Summary

Síntesis y caracterización de gotas de porfirina de cambio de fase multimodal

Published: October 15, 2021
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Summary

En este protocolo, se describen métodos para sintetizar y caracterizar gotas de porfirina multimodales de cambio de fase.

Abstract

Las gotas de cambio de fase son una clase de agentes de contraste de ultrasonido que pueden convertirse en microburbujas ecogénicas in situ con la aplicación de suficiente energía acústica. Las gotas son más pequeñas y más estables que sus contrapartes de microburbujas. Sin embargo, los agentes de contraste de ultrasonido tradicionales no son rastreables más allá de las mediciones de retroalimentación acústica, lo que dificulta la cuantificación de la biodis distribución o acumulación ex vivo del agente de contraste. Es posible que los investigadores tengan que confiar en partículas de diagnóstico acompañantes fluorescentes u ópticamente absorbentes para inferir la biodis distribución. El propósito de este protocolo es detallar los pasos para crear gotas de porfirina de cambio de fase multimodal utilizando un método de condensación. Las porfirinas son moléculas fluorescentes con distintas bandas de absorbancia que pueden conjugarse en lípidos e incorporarse a gotas para extender la versatilidad de las gotas, lo que permite una biodisponsión más robusta al tiempo que conserva las propiedades acústicas. Se hicieron siete formulaciones con diferentes contenidos de lípidos de porfirina y lípidos base para investigar las distribuciones de tamaño de microburbujas y gotas. Las caracterizaciones adecuadas para las estructuras que contienen porfirina también se describen en el protocolo para demostrar su versatilidad analítica en solución. El tamaño mostró que los diámetros medio posteriores a la condensación fueron de 1,72 a 2,38 veces más pequeños que las poblaciones precursoras. La caracterización de la absorbancia mostró que los ensamblajes intactos tenían un pico de banda Q de 700 nm, mientras que las muestras interrumpidas tenían un pico de absorbancia a 671 nm. La caracterización de la fluorescencia mostró que los ensamblajes intactos de porfirina-lípido del 30% se apagaron fluorescentemente (>97%), con una recuperación de fluorescencia lograda tras la interrupción. La vaporización acústica mostró que las gotas de porfirina no eran ecogénicas a presiones más bajas y podían convertirse en microburbujas ecogénicas con suficientes presiones. Estas caracterizaciones muestran el potencial de las gotas de porfirina para eliminar la necesidad de absorbancia o estrategias de diagnóstico complementarias basadas en la fluorescencia para cuantificar la biodis distribución del agente de contraste de ultrasonido para la administración o aplicaciones terapéuticas in vivo o ex vivo.

Introduction

Las imágenes de ultrasonido son una forma no invasiva y no ionizante de imágenes médicas que utiliza ondas acústicas. Mientras que los escáneres de ultrasonido son más portátiles y pueden proporcionar imágenes en tiempo real, las imágenes de ultrasonido pueden sufrir de bajo contraste, lo que dificulta que los ecografistas distingan de manera confiable características patológicas ecogénicas similares. Para contrarrestar esta limitación, se pueden inyectar microburbujas en el huésped para mejorar el contraste vascular. Las microburbujas son agentes de contraste llenos de gas del tamaño de micras que son altamente ecogénicos a las ondas acústicas y pueden proporcionar un contraste de recipiente mejorado1,2. Las carcasas y los núcleos de gas de las microburbujas se pueden adaptar para diferentes aplicaciones, como imágenes, trombólisis, permeabilización de la membrana celular o apertura vascular transitoria2.

Un inconveniente de las microburbujas es su corta circulación de vida media. Por ejemplo, las microesferas lipídicas de perflutrena clínicamente disponibles solo tienen una vida media de 1,3 minutos3. Para sesiones de imágenes largas, se necesitan múltiples inyecciones de microburbujas. Otro inconveniente de las microburbujas son sus grandes diámetros. Mientras que las microesferas lipídicas de perflutrena tienen alrededor de 1 a 3 μm de diámetro, lo suficientemente pequeñas como para circular en la vasculatura, son demasiado grandes para extravasar y acumularse pasivamente en tejidos de interés, como los tumores4. Una estrategia para superar estas limitaciones es condensar las microburbujas de núcleo de gas en gotas de núcleo líquido más pequeñas5,6. Si bien las gotas no son ecogénicas en su estado líquido, pueden vaporizarse en microburbujas al exponerse al ultrasonido con una presión negativa máxima suficientemente alta, recuperando su capacidad de proporcionar contraste. Esto permite que la gota aproveche la farmacocinética más favorable de un pequeño núcleo líquido, al tiempo que conserva la capacidad de proporcionar contraste cuando está insonado y sin cambiar la composición química4,7.

El decafluorobutano es un compuesto de perfluorocarbono ideal para el cambio de fase entre los estados gaseoso y líquido5,6,7. El decafluorobutano permite la condensación de microburbujas en gotas solo con reducción de temperatura, mientras que los perfluorocarbonos menos densos requieren presurización adicional5. Este método suave minimiza la destrucción de burbujas durante la condensación7,8,9. Como sus núcleos son líquidos, las gotas no son ecogénicas e invisibles para el ultrasonido. Sin embargo, con la aplicación de suficiente energía acústica o térmica, los núcleos líquidos pueden vaporizarse de nuevo en un estado gaseoso, generando microburbujas ecogénicas8. Esta vaporización permite controlar cuándo y dónde generar microburbujas.

Si bien las gotas son útiles para la acumulación pasiva, la vaporización in situ o la mejora de la permeabilidad celular4,las gotas (y sus fragmentos) no se pueden obtener imágenes ni cuantificar ex vivo. Por lo tanto, el agente de diagnóstico complementario cuantificable, como fluorescente4,10,11,partículas magnéticas12,agentes ópticamente absorbentes13,se utilizan como un análogo para medir la entrega de gotas a los tejidos de interés. Por ejemplo, Helfield et al. utilizaron una coinyección de nanoperlas fluorescentes para la cuantificación de imágenes histológicas de órganos de ratón ya que no se pudieron detectar gotas fluorescentemente4. La desventaja de los agentes de diagnóstico acompañantes es que el componente rastreable puede actuar independientemente de la gota dependiendo de su perfil farmacocinético individual.

Afortunadamente, la cáscara de microburbujas y gotas se puede personalizar. Por ejemplo, Huynh et al. demostraron agentes de contraste ecográfico con conchas de porfirina-lípido, creando microburbujas multimodales14. Las porfirinas son una clase de compuestos orgánicos con una estructura macrocítica aromática14,15. Son ópticamente absorbentes, fluorescentes y pueden quelatarse a una amplia variedad de metales para radioterapia, imágenes basadas en radionúclidos o cuantificación basada en metales traza14. Un ejemplo de porfirina es la pirofeofórbida (Pyro). Al conjugar Pyro sobre lípidos, la incorporación de pirolípidos en microburbujas o gotas permite que sean fotografiados y rastreados a través de múltiples modalidades: acústicamente, fluorescentemente y a través de absorbancia14. Este agente de contraste multimodal podría usarse para rastrear y cuantificar la acumulación. Esto podría eliminar la necesidad de agentes de diagnóstico complementarios, ya que el componente cuantificable ahora se conjuga en la carcasa, lo que permite una cuantificación de la entrega más precisa16.

Aquí, se describe un protocolo para crear gotas de porfirina de cambio de fase multimodal. Como los agentes de contrastes de ultrasonido se pueden utilizar como una plataforma para la administración de fármacos a tejidos de interés, como los tumores2,4,extender su detectabilidad más allá del ultrasonido podría resultar útil para la cuantificación de la eficacia de la administración. El propósito de estas gotas es proporcionar agentes de contraste de ultrasonido rastreables capaces de acumulación pasiva in vivo,vaporización in situ y acústica, y con el potencial de cuantificar la biodisposición o acumulación de órganos ex vivo sin depender de sensores secundarios. Los métodos de caracterización también se describen para mostrar el potencial de las gotas de porfirina como sensores de biodisponsión. También se discuten los efectos de la carga de pirolipídicos en la cáscara (0% a 50% por proporción molar).

Protocol

1. Películas lipídicas deshidratadas Calcule las masas de cada uno de los componentes de la carcasa necesarios (consulte el archivo complementario “Hoja de fórmula lipídica”).NOTA: Para este protocolo, la composición de la cáscara será: 10 molar % 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-5000] sal de amonio (DSPE-PEG5K), x molar % pyropheophorbide conjugado 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (Pyro-SPC), y (90 – x) molar % 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC). La cantidad de Pyro-SPC se variará entre 7 composiciones de conchas(x = 0, 1, 10, 20, 30, 40, 50). Compruebe el peso molecular de DSPE-PEG5K en la botella de stock. Escalar el protocolo a cualquier volumen lipídico con un volumen mínimo de 1 ml. Para este protocolo, se utilizó un volumen lipídico total de 10 ml con una concentración total de lípidos de 1 mg por ml para todas las formulaciones. La solución de excipiente será: 10% de propilenglicol, 10% de glicerol y solución salina tampón de fosfato al 80% (PBS, 1X, 7.4 pH) (% v / v / v) (ver Paso 2.3 y “Hoja de fórmula lipídica”).NOTA: El protocolo de síntesis de pirolipídicos se describe en el Archivo Suplementario “Otros Protocolos y Datos” Pasos S1 a S1.19, que fue modificado a partir del trabajo realizado por Zheng et al.15. Sobre la base de las masas calculadas (consulte el Paso 1.1 y la “Hoja de fórmula lipídica”), pese cada uno de los no pirolípidos y transfiéralo a un vial de vidrio de borosilicato de tamaño suficiente con una tapa atornillada. Tapa el vial, etiqueta la tapa y el vial, y cubre la parte inferior y las paredes del vial de lípidos con papel de aluminio. Este vial se denominará “Vial de lípidos” para el resto del protocolo. Guarde el vial de lípidos en un área fresca, seca y oscura. Si la formulación contiene Pyro-SPC, disolver 10 mg de película seca de Pyro-SPC (ver “Otros protocolos y datos”) en 1 ml de cloroformo. Vórtice durante 5 s, mida la absorbancia y calcule el volumen apropiado para agregar al vial de lípidos.PRECAUCIÓN:El cloroformo es un peligro para la salud, irritante y tóxico. Use una bata de laboratorio protectora, protección ocular, guantes y evite los vapores respiratorios.NOTA: Como Pyro-SPC es sensible a la luz, reduzca las luces en el área de trabajo si es posible cuando manipule Pyro-SPC. Mantenga Pyro-SPC sellado y cubierto cuando no esté en uso. En el espectrofotómetro ultravioleta-visible, configírelo para medir la absorbancia de un rango de longitud de onda de 800 nm a 300 nm con incrementos de 0,5 nm, y mida una línea de base con 2000 μL de metanol puro en una cubeta compatible de 1 cm de longitud de trayectoria.PRECAUCIÓN:El metanol es un peligro para la salud, irritante, tóxico e inflamable. Use una bata de laboratorio protectora, protección ocular, guantes y evite los vapores respiratorios. Mantener alejado de chispas y calor. Añadir 2 μL del Pyro-SPC en cloroformo en 2000 μL de metanol, y vórtice durante 30 s. Transfiéralo a una cubeta limpia y compatible de 1 cm y mida la absorbancia. Ajuste este factor de dilución si el pico de absorbancia a 667 nm fuera del rango de absorbancia del espectrofotómetro ultravioleta-visible.NOTA: Siempre que transfiera cloroformo o metanol, use una jeringa de vidrio limpia o una pipeta de desplazamiento positivo en lugar de una pipeta mecánica para una mejor precisión. Repita el paso 1.4.2 dos veces más para obtener valores de absorbancia triplicado. Promediar los valores máximos de absorbancia a 667 nm y utilizar la siguiente ecuación para calcular el volumen de Pyro-SPC en cloroformo necesario para el vial delípidos 14,15:donde V es el volumen de Pyro-SPC en cloroformo necesario, m es la masa requerida de Pyro-SPC (ver Paso 1.1 y “Hoja de Fórmula Lipídica”), M es el peso molecular de Pyro-SPC en 1040.317 g·mol-1, A es la absorbancia promediada a 667 nm, d es el factor de dilución basado en el metanol y Pyro-SPC en volúmenes de cloroformo (Paso 1.4.2), L es la longitud de la trayectoria de la cubeta a 1 cm, y ε es un coeficiente de atenuación molar de 667 nm de Pyro-SPC a 45000 L·mol-1·cm-1.NOTA: El denominador de la ecuación es la Ley de Beer-Lambert, que relaciona la concentración de un analito en solución con la absorbancia óptica medida a distancia. Agregue el volumen calculado de Pyro-SPC en cloroformo del paso anterior al vial de lípidos con una jeringa de vidrio limpio(Figura 1A)y luego cubra y cubra el vial.NOTA: La Figura 1 solo muestra la formulación de pirolipídicos al 30%. Si queda algún Pyro-SPC en el cloroformo: En una campana de humos, desencapar el vial de Pyro-SPC + cloroformo del paso 1.4, inclinar parcialmente el vial hacia un lado y fluir continuamente el gas nitrógeno lo más suavemente posible en el vial de Pyro-SPC/cloroformo. Gire el vial para secar el cloroformo utilizando el flujo de gas nitrógeno y para cubrir uniformemente el Pyro-SPC en la pared interior del vial a medida que se seca. Asegúrese de que no se hagan salpicaduras y que ninguna de las soluciones se caiga. Una vez que la película lipídica Pyro-SPC aparezca seca y recubierta en la pared del vial, apague el flujo de gas nitrógeno. Tapa el vial, sella el cuello del vial con una película de cera y guárdalo a -20 °C y en la oscuridad. Preparar una solución de 90% de cloroformo y 10% de metanol (% v/v), y añadir 5 ml de la misma al vial de lípidos. Tapa el vial de lípidos y gira suavemente para homogeneizar el contenido(Figura 1B).NOTA: Si la formulación contiene lípidos ácidos fosfatídicos (como sal de sodio 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphate (DSPA)), agregue: 60% de cloroformo, 32% de metanol y 8% de agua doble desionizada (% v / v / v) al vial de lípidos en su lugar. Puede ser necesario un remolino más intenso para disolver completamente el contenido de lípidos. En una campana de humos, desencapar el vial de lípidos, inclinar parcialmente el vial de lípidos hacia un lado y fluir continuamente el gas nitrógeno lo más suavemente posible en el vial de lípidos. Gire el vial de lípidos para secar la solución utilizando el flujo de gas nitrógeno y cubra uniformemente la película lipídica en la pared interior del vial de lípidos a medida que se seca. Asegúrese de que no se hagan salpicaduras y que ninguna de las soluciones se caiga. Una vez que los lípidos aparecen secos y recubiertos en las paredes interiores del vial de lípidos(Figura 1C),apague el flujo de gas nitrógeno, cubra la parte inferior y la pared del vial de lípidos con papel de aluminio y cubra la abertura superior con papel de aluminio pinchado con algunos orificios con una aguja para ventilar(Figura 1D). Etiquete y coloque el vial de lípidos cubierto dentro de un desecador al vacío y permita que los lípidos se sequen aún más durante al menos 24 h, pero no más de 72 h.NOTA: El protocolo se puede reanudar más tarde, después de 24 a 72 h. 2. Hidratación lipídica Llene un sonicador de baño con agua y caliéle a 70 °C. Encienda la sonicación para ayudar a mezclar el agua.PRECAUCIÓN:El agua y el sonicador están a altas temperaturas. Evite tocar el agua y el sonicador. Use protección para los ojos, una bata de laboratorio protectora y guantes protectores. Una vez que el sonicador de baño haya alcanzado los 70 °C, retire el vial de lípidos del desecador al vacío. Reduzca las luces en el área de trabajo si es posible. Preparar una solución de excipiente de propilenglicol al 10%, glicerol al 10%, PBS al 80% (% v/v/v) y añadir 10 ml al vial de lípidos (ver Paso 1.1.1 y “Hoja de fórmula lipídica”).NOTA: Si usa una pipeta de desplazamiento de aire estándar, tenga cuidado al manipular solventes viscosos como el propilenglicol y el glicerol. Aspire y sumerja el volumen lentamente y espere a que el volumen residual llegue a la parte inferior de la punta de la pipeta. Asegúrese de que el líquido no se adhiera al exterior de la punta de la pipeta al transferir volúmenes moviéndose lentamente. Cubra el vial de lípidos, retire la cubierta de aluminio y agite suavemente el vial en el sonicador del baño durante 15 minutos mientras la sonicación está encendida para disolver los lípidos. Asegúrese de que el cuello del vial de lípidos esté por encima del agua. De vez en cuando, compruebe si la tapa del vial está bien cerrada. Ocasionalmente, retire el vial de lípidos del baño de agua. Manténgalo brevemente a la luz para verificar si el contenido está completamente disuelto (Figura 1E). Si el contenido del vial lipídico no se homogeneiza, retire el vial lipídico del sonicador del baño. Asegure la tapa, gire más agresivamente y devuélvala al sonicador de baño. Retire el vial de lípidos del sonicador de baño y apague el sonicador de baño. Seque el exterior del vial de lípidos con toallas de papel y vuelva a etiquetar el vial de lípidos. Cubra el vial de lípidos con papel de aluminio y enfríe el vial de lípidos a temperatura ambiente en un área fresca, oscura y seca durante 10 minutos. Alícuota el contenido del vial lipídico: aproximadamente 2 ml de la solución lipídica en viales de suero transparente de vidrio de borosilicato de 3 ml (diámetro interno de la boca de 7 mm, diámetro de la boca externa de 13 mm).NOTA: Algunos protocolos pueden utilizar 1,5 ml de solución lipídica en el vial de 3 ml7. Tapa los viales de suero con tapones de goma de clorobutilo gris estilo liofilización (diámetro de boca interna de 7 mm, diámetro de boca exterior de 13 mm) y asegure el tapón de goma con sellos de aluminio desgarradores (diámetro de boca exterior de 13 mm) y una crimpadora(Figura 1F). Aspire, desgasifice y vuelva a presurizar la solución lipídica en cada uno de los viales séricos4,5,7 (Figura 2).NOTA: Consulte “Otros protocolos y datos” para obtener instrucciones sobre cómo ensamblar el intercambiador de gases y más detalles. Cierre todas las válvulas entre e incluyendo la válvula de presión A y la válvula del cilindro de gas (Figura 2). Conecte los viales de suero a las agujas del colector, luego abra las válvulas del colector correspondientes, luego abra la válvula de vacío A y la válvula de vacío B, y aspire a -90 kPa (-13 psi, -900 mbar) durante 5 minutos para eliminar el aire atmosférico. NO aspire el líquido (consulte los pasos S3 a S3.1.5 de “Otros protocolos y datos”).PRECAUCIÓN:La bomba de vacío puede estallar si se maneja incorrectamente. No utilice la bomba de vacío con productos químicos orgánicos, ácidos o básicos. Con el vacío aún encendido, sostenga un vial de suero (para evitar que se balancee) y tóquelo rápidamente con un bolígrafo o marcador para desgascarar. Siga golpeando hasta que no se formen burbujas y no haya burbujas en el vial. NO deje que se aspire ningún líquido. Pausa el toque si es necesario. Repetir para todos los viales de suero conectados. Después de desgascarar todos los viales de suero, CIERRE la válvula de vacío A y la válvula de vacío B y APAGUE la bomba de vacío (consulte los pasos S3.2 a S3.2.3 de “Otros protocolos y datos”). Con el vial de suero todavía conectado a la aguja y con la bomba de vacío apagada, gire lentamente la válvula del cilindro de gas 1/16 a 1/8 (aproximadamente 22.5 a 45 ° de revolución completa) en sentido contrario a las agujas del reloj para abrir parcialmente, luego abra la válvula de mango en T y LENTAMENTE gire la válvula reguladora de aire en el sentido de las agujas del reloj a un calibre de 3 psi (20.7 kPa). A continuación, abra la válvula de presión A y la válvula de presión B (consulte los pasos S3.3 a S3.3.21 de “Otros protocolos y datos”).PRECAUCIÓN:El cilindro de gas de decafluorobutano está bajo presión y puede explotar si se calienta. Manténgase alejado del calor y el impacto. El gas decafluorobutano puede causar desplazamiento y asfixia de oxígeno. Use protección ocular adecuada y manipule en una campana extractora. Si se maneja incorrectamente, es posible aspirar el cilindro de gas, lo que puede causar una rápida despresión e implosión. Abrir la válvula del cilindro de gas más de 1/8 de vuelta puede dañar el regulador de aire. Después de 30 s de presurización (el medidor aún debe leer 3 psi (20,7 kPa)), cierre todas las válvulas del colector con viales de suero, desconecte los viales de suero, envárre las agujas y CIERRE la válvula del cilindro de gas. Alivie la presión acumulada abriendo parcialmente una sola válvula de colector hasta que la aguja del medidor del regulador de aire pase a su posición de reposo. A continuación, cierre todo entre e incluyendo las válvulas del colector y el mango en T. Etiquete los viales de suero y guárdelos a 4 °C y en la oscuridad. Asegúrese de que todas las válvulas del intercambiador de gas estén cerradas y que la bomba de vacío se apague después.NOTA: El suero debe ser estable hasta por 4 meses en este estado. En este paso, el protocolo se puede reanudar más tarde, después de 4 meses como máximo. 3. Viales de decafluorobutano Con viales de suero transparente de vidrio de borosilicato limpios y vacíos (diámetro de boca interna de 7 mm, diámetro de boca externa de 13 mm), taparlos con tapones de goma de clorobutilo gris estilo liofilización (diámetro de boca interna de 7 mm, diámetro de boca exterior de 13 mm) y asegurar el tapón de goma con sellos de aluminio desgarro (diámetro de boca exterior de 13 mm) y una crimpadora4, 7,8. Siga el paso 2.9.1 para aspirar el aire atmosférico (consulte los pasos S3.1 a S3.1.5 de “Otros protocolos y datos”). Omita la desgasificación y siga los pasos 2.9.3 a 2.9.5 para volver a presurizar el vial (consulte los pasos S3.3 a S3.3.21 de “Otros protocolos y datos”). Etiquete los viales de decafluorobutano y guárdelos a 4 °C y en la oscuridad. Asegúrese de que todas las válvulas del intercambiador de gas estén cerradas y que la bomba de vacío se apague después.NOTA: Se necesitarán viales séricos llenos de gas decafluorobutano para la condensación de gotas. Deben ser estables hasta por 4 meses en este estado. En este paso, el protocolo se puede reanudar más tarde, después de 4 meses como máximo. 4. Formación de gotas Retire una solución lipídica hidratada en el vial de suero (de la etapa 2.10) de la nevera. Con un decapador, retire el sello de aluminio del vial de suero y transfiera 1 ml de la solución lipídica a un vial de muestra de vidrio de borosilicato de 1,85 ml (con un tapón de rosca fenólico) dejando que la solución lipídica fluya por la pared interior. No cree burbujas. Si queda alguna solución lipídica en el vial de suero, siga los pasos 2.9 a 2.10 para desgascarar y volver a presurizar el vial de suero para su almacenamiento (consulte los pasos S3 a S3.3.21 de “Otros protocolos y datos”). Con el vial de muestra de 1,85 ml, fluya suavemente el gas decafluorobutano hacia el espacio de cabeza del vial de muestra utilizando el intercambiador de gases (consulte la Figura 2 para conocer los nombres específicos de las válvulas). Asegúrese de que todas las válvulas del intercambiador de gases estén bien cerradas y que la bomba esté apagada.PRECAUCIÓN:Si se hace incorrectamente, es posible aspirar el cilindro de gas causando una rápida descompresión e implosión. Abra una válvula del colector y desenfunde cuidadosamente la aguja correspondiente del colector.PRECAUCIÓN:Objeto afilado, evite el contacto/perforación. Abra la válvula de presión A y la válvula de presión B y gire la válvula del cilindro de gas 1/16 a 1/8 (aproximadamente 22.5 a 45 ° de revolución completa) en sentido contrario a las agujas del reloj para abrir parcialmente y luego abrir la válvula de mango en T.PRECAUCIÓN:No abra la válvula del cilindro de gas más que esto, ya que podría causar daños al regulador de aire. Desconta el vial de muestra con la solución lipídica y muévalo para que la aguja del colector queden por encima de la interfaz líquido-aire dentro del vial. Sostenga el vial allí. Gire LENTAMENTE la válvula reguladora de aire en el sentido de las agujas del reloj hasta que la aguja del medidor del regulador de aire se mueva ligeramente de su posición de reposo y el gas perfluorocarbono fluya suavemente fuera de la aguja del colector. Deje que el gas perfluorocarbono fluya suavemente hacia el espacio de cabeza del vial durante 30 s. No cree burbujas. Ajuste la válvula reguladora de aire si es necesario.NOTA: La interfaz líquido-aire debe estar ligeramente perturbada por el flujo de gas decafluorobutano. Como el sistema ahora está abierto, el medidor del regulador de aire no puede leer correctamente la presión. Después de 30 s, tapar con cuidado y rapidez el vial de muestra sin mover demasiado el vial. Cierre la válvula del cilindro de gas (en el sentido de las agujas del reloj), la válvula de mango en T, la válvula del regulador de aire (en sentido antihoreláctico), la válvula de presión A, la válvula de presión B y la válvula del colector. Ensaline cuidadosamente la aguja. Etiquete el vial de muestra y selle el cuello con una película de cera en el sentido de las agujas del reloj(Figura 3A y 3B).NOTA: Las figuras 3B a 3F solo muestran la formulación de pirolipídicos al 30%. Guarde el vial de muestra en la oscuridad y a 4 °C durante al menos 10 minutos o hasta 24 h.NOTA: En este paso, el protocolo se puede reanudar más tarde, 24 h como máximo. Coloque aproximadamente 100 g de hielo seco (dióxido de carbono) en un recipiente aislado y coloque hielo regular en otro recipiente aislado. Recupere los viales de suero de decafluorobutano preparados mencionados en el Paso 3, dos agujas de calibre 20 de 3,81 cm (1,5 pulgadas), una jeringa de plástico de 1 ml (despega el émbolo antes de usarlo), un recipiente de 200 ml, pinzas de metal y un termómetro (-20 a 100 °C).NOTA: Si solo se hacen microburbujas, entonces no hay necesidad de isopropanol, hielo seco y hielo. Coloque el vial de muestra con la solución lipídica en el agitador mecánico y agite durante 45 s (Figura 3C). Después de la agitación mecánica, colóquelo el vial de muestra del lado derecho hacia arriba, protegido de