I dette manuskriptet beskriver vi en enkel metode for vekst, rensing og titrering av det onkolytiske herpes simplex-viruset for preklinisk bruk.
Onkolytiske virus (OVs), som onkolytisk herpes simplex virus (oHSV), er en raskt voksende behandlingsstrategi innen kreftimmunoterapi. OVer, inkludert oHSV, replikerer selektivt i og dreper kreftceller (sparer sunne / normale celler) mens de induserer anti-tumorimmunitet. På grunn av disse unike egenskapene blir oHSV-baserte behandlingsstrategier i økende grad brukt til behandling av kreft, preklinisk og klinisk, inkludert FDA-godkjent talimogene laherparevec (T-Vec). Vekst, rensing og titrering er tre viktige laboratorieteknikker for alle OVer, inkludert oHSVer, før de kan brukes til eksperimentelle studier. Dette dokumentet beskriver en enkel trinnvis metode for å forsterke oHSV i Vero-celler. Etter hvert som oHSVer multipliserer, produserer de en cytopatisk effekt (CPE) i Vero-celler. Når 90-100% av de infiserte cellene viser en CPE, blir de forsiktig høstet, behandlet med benzonase og magnesiumklorid (MgCl2), filtrert og utsatt for rensing ved hjelp av sukrosegradientsmetoden. Etter rensing bestemmes antall smittsomme oHSV (betegnet som plakkdannende enheter eller PFUer) av en “plakkanalyse” i Vero-celler. Protokollen som er beskrevet her, kan brukes til å forberede høytitrener oHSV-lager for in vitro-studier i cellekultur og in vivo dyreforsøk.
Onkolytiske virus (OVer) er en fremvoksende og unik form for kreftimmunoterapi. OVer replikerer selektivt i og lyse tumorceller (sparer normale / sunne celler)1 mens de induserer anti-tumorimmunitet2. Onkolytisk herpes simplex virus (oHSV) er en av de mest omfattende studerte virus blant alle OVer. Det er lengst med i klinikken, med Talimogene laherparepvec (T-VEC) som den første og eneste OV som mottar FDA-godkjenning i USA for behandling av avansert melanom3. I tillegg til T-VEC blir mange andre genmodifiserte oHSVer testet preklinisk og klinisk i forskjellige krefttyper3,4,5,6,7,8. