JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Neuroscience

AAV-distribusjon av Enhancer-baserte uttrykkskonstruksjoner in vivo i musehjerne

Published: March 31, 2022
doi:
10.3791/62650
, ,
1Department of Psychiatry and Behavioral Sciences,University of California, Davis, 2Department of Neurobiology, Physiology and Behavior,University of California, Davis

Summary

Denne protokollen beskriver en ny rAAV-basert forbigående enhancer-reporter-analyse. Denne analysen kan brukes til å indusere enhancer-drevet uttrykk in vivo i musehjernen.

Abstract

Enhancers er bindende plattformer for et mangfoldig utvalg av transkripsjonsfaktorer som driver spesifikke uttrykksmønstre av vevs- og celletypespesifikke gener. Flere metoder for å vurdere ikke-kodende DNA og forskjellige kromatintilstander har vist seg å være nyttige for å forutsi tilstedeværelsen av forsterkersekvenser i genomet, men å validere aktiviteten til disse sekvensene og finne organene og utviklingsstadiene de er aktive i, er en arbeidsintensiv prosess. Nylige fremskritt i adeno-assosierte virus (AAV) vektorer har muliggjort utbredt levering av transgener til musevev, noe som muliggjør in vivo enhancer testing uten å nødvendiggjøre et transgent dyr. Denne protokollen viser hvordan en reporterkonstruksjon som uttrykker EGFP under kontroll av en minimal promotor, som ikke driver signifikant uttrykk alene, kan brukes til å studere aktivitetsmønstrene til kandidatforsterkersekvenser i musehjernen. En AAV-pakket reporterkonstruksjon leveres til musehjernen og inkuberes i 1-4 uker, hvoretter dyret ofres, og hjerneseksjoner observeres under et mikroskop. EGFP vises i celler der den testede forsterkeren er tilstrekkelig til å initiere genuttrykk, og identifiserer plasseringen og utviklingsstadiet der forsterkeren er aktiv i hjernen. Standard kloningsmetoder, rimelig AAV-emballasje og utvidelse av AAV-serotyper og metoder for in vivo-levering og standard bildeavlesning gjør dette til en tilgjengelig tilnærming for studiet av hvordan genuttrykk reguleres i hjernen.

Introduction

Enhancers er genomiske cis-regulatoriske elementer som fungerer som transkripsjonsfaktorbindingssteder og kan drive uttrykket av et målgen på en spatiotemporalt spesifikk måte 1,2. De er differensielt aktive i forskjellige celletyper, vev og utviklingsstadier og kan være substrater for sykdomsrisikorelatert genomisk variasjon 3,4. Dermed er behovet for å forstå dynamikken i enhancer-funksjonen avgjørende for fremgang i både translasjonelle og grunnleggende vitenskapelige applikasjoner innen genomikk. I silico spådommer om enhancer aktivitet kan tjene som gode ressurser for å generere hypoteser som til enhancer evne 5,6. Slik forutsagt forsterkeraktivitet kan kreve ytterligere validering og avhør for en full forståelse av den funksjonelle aktiviteten. Enhancer reporter analyser har vist seg verdifulle for dette formålet på tvers av en rekke systemer, fra celler til dyr 7,8,9. Mot å utvide disse studiene i en fleksibel og kostnadseffektiv forbigående in vivo-sammenheng, beskriver denne protokollen bruken av in vivo AAV-baserte metoder for å teste antatte forsterkersekvenser for deres evne til å drive uttrykket av et ektopisk reportergen i den postnatale musehjernen. Denne familien av metoder har nytte for å forhøre enkeltkandidatsekvenser eller parallellbiblioteksscreening og er relevant for grunnleggende og translasjonell forskning.