la luz, e inicie una cuenta regresiva de 15 minutos para enfriar el vial y seleccionar el tamaño de las microburbujas8,17. Cuando la cuenta regresiva de 15 minutos haya alcanzado los 10 minutos (5 minutos restantes en la cuenta regresiva), llene un recipiente con aproximadamente 200 ml de isopropanol y enfríelo a -20 ° C con hielo seco con pinzas de metal.NOTA: La temperatura objetivo es de -15 a -17 ° C, pero el isopropanol se calentará mientras manipula las microburbujas.PRECAUCIÓN:El isopropanol es inflamable. Manténgase alejado del calor y las chispas. El hielo seco puede causar daños en la piel. Mango con pinzas. Use guantes, protección ocular y una bata protectora de laboratorio. Después de que las microburbujas hayan sido seleccionadas durante 15 minutos, busque la partición de tamaño seleccionada dentro del vial de muestra (Figura 3D). Mantenga el vial de muestra del lado derecho hacia arriba, desencuelte cuidadosamente el vial de muestra y retire aproximadamente 0,7 ml de la partición inferior con una aguja de calibre 20 de 1,5 pulgadas conectada a una jeringa de plástico de 1 ml. Asegúrese de que no se retire ninguna de las particiones superiores. No mueva la jeringa para quitar las bolsas de aire. Inserte una aguja de calibre 20 diferente en un vial de suero de decafluorobutano (manteniendo la aguja cerca de la parte superior del vial de suero) para ventilar y luego inserte la aguja / jeringa con las microburbujas de tamaño seleccionado. Transfiera lentamente las microburbujas seleccionadas por el tamaño. Incline el vial y incline la jeringa para dejar que el líquido se deslice por la pared interior del vial de suero de decafluorobutano. Una vez que se haya transferido toda la solución de microburbujeo seleccionada del tamaño, retire la aguja con la jeringa, pero mantenga la aguja de ventilación para aliviar la presión negativa(Figura 3E). Si solo hace microburbujas seleccionadas por tamaño, deténgase aquí. Mantenga la aguja de ventilación dentro y cerca de la parte superior. Mantenga el vial en la oscuridad y a temperatura ambiente. Agregue pequeñas cantidades de hielo seco o isopropanol a temperatura ambiente al baño de isopropanol para asegurarse de que la temperatura del baño esté entre -15 y -17 ° C. Con la aguja de ventilación de calibre 20 insertada cerca de la parte superior del vial de suero, coloque el vial de suero en el baño de isopropanol, manteniendo el nivel de microburbujas por debajo del nivel del isopropanol pero el cuello del vial por encima de él, y gire intermitentemente el vial de suero durante 2 minutos para condensar las microburbujas.NOTA: Este paso fue modificado a partir del trabajo realizado por Sheeran et al.6 No agite el vial de suero continuamente en el isopropanol y no deje que la solución se congele. Gire durante aproximadamente 5 s y levante el vial de suero del isopropanol. Verifique si hay nucleación de hielo y reanude el remolino en isopropanol. Si hay formación de hielo, gire el vial de suero en el aire hasta que se disipe. Después de la condensación de 2 minutos, retire el vial de suero del baño de isopropanol y retire la aguja de ventilación.NOTA: Las microburbujas deberían haberse condensado en gotitas, como lo indica el cambio en la translucidez(Figura 3E versus Figura 3F para la formulación de pirolipídicos al 30%). Limpie el vial de suero, etiquételo y colóquelo sobre hielo regular en un recipiente oscuro y aislado hasta que esté listo para su uso. Las gotas sin abrir (sello de aluminio intacto) deben ser estables en este estado hasta por 6 h, siempre y cuando el hielo derretido se reemplace según sea necesario. Cuando esté listo para usar, retire el sello de aluminio con el decapper. Mantenga las gotas (incluso los viales abiertos) en hielo y en la oscuridad mientras no esté en uso. Mantenga las microburbujas en la oscuridad y a temperatura ambiente. 5. Caracterización morfológica y óptica Preparar 1% Triton mediante: añadir 5 mL de Triton X-100 en 500 mL de PBS (1x, pH 7.4) y remover con una barra de agitación magnética hasta homogénea14.NOTA: Tritón X-100 muy viscoso. Si usa una pipeta de desplazamiento de aire estándar, tenga cuidado al manipular. Aspire y sumerja el volumen lentamente y espere a que el volumen residual llegue a la parte inferior de la pipeta. Asegúrese de que el líquido no se adhiera al exterior de la punta de la pipeta al transferir volúmenes moviéndose lentamente. Preparar gotitas (Paso 4). Si también se están caracterizando microburbujas, recoja un pequeño volumen de las microburbujas seleccionadas antes de la condensación (Paso 4.9). Dimensionar las microburbujas o gotas en un contador de Coulter (CC) de 0,2 a 6 μm para obtener distribuciones de tamaño y concentraciones (Figura 4). Llene una cubeta limpia de 20 ml con 10 ml de electrolito CC que se filtró a través del filtro de membrana de polietersulfona de poro de 0,2 μm. Mídalo en el CC con tres carreras para obtener una línea de base. En el mismo electrolito CC, agregue 5 μL de microburbuja o muestra de gota y mezcle suavemente.NOTA: Se pueden agregar de 2 a 20 μL de muestra dependiendo de qué tan concentrada esté la muestra. Ejecute la muestra en el CC (3 ejecuciones), reste la línea de base promediada y calcule la distribución del tamaño y la concentración (número por ml). Mida la absorbancia de gotas con espectroscopia UV-Vis (Figura 5).NOTA: La Figura 5 solo muestra la formulación de pirolipídicos al 30%. En el espectrofotómetro UV-Vis, establezca la medición de absorbancia como longitudes de onda de 800 nm a 300 nm con incrementos de 0,5 nm y habilite la corrección de línea de base. Usando una cubeta limpia de 1 cm de longitud de trayectoria llena de PBS, realice una medición de referencia. Asegúrese de que el volumen sea lo suficientemente alto como para intersectar la trayectoria del haz del espectroscopio. Diluir las gotas de pirolipídicos en PBS (se recomiendan de 2 μL a 500 μL de gotas en 2000 μL de diluyente) y mezclar mediante pipeteo.NOTA: NO Vórtice o de lo contrario los ensamblajes serán destruidos. Transfiera las gotas diluidas a una cubeta limpia y mida la absorbancia. Alterar las diluciones si es necesario. Repita los pasos 5.4.1 a 5.4.4, pero use Tritón al 1% en lugar de PBS. Después de la dilución, transfiera la muestra a un vial sellable/tapado y vórtice durante 30 s antes de medir. Medir la fluorescencia de microburbujas o gotitas (Figura 6).NOTA: La Figura 6 solo muestra la formulación de pirolipídicos al 30%. En el espectrofotómetro de fluorescencia, establezca la longitud de onda de excitación como 410 nm y el rango de longitud de onda de emisión de 600 a 750 nm con incrementos de 1 nm. Mida la fluorescencia del diluyente PBS para obtener una línea de base utilizando una cubeta que sea compatible con el espectrofotómetro de fluorescencia. Diluir las microburbujas o gotitas pirolipídicas en PBS (se recomiendan de 0,5 μL a 10 μL de gotas en 2000 μL de diluyente) y mezclar mediante pipeteo.NOTA: NO Vórtice o de lo contrario los ensamblajes serán destruidos. Transfiera la muestra diluida a la cubeta limpia y basal y mida la fluorescencia. Altere las diluciones si es necesario y evite la saturación de la señal. Repita los pasos 5.5.1 a 5.5.4, pero use Tritón al 1% en lugar de PBS. Después de diluir en Tritón al 1%, transfiera la muestra diluida a un vial sellable/tapado y vórtice durante 30 s antes de medir. Agregue suficiente volumen para garantizar que las burbujas generadas por el vórtice estén por encima de la trayectoria del láser.NOTA: La señal de fluorescencia de la muestra en Tritón será mucho mayor que en PBS debido al desencanto de fluorescencia (Figura 6). 6. Imágenes de vaporización Llene un tanque de agua del tamaño adecuado con agua desionizada y déjelo reposar durante 24 horas para equilibrar los gases en el agua con la atmósfera. Preparar las gotitas y mantener en hielo y en la oscuridad hasta su uso. Haga un tubo fantasma de flujo de agar al 2% como lo describen Pellow et al.18 Sumerja el fantasma en un tanque de agua calentado a 37 ° C. Calienta PBS a 37 °C y fluye a través del fantasma. Con un sistema de ultrasonido preclínico y un transductor de matriz lineal de 21 MHz (consulte la Tabla de materiales),alinee la vista con el fantasma de flujo, configure en imágenes en modo B, establezca las presiones de salida y capture videos o imágenes para adquirir líneas de base a cada presión. Diluir 20 μL de la gota en 50 ml de PBS de 37 °C y mezclar suavemente. Transfiera la solución a una jeringa de plástico de 30 ml y empuje la solución a través del fantasma de agar. Manteniendo la misma alineación que el Paso 6.5, aumente las presiones de salida hasta que se observe la vaporización (manchas brillantes en el fantasma, ver Figura 7).NOTA: La Figura 7 muestra la muestra de gotas de pirolipídicos al 30%. Este transductor de matriz lineal de 21 MHz disponible comercialmente es capaz de obtener imágenes y vaporizar gotas.

