Reverse primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.
Agarose	VWR	VWRVN605-500G
Aspirator tube assemblies	Sigma-Aldrich	A5177-5EA	for mouth-driven delivery of rAAV
Bacteriological petri dishes	Thermo Fisher Scientific	08-757-100D
Carbenicillin	Sigma-Aldrich	C1389-5G
Chicken IgY anti-GFP	Thermo Fisher Scientific	A10262
Confocal microscope	Zeiss	LSM900	The images were taken on the LSM800 model, but Zeiss launched the LSM900 model in recent years to replace LSM800.
Conical centrifuge tubes 15 mL	Thermo Fisher Scientific	12-565-269
Cryomolds	Thermo Fisher Scientific	NC9806558	These molds are suitable for P28 mouse brain. Other sizes may be more suitable for larger or smaller tissues.
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-10MG
Dissecting scissors, 4.5"	VWR	82027-578
Donkey anti-chicken AlexaFlour-488	Jackson ImmunoResearch	703-545-155
Dulbecco's PBS 1x	Thermo Fisher Scientific	MT21031CV
Eppendorf Microcentrifuge tubes 2.0 mL	Thermo Fisher Scientific	22431048
Falcon round-bottom tubes 14 mL	Thermo Fisher Scientific	352059
Fast Green dye	Grainger	F0099-1G
Fine detail paint brush set	Artbrush Tower	B014GWCLFO
Gibson Assembly Master Mix	NEB	E2611S
Glass capillary tubes	Drummond Scientific Company	5-000-2005
HiSpeed Plasmid Maxi Kit	QIAGEN	12663	Commercial plasmid maxi prep kit
HyClone HyPure Molecular Biology Grade Water	VWR	SH30538.03
IV butterfly infusion set with 12" tubing and 25G needle	Thermo Fisher Scientific	26708
Kimwipes	Kimberly Clark	34155	Lint-free wipe
LB Agar	Thermo Fisher Scientific	BP1425-500	LB agar pre-mix for selective media
McPherson Vannas iris scissor	Integra LifeSciences	360-215
Mineral oil	Sigma Life Science	69794-500ML
NEB Stable Competent E. coli	NEB	C3040I
NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up	Takara	740609.5	Kit for enzymatic reaction cleanup and gel extraction
OCT medium	VWR	25608-930
Orbital shaker	Cole Parmer	60-100
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127-500G
PCR strip tubes 0.2 mL	VWR	490003-692
Peristaltic pump	Gilson	F155005
Phosphate buffered saline (PBS) 10x	Thermo Fisher Scientific	70011044
Phusion Hot Start II High Fidelity DNA Polymerase	Thermo Fisher Scientific	F549L
Powdered milk	Sunny Select
ProLong Gold Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific	P36934
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN	28106
rCutSmart Buffer	NEB	B6004S	Buffer for restriction digest with PacI, AscI, and XmaI
Restriction enzyme: AscI	NEB	R0558L
Restriction enzyme: PacI	NEB	R0547L
Restriction enzyme: XmaI	NEB	R0180L
SOC outgrowth medium	NEB	B0920S	Recovery medium after transformation
Sucrose (RNase/DNase free)	Millipore Sigma	033522.5KG
TAE buffer	Apex	20-194
Transfer tubing	Gilson	F1179941	For peristaltic pump
Triton X100	Sigma-Aldrich	X100-100ML
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System	Thermo Fisher Scientific	A1460	Plasmid mini prep kit