Denne metoden kombinerer i et enkelt plasmid en antatt forsterkerkandidat-DNA-sekvens med et reportergen (her EGFP), under kontroll av en minimal promotor som alene ikke driver signifikant uttrykk. Plasmidet pakkes i rekombinant AAV (rAAV) og injiseres i en dyremodell. Mens applikasjonen her er til hjernen, muliggjør ulike rAAV-serotyper infeksjon på tvers av forskjellige vevstyper, slik at denne tilnærmingen kan utvides til andre systemer10. Etter en periode kan hjernen samles og analyseres for ekspresjon av reportergenet. Sterkt uttrykk, sammenlignet med kontroller, indikerer at den testede kandidatsekvensen var i stand til å “forbedre” ekspresjonen av genet (figur 1). Denne enkle designen gir en enkel og klar tilnærming til å teste en sekvens for forsterkeraktivitet in vivo i hjernen.

I tillegg til testing for enhancer evne til en sekvens, kan denne metoden kombineres med teknikker for å bestemme celle-type enhancer aktivitet. I sekvensbaserte tilnærminger til å bestemme differensialforsterkeraktivitet kan sortering av celler på celletypespesifikke markører før DNA- og RNA-sekvensering tillate forskere å avgjøre om forskjellige celletyper viser differensialforsterkeraktivitet, som beskrevet i Gisselbrecht et al.11. I bildebaserte tilnærminger tillater sammerking av bilder med celletypespesifikke markører undersøkelse av om celler som viser enhancer-drevet fluorescens også viser celletypemarkører av interesse 12,13,14,15,16. Enhancer reporteranalyser muliggjør direkte testing av risikoassosiert allelisk variasjon i forsterkere for effekter på enhancer-evnen. De aller fleste risikosteder identifisert i genom-wide association studies (GWAS) ligger i ikke-kodende regioner av genomet17. Funksjonelle merknadsstudier av disse risikolokiene indikerer at en stor del sannsynligvis fungerer som forsterkere18,19,20. MPRA-distribusjon in vivo kan tillate testing av disse risikoassosierte variantene for forsterkeraktivitet i hjernen12,21. Endelig kan levering og henting på forskjellige tidspunkter gi innsikt i utviklingsstadiene der en forsterker er aktiv.

Enhancer-reporter plasmid design er mangfoldig og kan tilpasses for å passe eksperimentelle mål. Det finnes flere alternativer for minimal promotorer som har blitt brukt i enhancer forskning, for eksempel den menneskelige β-globin minimal promotor22 og musen Hsp68 minimal promotor23. Disse promotørene er kjent for å drive lave uttrykksnivåer med mindre de kombineres med et forsterkerelement for å aktivere dem. I motsetning til dette driver konstitutive promotorelementer sterkt uttrykk for det transgene, nyttig for positiv kontroll eller for å teste for forsterkerfunksjon mot en bakgrunn av robust uttrykk. Vanlige valg for konstitutive promotorer inkluderer CAG, en hybridpromotor avledet fra kylling β-aktinpromotoren og cytomegalovirus immediate-early enhancer24, eller human EF1α25. Siden forsterkere er kjent for å fungere toveis26, er orienteringen og plasseringen av forsterkeren i forhold til den minimale promotoren fleksibel (figur 2A). Tradisjonelle enhancer-reporter-analyser plasserer forsterkeren oppstrøms for promotoren og, i bibliotekleveranser, inkluderer en strekkodesekvens nedstrøms for reportergenet for å knytte sekvenseringsavlesninger med den testede forsterkeren27. Imidlertid kan forsterkere også plasseres i den åpne leserammen til reportergenet og tjene som sin egen strekkodesekvens, slik det gjøres i STARR-seq28. Protokollen beskrevet her benytter STARR-seq-analysedesignet, og plasserer kandidatforsterkersekvensen i 3 ‘UTR av reportergenet. Mens STARR-seq-orienteringen gir fordelen av mer strømlinjeformet kloning, er den mindre godt forstått enn den konvensjonelle tilnærmingen og kan indusere variabel RNA-stabilitet mellom konstruksjoner. De beskrevne metodene kan enkelt tilpasses enten STARR-seq eller konvensjonell orientering med mindre endringer i kloningsprosessen som er beskrevet andre steder27,29.