Representative Results

Las muestras de microburbujas precondensadas y seleccionadas por tamaño(n = 3) y las muestras de gotas postcondensadas(n = 3) se dimensionaron en un contador de Coulter (CC) con una apertura de 10 μm. Una limitación de la apertura de 10 μm es que no puede medir partículas menores de 200 nm, lo que puede sesgar el tamaño medio y la concentración. La Figura 4 muestra los datos de tamaño para cada una de las formulaciones con contenido de pirolipídicos. La Tabla 1 muestra estadísticas basadas en los datos de tamaño. Utilizando una relación de diámetros medianos pre y postcondensados, los resultados mostraron que la formulación de pirolipídicos al 0% tuvo el menor cambio de diámetro medio con 1,72 ± 0,02. La formulación de pirolipídicos al 50% tuvo el mayor diámetro medio con 2,38 ± 0,08. La muestra de gotas de pirolipídicos al 1% tuvo la concentración más alta observada en (2.71 ± 0.13) × 1010 / ml, mientras que la muestra de gotas de pirolipídicas al 40% tuvo la concentración observada más baja en (7.36 ± 0.81) × 109 / ml. Los datos de dimensionamiento mostraron que la muestra de gotas de pirolipídicos al 10% tenía el dímetro de pico más pequeño a 261 ± 13 nm, mientras que la muestra de gotas de pirolipídicos al 50% tenía el más grande con 390 ± 55 nm. En general, a medida que aumentaba el contenido de pirolipídicos, la concentración disminuía y el diámetro medio aumentaba. Como las muestras post-condensadas se basan en la muestra de microburbujeo precursora, la tendencia ocurrió para ambos tipos de agentes de contraste de ultrasonido. A medida que aumentaba el contenido de pirolipídicos, comenzó a formarse una subpoblación de microburbujas (con un tamaño máximo de aproximadamente 2000 μm). Este pico secundario no estuvo presente en la muestra de microburbujas pirolipídicas al 0% y fue más evidente en las poblaciones de pirolipídicos al 40% y 50%. La Figura 5 muestra mediciones representativas de absorbancia de la muestra de gotas de pirolipídicos al 30%. El pico de la muestra intacta en PBS fue de 700 nm, mientras que la muestra interrumpida en Tritón cambió el pico a 671 nm. Esto mostró que los ensamblajes intactos tienen diferentes propiedades ópticas en comparación con los componentes lipídicos individuales no ensamblados. La Figura 6A muestra mediciones representativas de fluorescencia de la muestra de microburbuja precondensada, mientras que la Figura 6B muestra de gotas postcondensadas con 30% de pirolípidos. La muestra intacta en PBS tuvo un pico de fluorescencia a 704 nm, mientras que la forma interrumpida tuvo un pico a 674 nm. Restando el área interrumpida debajo de la curva con el área intacta debajo de la curva, y dividiendo la diferencia por el área interrumpida debajo de la curva se obtiene la eficiencia de enfriamiento, que resulta ser 98.61% y 98.07% para la muestra de microburbuja pirolipídica del 30% y la muestra de gotas, respectivamente. Para demostrar que las gotas se convierten en microburbujas, se tomaron imágenes de gotas diluidas y se vaporizaron en un fantasma de flujo de 37 ° C con un sistema de ultrasonido. La Figura 7 muestra imágenes de ultrasonido representativas de la muestra de gotas de pirolipídicos al 30% fotografiada a diferentes presiones. A bajas presiones(Figura 7A),había muy poca señal, solo señal de fondo de burbujas de aire pegadas de la síntesis de agar. Esto se debe a que las gotitas no son ecogénicas y no dispersan el ultrasonido. A una potencia ligeramente alta, se generaron algunas microburbujas(Figura 7B)como lo demuestra la aparición de manchas brillantes. A medida que aumentaba la presión, se generaron más microburbujas(Figura 7C y 7D). Esto también demostró que las gotas no se vaporizan espontáneamente a 37 ° C. Figura 1: Imágenes de los pasos para formar la solución pirolipídica al 30%. A) Lípido en polvo más Pyro-SPC en cloroformo. B)Solución de disolución añadida. C)Película lipídica seca y recubierta en la pared interior del vial. D)Vial lipídico envuelto en papel de aluminio (papel de aluminio exterior pegado con cinta adhesiva para su reutilización). E)Solución lipídica hidratada. F)Solución lipídica en vial sérico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: El intercambiador de gases de 10 colectores. Las válvulas a las que se hace referencia en el protocolo están etiquetadas. Consulte el archivo complementario “Otros protocolos y datos” para obtener instrucciones sobre cómo ensamblar el intercambiador de gases. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: A) Las soluciones lipídicas de las 7 formulaciones (0% a 50% Pyro-SPC) en viales de muestra. Las figuras B a D muestran imágenes de los pasos dados para hacer un 30% de gotas de pirolipídicos. B)Solución pirolipídica al 30% en un vial de muestra. C)Post-agitación. D) Tamaño de 15 min seleccionado. E)Partición inferior transferida al vial de decafluorobutano. D)Post-condensación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4:Datos de dimensionamiento del contador de coulter (CC) de las muestras de microburbujas y gotas seleccionadas con diferentes contenidos de capa de pirolipídicos(n = 3). Las líneas verdes sólidas representan microburbujas y las líneas cian punteadas representan gotas. A) 0% Piro-SPC. B)1% Piro-SPC. C)10% Piro-SPC. D)20% Piro-SPC. E) 30% Piro-SPC. F)40% Piro-SPC. G)50% Piro-SPC. H) Las concentraciones totales observadas de muestras de microburbujas y gotas del CC basadas en el contenido de Pyro-SPC en la cáscara. Todas las barras de error indican una desviación estándar. Todas las mediciones se realizaron utilizando una apertura de 10 μm que tiene un rango de tamaño de 200 nm a 6000 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5: Mediciones representativas de la absorbancia por espectroscopia ultravioleta-visible (UV-Vis) de 300 a 800 nm de la muestra de gotas de pirolipídico al 30% posterior a la condensación diluida en PBS y en tritón al 1%. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 6: Emisión de fluorescencia representativa de 600 a 750 nm excitada a 410 nm. A) Muestra de microburbujas pirolipídicas al 30% seleccionadas por tamaño y precondensadas al 1% en Tritón. B)Muestra de gotas de pirolipídicas al 30% post-condensadas en PBS y en Tritón al 1%. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 7: Imágenes de ultrasonido representativas de un fantasma de flujo de agar de 37 °C tomadas con un transductor de matriz lineal preclínico de 21 MHz en modo B (ver Tabla de Materiales). La columna izquierda(Figuras A, C, Ey G)muestra los controles de PBS. La columna derecha(Figuras B, D, Fy H)muestra 20 μL de muestra de gotas de pirolipídicas al 30% posteriores a la condensación diluidas en 50 ml de PBS de 37 °C. Cada fila representa las presiones negativas máximas de campo libre, que se estimaron a partir del trabajo realizado por Sheeran et al.8 Los triángulos amarillos indican la profundidad de enfoque. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Método Agente Pyro Shell % 0 1 10 20 30 40 50 CC Burbujas Conc. [/mL] (2.76 ± 0.28) × 10^10 (3.04 ± 0.15) × 10^10 (2.02 ± 0.11) × 10^10 (1.91 ± 0.22) × 10^10 (1.47 ± 0.05) × 10^10 (8.47 ± 0.95) × 10^9 (9.89 ± 0.15) × 10^9 CC Burbujas Pico [nm] 329 ± 6 297 ± 15 305 ± 21 273 ± 14 310 ± 40 266 ± 33 393 ± 89 CC Burbujas Media [nm] 609 ± 2 603 ± 15 635 ± 6 690 ± 8 812 ± 1 935 ± 22 950 ± 55 CC Burbujas Mediana [nm] 450 ± 6 421 ± 6 414 ± 6 432 ± 5 490 ± 2 596 ± 37 695 ± 41 CC Gotas Conc. [/mL] (2.18 ± 0.07) × 10^10 (2.71 ± 0.13) × 10^10 (1.75 ± 0.18) × 10^10 (1.72 ± 0.13) × 10^10 (1.09 ± 0.01) × 10^10 (7.36 ± 0.81) × 10^9 (7.38 ± 0.28) × 10^9 CC Gotas Pico [nm] 292 ± 0 297 ± 17 261 ± 13 280 ± 9 268 ± 17 287 ± 38 390 ± 55 CC Gotas Media [nm] 353 ± 5 350 ± 5 347 ± 1 347 ± 4 397 ± 1 399 ± 6 400 ± 7 CC Gotas Mediana [nm] 318 ± 4 318 ± 4 310 ± 1 315 ± 2 340 ± 0 367 ± 5 370 ± 9 Tabla 1: Estadísticas de datos de dimensionamiento de las muestras de microburbujas y gotas con diferente contenido de Pyro-SPC del Contador de Coulter (CC) (n = 3). Todos los errores indican desviación estándar. Información complementaria – Hoja de fórmula de lípidos: Haga clic aquí para descargar este archivo. Información complementaria – Otros protocolos y datos: Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