Ulike metoder for AAV-levering kan brukes til å tilpasse denne teknikken ytterligere for å passe eksperimentelle mål (figur 2B). Direkte intrakranielle injeksjoner, beskrevet nærmere i denne protokollen, gir en høy konsentrasjon av virus direkte til hjernen30. Dette gir en høy transduksjonseffektivitet sentrert på injeksjonsstedet, noe som gjør dette til en utmerket teknikk for eksperimenter som ønsker å maksimere tettheten av transducerte celler over et område av vev. Stereotaktisk injeksjon kan bidra til å standardisere injeksjonsstedet på tvers av dyr for reproduserbar lokalisert transduksjon. Intrakraniale injeksjoner er mest enkle hos tidlige postnatale dyr. Som en alternativ teknikk kan systemiske injeksjoner levere transgener ved hjelp av AAV med serotyper som er i stand til å krysse blod-hjernebarrieren31. Tail-vene injeksjoner tillate viruset å sirkulere gjennom hele kroppen, slik at generalisert levering over mange vev10. Retro-orbitale injeksjoner er en annen systemisk injeksjonsteknikk som leverer viruset bak øyet inn i retro-orbital sinus32. Dette gir en mer direkte rute for AAV fra venesystemet til hjernen, noe som resulterer i en høyere konsentrasjon av transducerte celler i hjernen enn injeksjoner i flere perifere blodkar33.

Et annet fleksibelt aspekt ved denne teknikken er metoden for avlesning. I grove trekk kan alternativene beskrives som reporterbaserte eller sekvenseringsbaserte (figur 2C). Inkorporering av en fluorescerende reporter som GFP i den åpne leserammen til konstruksjonen resulterer i uttrykket av det fluorescerende proteinet i noen transducerte celler der kandidatforsterkeren kjørte uttrykk. Merkings- og avbildningsteknikker som immunhistokjemi muliggjør signalforsterkning. Sekvenseringsbaserte avlesningsteknikker innebærer å identifisere sekvenser fra den leverte konstruksjonen i RNA samlet fra vevet. Ved å kvantifisere mengden viralt DNA som opprinnelig ble levert, kan sammenligningen av uttrykt RNA versus levert DNA brukes til å bestemme i hvilken grad en testet forsterkersekvens var i stand til å drive økt uttrykk for transgenet, for eksempel i sammenheng med en massivt parallell reporteranalyse (MPRA). MPRA-er tilbyr en kraftig utvidelse av disse teknikkene for å teste opptil tusenvis av kandidatforsterkere for aktivitet samtidig og har blitt beskrevet omfattende i genomforskning 12,27,34,35,36. Høyere gjennomstrømningsscreening oppnås ved å utføre kloning, pakking, levering og sekvenseringstrinn for kandidatforsterkere i batch i stedet for individuelt.

Valg av kandidatforbedring gir en annen mulighet for fleksibilitet (figur 2D). For eksempel kan denne analysen brukes til å identifisere forsterkere av et bestemt gen, for å fastslå funksjonen til ikke-kodende DNA-regioner av interesse, eller for å bestemme bestemte celletyper eller utviklingsstadier der en forsterker er aktiv – som alle tjener mål både i grunnvitenskap og i sykdomsforskning. Generelt er valg av kandidatforsterker drevet av in silico-spådommer om enhancer-aktivitet. Vanligvis inkluderer silico-prediksjoner ChIP-seq for histonmodifikasjoner som indikerer sannsynlige forsterkere, for eksempel H3K27ac 37 og kromatin tilgjengelighetskartlegging 38. Endelig er et voksende forskningsområde den funksjonsbaserte screeningen av syntetisk utformede forsterkerelementer, noe som muliggjør studier av hvordan forsterkersekvensen styrer funksjon39 og utformingen av forsterkere med spesifikke egenskaper40.

Protocol

Denne protokollen er godkjent av UC Davis Institutional Animal Care and Use Committee (protokoll #22339) og UC Davis Institutional Biosafety Committee (BUA-R1903). Denne protokollen er testet på C57BL/6J mus av begge kjønn på postnatal dag 0-1. 1. Klon forsterkerkandidatsekvensen til AAV-vektorplasmidet. MERK: De representative protokollene er gitt, men kloningsstrategien har en høy grad av fleksibilitet. Velg eller utform en reporterk…

Representative Results

Ved hjelp av disse metodene ble en 915 bp-sekvens i den psykiatriske risikoassosierte tredje intronen av genet CACNA1C19,49,50 testet for forsterkeraktivitet i den postnatale musehjernen. Denne sekvensen ble oppdaget i en MPRA på 345 kandidatforsterkersekvenser sentrert på psykiatrisk og nevrologisk risiko SNPs12, og karakteriseringseksperimenter er beskrevet her som et generelt eksempel. C57BL…

Discussion

Denne protokollen beskriver en rAAV-basert metode for distribusjon av enhancer-drevne transgener i den postnatale musehjernen. I denne generaliserte protokollen blir en kandidatforsterker, en minimal promotor, et reportergen og en valgfri strekkodesekvens klonet til en AAV-plasmid-ryggrad. Disse eksperimentene kan gjøres med en enkelt kandidatforsterkersekvens eller med mange sekvenser parallelt. Plasmidet pakkes inn i en rAAV og leveres til den postnatale musehjernen. Etter en periode for å tillate virustransduksjon, …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Sekvensering ble utført ved UC Davis DNA Technologies Core. Vi takker laboratoriet til Lin Tian ved UC Davis for opplæring på rAAV-emballasje og sjenerøst gifting oss AAV-hjelper og rep / cap plasmider. Dette arbeidet ble støttet av NIH/NIGMS R35GM119831.