Después de agregar todos los componentes lipídicos juntos (Pasos 1.2 y 1.4.5, Figura 1A),se agregó una solución de cloroformo y metanol (y agua si hay lípidos ácidos fosfatídicos como DSPA) para garantizar que los componentes pirolipídicos y no pirólipos se homogeneizaron completamente (Paso 1.5, Figura 1B). Para prevenir la formación de vesículas lipídicas con composición lipídica heterogénea, los lípidos disueltos se secaron y se recubrieron en el interior de la pared del vial como una película delgada(Figura 1C). El recubrimiento (Paso 1.6) también facilita la hidratación (Paso 2.1 a 2.4) ya que aumenta el área de superficie de la película seca. El secado (Paso 1.6, Figura 1C)y la aspiración (Paso 1.8, Figura 1D)se realizaron para garantizar que el cloroformo y el metanol se evaporaron por completo, ya que estos productos químicos pueden interrumpir la formación de microburbujas. Si bien el protocolo se puede reducir para reducir los volúmenes de solución lipídica tan bajos como 1 ml, los volúmenes más grandes pueden reducir la variación de vial a vial. Si bien esto puede correr el riesgo de degradar el Pyro-SPC mientras no está en uso, la condición de almacenamiento de la solución lipídica (Paso 2.9 a 2.10) estaba destinada a reducir ese riesgo. El paso de desgasificación con el intercambiador de gases (Paso 2.9.2, Figura 1F y Figura 2)sirve para eliminar la mayor cantidad de oxígeno posible para evitar la oxidación. No se recomienda almacenar soluciones lipídicas que contengan lípidos de porfirina mientras los gases atmosféricos todavía están disueltos en la solución (Figura 1E).

En el paso 2.10, la solución lipídica se encuentra en un vial sérico con un espacio de cabeza presurizado, similar a cómo se venden las microesferas lipídicas perflutrena del agente de contraste de ultrasonido clínicamente aprobadas (similar a la Figura 1F). El trabajo interno ha demostrado que las microburbujas estables no se pueden generar a través de la agitación mecánica con la presencia de pirolipídicos si la tapa fuera un material blando como el tapón de goma. Por lo tanto, la solución lipídica se transfirió a un vial de muestra con una tapa fenólica sin goma (Pasos 4.1 a 4.4, Figura 3A y 3B). Cuando el gas decafluorobutano fluyó hacia el vial de muestra (pasos 4.1 a 4.4), el decafluorobutano más denso debe desplazar el aire atmosférico en el espacio de cabeza del vial de muestra. Actualmente, se desconoce por qué los pirolipídicos no pueden formar microburbujas con tapones de goma. Sin pirolipídicos, se pueden hacer microburbujas estables directamente en los viales de suero con tapones de goma4,7. Por lo tanto, se recomienda utilizar el intercambiador de gases para desgasificación y volver a presurizar el vial de suero y luego agitar el vial de suero para formulaciones no pirolipídicas4,5,6,7 (ver “Otros protocolos y datos”). La ventaja de poder agitar mecánicamente en el vial de suero es que el espacio de cabeza se puede presurizar y la selección del tamaño se puede hacer invirtiendo el vial de suero al revés8. En este protocolo, la formulación de pirolipídicos al 0% se transfirió a un vial de muestra (pasos 4.1 a 4.4) para ser consistente con las formulaciones que contenían pirolipídicos. Además, las longitudes más largas de la cadena lipídica de acilo dan como resultado gotas más estables debido a mejores interacciones de van der Waals19. La composición de la cubierta lipídica se eligió en función de lo que estaba disponible comercialmente, la longitud de la cadena de 18 acil para todos los tipos de lípidos. DSPE-PEG5K se incorporó en toda la formulación (Paso 1.1) ya que la presencia de las cadenas de polietilenglicol impide la coalescencia de las estructuras a través de fuerzas estéricas repulsivas19. Durante la hidratación lipídica, el baño sonicador de baño se estableció a 70 °C (Paso 2.1) lo suficientemente alto como para dispersar completamente la película lipídica de longitud de cadena de 18 acil18. Para longitudes de cadena de acilo más largas, se requerirán temperaturas más altas.

Una mayor carga de pirolipídicos aumentaría la concentración de componentes ópticamente absorbentes y fluorescentes, lo que puede ser deseado para ciertas aplicaciones que se benefician de la carga maximizada de porfirina. Sin embargo, a medida que aumentaba el contenido de pirolipídicos, la concentración de gotas observable disminuía y los diámetros aumentaba(Figura 4 y Tabla 1). Esto ilustra una compensación entre la fluorescencia óptica y las propiedades de absorbancia frente a la concentración y el diámetro de las gotas. Para los investigadores que deben priorizar los diámetros pequeños para la acumulación in vivo a través de pequeños vasos con fugas o si se necesita inyectar una alta concentración de gotas, el aumento de la carga de pirolipídicos puede no valer la pena el aumento en el dímetro de gotas o la disminución de la concentración de gotas. Si las altas concentraciones de gotas y / o los diámetros de gotas pequeñas son primordiales, se deben considerar agentes de diagnóstico complementarios de tamaño similar en lugar de pirolipídicos. Mientras que el 1% de gotitas de pirolipídicos no resultó en una disminución en la concentración o aumento en el tamaño, el 1% de la carga de pirolipídicos puede ser demasiado baja para ser razonablemente detectable desde el fondo del tejido fluorescentemente. Sin embargo, la flexibilidad de la fracción de porfirina proporciona múltiples opciones para la funcionalización que impartirán medios alternativos de cuantificación más adecuados para aplicaciones de baja concentración. Por ejemplo, los pirolipídicos pueden ser quelados con cobre-64 para imágenes de tomografía por emisión de positon y conteo gamma20,o con paladio para cuantificación de metales traza mediante espectrometría de masas, o con manganeso para imágenes por resonancia magnética14.

Si bien algunos experimentos solo requieren un pequeño volumen de la solución de gotas, se necesita 1 ml de la solución lipídica para llenar el vial de muestra de 1,85 ml. Goertz et al. demostraron que los cambios en el manejo, la presión del espacio de cabeza, la relación líquido-gas e incluso la forma del vial pueden afectar a las poblaciones de microburbujeos17. La temperatura del vial durante la agitación y la selección del tamaño también pueden influir en la distribución del tamaño. Por lo tanto, para los métodos optimizados por el usuario final, es fundamental ser lo más consistente posible al hacer gotas. Las gotas sin abrir pueden congelarse (-20 ° C) y descongelarse más tarde para su uso futuro, pero esto afectará a las poblaciones de tamaño.