Materials

10x Citrate Buffer Sigma-Aldrich C9999-1000ML
5'-gatcactctcggcatggac-3' Integrated DNA Technologies N/A: Custom designed Forward primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.
5'-gatggctggcaactagaagg-3' Integrated DNA Technologies N/A: Custom designed Reverse primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.
Agarose VWR VWRVN605-500G
Aspirator tube assemblies Sigma-Aldrich A5177-5EA for mouth-driven delivery of rAAV
Bacteriological petri dishes Thermo Fisher Scientific 08-757-100D
Carbenicillin Sigma-Aldrich C1389-5G
Chicken IgY anti-GFP Thermo Fisher Scientific A10262
Confocal microscope Zeiss LSM900 The images were taken on the LSM800 model, but Zeiss launched the LSM900 model in recent years to replace LSM800.
Conical centrifuge tubes 15 mL Thermo Fisher Scientific 12-565-269
Cryomolds Thermo Fisher Scientific NC9806558 These molds are suitable for P28 mouse brain. Other sizes may be more suitable for larger or smaller tissues.
DAPI Sigma-Aldrich D9542-10MG
Dissecting scissors, 4.5" VWR 82027-578
Donkey anti-chicken AlexaFlour-488 Jackson ImmunoResearch 703-545-155
Dulbecco's PBS 1x Thermo Fisher Scientific MT21031CV
Eppendorf Microcentrifuge tubes 2.0 mL Thermo Fisher Scientific 22431048
Falcon round-bottom tubes 14 mL Thermo Fisher Scientific 352059
Fast Green dye Grainger F0099-1G
Fine detail paint brush set Artbrush Tower B014GWCLFO
Gibson Assembly Master Mix NEB E2611S
Glass capillary tubes Drummond Scientific Company 5-000-2005
HiSpeed Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12663 Commercial plasmid maxi prep kit
HyClone HyPure Molecular Biology Grade Water VWR SH30538.03
IV butterfly infusion set with 12" tubing and 25G needle Thermo Fisher Scientific 26708
Kimwipes Kimberly Clark 34155 Lint-free wipe
LB Agar Thermo Fisher Scientific BP1425-500 LB agar pre-mix for selective media
McPherson Vannas iris scissor Integra LifeSciences 360-215
Mineral oil Sigma Life Science 69794-500ML
NEB Stable Competent E. coli NEB C3040I
NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Takara 740609.5 Kit for enzymatic reaction cleanup and gel extraction
OCT medium VWR 25608-930
Orbital shaker Cole Parmer 60-100
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127-500G
PCR strip tubes 0.2 mL VWR 490003-692
Peristaltic pump Gilson F155005
Phosphate buffered saline (PBS) 10x Thermo Fisher Scientific 70011044
Phusion Hot Start II High Fidelity DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific F549L
Powdered milk Sunny Select
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36934
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28106
rCutSmart Buffer NEB B6004S Buffer for restriction digest with PacI, AscI, and XmaI
Restriction enzyme: AscI NEB R0558L
Restriction enzyme: PacI NEB R0547L
Restriction enzyme: XmaI NEB R0180L
SOC outgrowth medium NEB B0920S Recovery medium after transformation
Sucrose (RNase/DNase free) Millipore Sigma 033522.5KG
TAE buffer Apex 20-194
Transfer tubing Gilson F1179941 For peristaltic pump
Triton X100 Sigma-Aldrich X100-100ML
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System Thermo Fisher Scientific A1460 Plasmid mini prep kit
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pennacchio, L. A., et al. In vivo enhancer analysis of human conserved non-coding sequences. Nature. 444 (7118), 499-502 (2006).
  2. Nord, A. S., et al. Rapid and pervasive changes in genome-wide enhancer usage during mammalian development. Cell. 155 (7), 1521-1531 (2013).
  3. Finucane, H. K., et al. Partitioning heritability by functional annotation using genome-wide association summary statistics. Nature Genetics. 47 (11), 1228-1235 (2015).
  4. Nord, A. S., West, A. E. Neurobiological functions of transcriptional enhancers. Nature Neuroscience. 23 (1), 5-14 (2020).
  5. Hallikas, O., et al. Genome-wide prediction of mammalian enhancers based on analysis of transcription-factor binding affinity. Cell. 124 (1), 47-59 (2006).
  6. Su, J., Teichmann, S. A., Down, T. A. Assessing computational methods of cis-regulatory module prediction. PLoS Computational Biology. 6 (12), 1001020 (2010).
  7. Visel, A., et al. ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers. Nature. 457 (7231), 854-858 (2009).
  8. Kvon, E. Z., et al. Genome-scale functional characterization of Drosophila developmental enhancers in vivo. Nature. 512 (7512), 91-95 (2014).
  9. Yáñez-Cuna, J. O., et al. Dissection of thousands of cell type-specific enhancers identifies dinucleotide repeat motifs as general enhancer features. Genome Research. 24 (7), 1147-1156 (2014).
  10. Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).
  11. Gisselbrecht, S. S., et al. Highly parallel assays of tissue-specific enhancers in whole Drosophila embryos. Nature Methods. 10 (8), 774-780 (2013).
  12. Lambert, J. T., et al. Parallel functional testing identifies enhancers active in early postnatal mouse brain. eLife. 10, 69479 (2021).
  13. Chen, Y. -. J. J., et al. Use of “MGE Enhancers” for labeling and selection of embryonic stem cell-derived medial ganglionic eminence (MGE) progenitors and neurons. PLoS ONE. 8, 61956 (2013).
  14. Graybuck, L. T., et al. Enhancer viruses and a transgenic platform for combinatorial cell subclass-specific labeling. bioRxiv. , 525014 (2019).
  15. Dimidschstein, J., et al. A viral strategy for targeting and manipulating interneurons across vertebrate species. Nature Neuroscience. 19 (12), 1743-1749 (2016).
  16. Rubin, A. N., et al. Regulatory elements inserted into AAVs confer preferential activity in cortical interneurons. eNeuro. 7, (2020).
  17. Hindorff, L. A., et al. Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (23), 9362-9367 (2009).
  18. Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).
  19. Ripke, S., et al. Biological insights from 108 schizophrenia-associated genetic loci. Nature. 511 (7510), 421-427 (2014).
  20. Nott, A., et al. Brain cell type-specific enhancer-promoter interactome maps and disease-risk association. Science. 366 (6469), 1134-1139 (2019).
  21. Lagunas, T., et al. A Cre-dependent massively parallel reporter assay allows for cell-type specific assessment of the functional effects of genetic variants in vivo. bioRxiv. , (2021).
  22. DeBoer, E., Antoniou, M., Mignotte, V., Wall, L., Grosveld, F. The human beta-globin promoter; nuclear protein factors and erythroid specific induction of transcription. The EMBO journal. 7 (13), 4203-4212 (1988).
  23. Kothary, R., et al. Inducible expression of an hsp68-lacZ hybrid gene in transgenic mice. Development. 105 (4), 707-714 (1989).
  24. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
  25. Kim, D. W., Uetsuki, T., Kaziro, Y., Yamaguchi, N., Sugano, S. Use of the human elongation factor 1α promoter as a versatile and efficient expression system. Gene. 91 (2), 217-223 (1990).
  26. Banerji, J., Rusconi, S., Schaffner, W. Expression of a β-globin gene is enhanced by remote SV40 DNA sequences. Cell. 27 (2), 299-308 (1981).
  27. Patwardhan, R. P., et al. High-resolution analysis of DNA regulatory elements by synthetic saturation mutagenesis. Nature Biotechnology. 27 (12), 1173-1175 (2009).
  28. Arnold, C. D., et al. Genome-wide quantitative enhancer activity maps identified by STARR-seq. Science. 339 (6123), 1074-1077 (2013).
  29. Melnikov, A., et al. Systematic dissection and optimization of inducible enhancers in human cells using a massively parallel reporter assay. Nature Biotechnology. 30, 271-277 (2012).
  30. Kim, J. -. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51863 (2014).
  31. Liu, D., Zhu, M., Zhang, Y., Diao, Y. Crossing the blood-brain barrier with AAV vectors. Metabolic Brain Disease. 36 (1), 45-52 (2021).
  32. Prabhakar, S., Lule, S., Da Hora, C. C., Breakefield, X. O., Cheah, P. S. AAV9 transduction mediated by systemic delivery of vector via retro-orbital injection in newborn, neonatal and juvenile mice. Experimental Animals. , (2021).
  33. Gruntman, A. M., Su, L., Flotte, T. R. Retro-orbital venous sinus delivery of rAAV9 mediates high-level transduction of brain and retina compared with temporal vein delivery in neonatal mouse pups. Human Gene Therapy. 28 (3), 228-230 (2017).
  34. Inoue, F., Ahituv, N. Decoding enhancers using massively parallel reporter assays. Genomics. 106 (3), 159-164 (2015).
  35. Gordon, M. G., et al. lentiMPRA and MPRAflow for high-throughput functional characterization of gene regulatory elements. Nature Protocols. 15 (8), 2387-2412 (2020).
  36. Klein, J. C., et al. A systematic evaluation of the design and context dependencies of massively parallel reporter assays. Nature Methods. 17 (11), 1083-1091 (2020).
  37. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  38. Song, L., Crawford, G. E. DNase-seq: A high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (2), 5384 (2010).
  39. King, D. M., et al. Synthetic and genomic regulatory elements reveal aspects of Cis-regulatory grammar in mouse embryonic stem cells. eLife. 9, 41279 (2020).
  40. Amit, R., Garcia, H. G., Phillips, R., Fraser, S. E. Building enhancers from the ground up: a synthetic biology approach. Cell. 146, 105-118 (2011).
  41. Fan, M., Tsai, J., Chen, B., Fan, K., LaBaer, J. A central repository for published plasmids. Science. 307, 1877 (2005).
  42. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. Journal of Molecular Biology. 94, 441-448 (1975).
  43. Broussard, G. J., Unger, E. K., Liang, R., McGrew, B. P., Tian, L., Parrot, S., Denoroy, L. L. glutamate with genetically encoded fluorescent sensors. Biochemical Approaches for Glutamatergic Neurotransmission. 130, 117-153 (2018).