El procedimiento de agitación que activa una solución lipídica en microburbujas no produce una población morfológicamente homogénea (Paso 4.6); más bien, la muestra está llena de microburbujas, vesículas multilamelares, liposomas y micelas18,21,22. Mientras que los tamaños de microburbujeos abarcan el rango de micras y nanómetros, las otras estructuras están en gran medida por debajo de 800 nm 23. Las técnicas de dimensionamiento utilizadas no distinguen entre estas diversas estructuras y, por lo tanto, las muestras de microburbujas post-agitadas (Paso 4.6, Figura 3C) y las muestras de gotas post-condensadas (Paso 4.14, Figura 3F) deben asumirse como mezclas. Los ensamblajes insensibles al ultrasonido (vesículas multilameláres, liposomas y micelas) probablemente se conservan después de la condensación y no cambiarán de tamaño, ya que no tienen núcleos cambiables de fase. Dado que el Contador de Coulter no puede distinguir entre estos diferentes ensamblajes supramoleculares, el cambio en el tamaño de la población después de la condensación debe interpretarse con la suposición de que una cierta proporción de las estructuras a nanoescala son inconvertibles y contribuyen a la población observada en esa región de tamaño. Adicionalmente, estas estructuras contribuyen a las firmas espectroscópicas y fluorescentes de estas muestras14. Las firmas de fluorescencia y absorbancia de micelas, liposomas/vesículas y gotitas son todas similares, incluyendo su grado de enfriamiento de fluorescencia14. Por lo tanto, es importante considerar que hay una mezcla de ensamblajes en las Figuras 3C a 3F, la Figura 4,la muestra diluida de PBS en la Figura 5y la muestra diluida de PBS en la Figura 6.

Después de seleccionar el tamaño y antes de la condensación (Paso 4.9), es posible eliminar los conjuntos sin burbujas centrifugando la muestra de microburbujas para separar las burbujas flotantes de los conjuntos no flotantes como lo describen Feshitan et al.21 El grado de separación se puede controlar ajustando la fuerza de espín y la duración. Sin embargo, los experimentos de condensación de microburbujas de tales muestras aisladas de tamaño revelaron que el uso de las poblaciones de microburbujas precursoras más grandes que se seleccionan utilizando procedimientos de aislamiento de tamaño produjo gotas más grandes (consulte el paso S5 “Otros protocolos y datos” para el tamaño posterior a la burbuja y las gotas). Dado que una aplicación prevista de gotas producidas con este protocolo es una plataforma para la extravasación pasiva y la acumulación debido a su pequeño tamaño en comparación con las microburbujas4,8,se deseaban poblaciones de gotas que fueran lo más pequeñas posible. Por lo tanto, este protocolo utilizó muestras de microburbujes post-agitadas que no fueron aisladas de tamaño a través de centrifugación, incluso si eso significaba que las micelas, liposomas y vesículas insensibles al ultrasonido estaban presentes en la solución final. Esto implica que los procedimientos de cuantificación para la biodisponsión derivarán señal para todas las estructuras inyectadas y no se limitan solo a las gotas. Sin embargo, dado que estas estructuras de tamaño similar probablemente se acumulan a través de un mecanismo pasivo que está dictado principalmente por el tamaño, no se sospecha que esto deba cambiar las principales inferencias que se pueden hacer si esta plataforma se va a utilizar in vivo,aunque todos estos aspectos deben considerarse individualmente dependiendo del contexto en el que se pueda utilizar la plataforma. Se pueden realizar pruebas con brazos experimentales con y sin ultrasonido para garantizar que sean las gotas sensibles al ultrasonido las responsables de cualquier cambio en la biodisponsión, ya que solo los ensamblajes de núcleos de perfluorocarbono en la solución responderán al ultrasonido.

Después de la agitación, el vial se descansó durante 15 minutos y se observó una partición en el vial(Figura 3C versus 3D). La selección de tamaño a través de la flotabilidad es un método simple para eliminar las estructuras / burbujas más grandes de una solución de microburbuja activada8,17. En este caso, las partículas con diámetros superiores a 5 μm se eliminaron principalmente después de la selección del tamaño(Figura 4). El alcance de la selección de tamaño se puede ajustar controlando la duración de la selección de tamaño17. Sheeran et al. han demostrado que no seleccionar el tamaño puede resultar en microburbujas generadas que ocluyen la vasculatura8.

Los perfluorocarbonos tienen la ventaja de ser biológicamente inertes7. Mientras que el punto de ebullición del decafluorobutano es de -1,7 °C, por encima de la temperatura corporal, las gotas no se vaporizan inmediatamente cuando se exponen a 37 °C(Figura 7B). Como las gotas son metaestables a 37 °C, se necesita energía acústica adicional para vaporizar las gotas a microburbujas7,9. Poprosky et al. han demostrado gotas de porfirina condensadas mediante presurización22. Este es un método viable e incluso esencial cuando se usan perfluorocarbonos menos densos, pero las altas presiones pueden destruir algunas burbujas en el proceso. El octafluoropropano (C3F8) tiene un punto de ebullición de -36.7 ° C, por lo que se necesita tanto el enfriamiento como la presurización para la condensación de gotas. Sin embargo, el perfluorocarbono más ligero conduce a gotas menos estables. El dodecafluoropentano (C5F12) puede dar lugar a gotas más estables con un punto de ebullición de 28 °C. Sin embargo, es un líquido a temperatura ambiente y necesitará energías acústicas más fuertes para vaporizarse. Por lo tanto, la elección del gas que contiene el agente de contraste de ultrasonido debe considerar las condiciones de su aplicación biológica prevista, además de los parámetros de su fabricación. En este protocolo, el baño de isopropanol para condensación se estableció en -15 a -17 °C (Paso 4.7.1 y Paso 4.13) mientras que otros protocolos utilizaron -10 °C 5,6. Incluso con un núcleo de decafluorobutano común, la temperatura de condensación puede variar según la composición del excipiente, la concentración total de lípidos y la composición de la cubierta lipídica. Si se utilizan otras formulaciones, es posible que se requiera una optimización para garantizar una condensación adecuada de las gotas sin hacer que la solución se congele.

Como las gotas son más pequeñas y más estables que su precursor de microburbujas7,pueden aprovechar mejor los mecanismos de acumulación pasiva para extravasar en ciertos tejidos de interés, como la permeabilidad mejorada y el efecto de retención de ciertos tipos de tumores4,24. Con métodos de detección fluorescentes, ópticamente absorbentes y acústicos14,es posible utilizar una sola formulación para cuantificar la absorción. Además, esta plataforma se puede utilizar para investigar si la vaporización acústica de las gotas puede mejorar la fracción del agente entregado más allá de los niveles pasivos16. Para cuantificar la biodisponsión del agente en tejidos y órganos de interés después de la inyección, se debe inyectar una cantidad conocida de gotas de pirolipídicos en el animal, se puede o no aplicar ultrasonido dependiendo del conjunto de control, se debe sacrificar al animal un punto de tiempo prees especificado y los órganos deben extraerse y pesarse. Los órganos deben ser homogeneizados, filtrados, diluidos en surfactante (detergente) para descelularizar el tejido, y cuantificados con fluorescencia o espectroscopia UV-Vis para obtener porcentajes de dosis inyectados por masa de órgano en función de las señales de Pyro. Para el Paso 5.4.5(Figura 5)y el Paso 5.5.5(Figura 6),se utilizó el surfactante Triton X-100 (detergente) para interrumpir las muestras, ya que no es fluorescente a 410 nm y sus longitudes de onda de absorbancia no se superponen con las de Pyro.

Las microburbujas no se caracterizaron con absorbancia UV-Vis. Como la fuente láser del espectroscopio UV-Vis es paralela al detector, cualquier burbuja grande podría dispersar la luz lejos del detector, haciéndolas parecer más absorbentes ópticamente14. A diferencia del espectrofotómetro UV-Vis, el detector del espectrofotómetro de fluorescencia es / debe ser perpendicular a la fuente láser para evitar que la fuente interfiera con el detector. Se utilizó UV-Vis para cuantificar la absorbancia de las muestras de gotas intactas e interrumpidas (Paso 5.4, Figura 5). Se eligieron de 300 a 800 nm como longitudes de onda de absorbancia ya que las dos bandas principales de absorbancia de pirolipídico, la banda de Soret (340 a 500 nm) y la banda Q (640 a 730 nm), se encuentran dentro de este rango14. Cuando se ensambla en una gota (u otras estructuras supramoleculares), el pico de la banda Q de pyro-lipid se desplaza al rojo de 671 nm a 700 nm(Figura 5). Cuando esta estructura supramolecular es interrumpida por un surfactante como Tritón, el pico vuelve a 671 nm14,15. Sobre la base de este cambio, es posible saber si los pirolipídicos están en un estado ensamblado o en un estado interrumpido. La relación de los dos picos se puede utilizar para estimar la descomposición de los ensamblajes a lo largo del tiempo.