  44. Chen, Y. H., Keiser, M. S., Davidson, B. L. Adeno-associated virus production, purification, and titering. Current Protocols in Mouse Biology. 8, 56 (2018).
  45. He, C. X., Arroyo, E. D., Cantu, D. A., Goel, A., Portera-Cailliau, C. A Versatile Method for Viral Transfection of Calcium Indicators in the Neonatal Mouse Brain. Frontiers in Neural Circuits. 12, 56 (2018).
  46. Chen, S. -. Y., Kuo, H. -. Y., Liu, F. -. C. Stereotaxic surgery for genetic manipulation in striatal cells of neonatal mouse brains. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), e57270 (2018).
  47. Brenowitz, S. D., Regehr, W. G. Presynaptic imaging of projection fibers by in vivo injection of dextran-conjugated calcium indicators. Cold Spring Harbor Protocols. 2012, (2012).
  48. Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. Ex vivo optogenetic dissection of fear circuits in brain slices. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (110), e53628 (2016).
  49. Green, E. K., et al. The bipolar disorder risk allele at CACNA1C also confers risk of recurrent major depression and of schizophrenia. Molecular Psychiatry. 15 (10), 1016-1022 (2010).
  50. Takahashi, S., Glatt, S. J., Uchiyama, M., Faraone, S. V., Tsuang, M. T. Meta-analysis of data from the Psychiatric Genomics Consortium and additional samples supports association of CACNA1C with risk for schizophrenia. Schizophrenia Research. 168 (1-2), 429-433 (2015).
  51. McCarty, D. M. Self-complementary AAV vectors; advances and applications. Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).
  52. Haery, L., et al. Adeno-associated virus technologies and methods for targeted neuronal manipulation. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 93 (2019).
  53. Rabani, M., Pieper, L., Chew, G. -. L., Schier, A. F. A massively parallel reporter assay of 3′ UTR sequences identifies in vivo rules for mrna degradation. Molecular Cell. 68, 1083-1094 (2017).
  54. Kim, Y. -. S., et al. Correcting signal biases and detecting regulatory elements in STARR-seq data. Genome Research. 31, 877-889 (2021).
  55. Lee, D., et al. STARRPeaker: uniform processing and accurate identification of STARR-seq active regions. Genome Biology. 21, 298 (2020).
  56. Doni Jayavelu, N., Jajodia, A., Mishra, A., Hawkins, R. D. Candidate silencer elements for the human and mouse genomes. Nature Communications. 11, 1061 (2020).
  57. Singh, G., et al. A flexible repertoire of transcription factor binding sites and a diversity threshold determines enhancer activity in embryonic stem cells. Genome Research. 31, 564-575 (2021).
  58. Wang, X., et al. High-resolution genome-wide functional dissection of transcriptional regulatory regions and nucleotides in human. Nature Communications. 9, 5380 (2018).
  59. Peng, T., et al. STARR-seq identifies active, chromatin-masked, and dormant enhancers in pluripotent mouse embryonic stem cells. Genome Biology. 21, 243 (2020).
  60. Nair, R. R., Blankvoort, S., Lagartos, M. J., Kentros, C. Enhancer-driven gene expression (EDGE) enables the generation of viral vectors specific to neuronal subtypes. iScience. 23, 100888 (2020).
  61. Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65 -mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. The Lancet. 390, 849-860 (2017).
  62. Gaudet, D., et al. Efficacy and long-term safety of alipogene tiparvovec (AAV1-LPLS447X) gene therapy for lipoprotein lipase deficiency: an open-label trial. Gene Therapy. 20, 361-369 (2013).
  63. Nguyen, G. N., et al. A long-term study of AAV gene therapy in dogs with hemophilia A identifies clonal expansions of transduced liver cells. Nature Biotechnology. 39, 47-55 (2021).
  64. Nayak, S., Herzog, R. W. Progress and prospects: Immune responses to viral vectors. Gene Therapy. 17 (3), 295-304 (2010).
  65. Visel, A., et al. A high-resolution enhancer atlas of the developing telencephalon. Cell. 152 (4), 895-908 (2013).
  66. Shen, S. Q., et al. Massively parallel cis-regulatory analysis in the mammalian central nervous system. Genome Research. 26 (2), 238-255 (2016).
  67. Shen, S. Q., et al. A candidate causal variant underlying both higher intelligence and increased risk of bipolar disorder. bioRxiv. , (2019).
  68. Hrvatin, S., et al. A scalable platform for the development of cell-type-specific viral drivers. eLife. 8, 48089 (2019).

Tags

AAVEnhancerExpressionReporterConstructCloningPCRGibson CloningPlasmidVirus TiterIn VivoMouse Brain
check_url/62650?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Warren, T. L., Lambert, J. T., Nord, A. S. AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain. J. Vis. Exp. (181), e62650, doi:10.3791/62650 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image