Para las mediciones de fluorescencia (Paso 5.5, Figura 6),se eligió una longitud de onda de excitación de 410 nm ya que corresponde al pico de la banda de Soret para pirolipídico no ensamblado14. Se seleccionó un rango de longitud de onda de emisión de 600 a 800 nm, ya que los picos de los conjuntos intactos en PBS y los pirolipídicos interrumpidos en Tritón están contenidos dentro de este rango. El desplazamiento y aumento de la fluorescencia(Figura 6)entre las muestras intactas (704 nm en PBS) e interrumpidas (674 nm en Tritón) se produjo debido al enfriamiento inducido por la estructura. En la forma ensamblada, las moléculas de pirolípidos se empaquetaron muy juntas, por lo que los fotones generados fueron absorbidos por las moléculas de pirolípidos cercanas. Esto es evidente en la eficiencia de enfriamiento intacta versus interrumpida. Por lo tanto, es necesario diluir muestras en surfactante (detergente) como Triton X-100 al 1% para aliviar el enfriamiento y maximizar la señal para la cuantificación de la biodistribuición14.

Para simplificar, se utilizó el mismo transductor de ultrasonido de matriz lineal tanto para vaporizar como para obtener imágenes (Pasos 6.5 y 6.7, Figura 7). Este transductor de ultrasonido (Tabla de Materiales) fue capaz de alcanzar las presiones negativas máximas necesarias para vaporizar las gotas8. Llenar un tanque con agua desionizada de un grifo genera gases que se disuelven en el agua (Paso 6.1). Para minimizar la interferencia de los gases disueltos en el agua con vaporización e imágenes, el agua se descansó durante 24 horas en el tanque para permitir que los gases en el agua se equilibraran con la atmósfera (Paso 6.1). Alternativamente, el agua desionizada se puede desgasificación con un recipiente de tamaño suficiente y sellable conectado a un vacío suficientemente potente. Las imágenes de ultrasonido demostraron que las microburbujas se condensaron con éxito ya que las gotas no eran observables / no ecogénicas a bajas presiones (Figura 7B). Fue solo a presiones de salida más altas que las gotas se vaporizaron en microburbujas ecogénicas observables(Figura 7D,7F, 7H). Si bien la muestra de gotas post-condensada contiene micelas y liposomas / vesículas, estos ensamblajes no son ecogénicos y solo las gotas pueden vaporizarse en microburbujas ecogénicas. Se fluyó un control de PBS a través del fantasma para establecer imágenes de referencia(Figuras 7A, 7C, 7E, 7G). A medida que la presión aumentaba en el PBS, no se generó contraste. Esto indicó que las altas presiones del transductor no podían producir cavitación espontánea solo en un medio a base de agua, y por lo tanto todo el resto del contraste generado podría atribuirse al agente de contraste de ultrasonido empleado. Si la presión de salida es demasiado alta, las microburbujas generadas pueden ser destruidas. Al aumentar gradualmente la presión y observar el contraste generado, se puede encontrar la presión óptima8. La vida media de circulación de las gotas se puede determinar de manera similar vaporizando las gotas son ciertos intervalos de tiempo y observando el contraste generado a lo largo del tiempo7.

En resumen, se crearon gotas de cambio de fase multimodal con contenido variable de pirolipídicos con el método de condensación. El dimensionamiento mostró que había una compensación entre la carga de pirolipídicos y la concentración de microburbujas/gotas. Las caracterizaciones mostraron que había diferencias en las formas intactas e interrumpidas tanto en la absorbancia como en la fluorescencia. Las imágenes de ultrasonido mostraron que las gotas no eran ecogénicas a 37 ° C y se vaporizaban en microburbujas ecogénicas a presiones suficientes. Las caracterizaciones también mostraron el potencial de las gotas de pirolipídicos para reemplazar los agentes de diagnóstico acompañantes para las pruebas de biodis distribución o acumulación de gotas. El trabajo futuro investigará los umbrales de vaporización en solución, la estabilidad en solución y las duraciones de circulación in vivo en ratones desnudos.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores desean agradecer al Dr. Brandon Helfield por ayudar a construir el intercambiador de gas y al Dr. Miffy Hok Yan Cheng por las discusiones técnicas. Los autores desean agradecer a las siguientes fuentes de financiamiento: Ontario Graduate Scholarship, Canadian Institutes of Health Research, Terry Fox Research Institute y Princess Margaret Cancer Foundation.

Materials

1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-5000] (ammonium salt) Avanti Polar Lipids 880220 Also known as "DSPE-PEG5K"
1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 855775 Also known as "DSPC"
Aluminum Foil Any brand
Aluminum Seals, Tear-Off VWR 16171-840 Standard Aluminum, 13 mm outer diameter
Bath Sonicator Any brand Capable of  sonicating and heating up to 70 °C,
Bio-Stor Screw Cap Vials National Scientific BS20NABP Plastic, 2 mL Skirted, with O-ring
Borosilicate glass clear serum vials VWR 16171-285 3 mL, 7 mm inner mouth diameter, 13 mm outer mouth diameter
Borosilicate Glass Sample Vial with Phenolic Screw Cap VWR 66011-020 1.85 mL, Short Form Style, 12 mm outer diameter, 35 mm height, 8-425 cap size
Borosilicate Glass Vial with Screw-On cap Any brand Sizes will depend on desired volumes
Chloroform  Any brand
Coulter Counter Elctrolyte Diluent Any brand Compatible with Coulter Counter
Decafluorobutane (C4F10) FluoroMed 355-25-9
Deionized Water Any brand
Dry Ice (Carbon Dioxide) Any brand
Dynamic Light Scattering (DLS) Particle Analyzer Any brand Capable of temperature control
E-Z Crimper, 13 mm Wheaton W225302 13 mm Standard Aluminum Seals
E-Z Decapper, 13 mm Wheaton W225352 13 mm Standard Aluminum Seals
Fluorescent Spectrophotometer Any brand Capable of 400 to 600 excitation and 300 to 800 nm emission detection, detector perpendicular to laser source
Fluorescent Spectrophotometer Compatible Cuvette Any brand Can hold at least 2 mL, capable of 300 to 800 nm, all four sides are  optical windows 
Gas Exchanger Made in-house Refer to Supplementary Information – "Other Protocols and Data" for assembly instructions.
Glass syringes Any brand Sizes will depend on desired volumes
GLWR Custom Aperture Tube 10 um Beckman Coulter B42812 10 µm aperture, compatible with Beckman Coulter MultiSizer 4e
Glycerol Any brand
Insulated Styrofaom containers with lids Any brand
Isopropanol Any brand
Lyophilization-Style Rubber Stoppers VWR 71000-060 7 mm inner mouth diameter, 13 mm outer mouth diameter, 2-leg, Chlorobutyl
Membrane Diaphram Vacuum Pump Sartorius Stedim 16694-1-60-06 Adjustable pressure
Metal Tongs Any brand
Methanol Any brand
MS250 21 MHz Linear Array Ultrasound Transducer VisualSonics 21 MHz, Capable of B-mode and non-linear imaging.
MultiSizer 4e Beckman Coulter Capable of sizing from 0.2µm to 6 µm
Nalgene Rapid-Flow Sterile Single Use Vacuum Filter Units Thermo Scientific 567-0010 Polyethersulfone (PES) membrane, 0.1μm pore size, 1000 mL volume. As Isoton II is non-sterile, can use Filter units multiple times
Needles, Conventional BD 305176 20 gauge, 1.5 inch length
Nitrogen Gas Any brand Make sure there are regulator valves and tubes to direct the flow. Setup will be dependend on brand and source.
Parafilm Any brand Called "wax film" in the protocol.
Phosphate Buffered Saline (PBS) Any brand 1X, 7.4 pH
Pipette Any brand Sizes will depend on desired volumes
Pipette Tips Any brand Sizes will depend on desired volumes
Plastic Syringes Any brand 1 mL, 3 mL, and 30 mL. With Luer Lock connections
Polyethersulfone (PES) Membrane Filter Any brand 0.2 µm pore size
Propylene Glycol Any brand
Pyropheophorbide conjugated 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine Made in-house Also known as "Pyro-SPC". Refer to "Supplementary Information – Other Protocols and Data" for synthesis.
Thermometer Any brand (-20 to 100 °C)
Triton X-100 Any brand Also known as "2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol"
Ultrapure Water Any brand Type 1 Purity
Ultraviolet–Visible (UV-Vis) Spectrophotometer Any brand Capable of absorbance from 300 to 800 nm, at least 0.5 nm resolution
Ultraviolet–Visible (UV-Vis) Spectrophotometer Compatible Cuvette, 1 cm Path Length Any brand Can hold at least 2 mL, capable of 300 to 800 nm
Vacuum Desiccator Any brand
Vevo 2100 Ultrasound Imaging Platform VisualSonics Pre-clinical ultrasound imaging system
Vialmix Bristol-Myers-Squibb Called "mechanical agitator" in the protocol. Agitates for 45 s.
Vortex Mixer Any brand

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Cite This Article
Yoo, K., Dhaliwal, A., Chen, J., Sheeran, P. S., Zheng, G. Synthesis and Characterization of Multi-Modal Phase-Change Porphyrin Droplets. J. Vis. Exp. (176), e62665, doi:10.3791/62665 (2021).

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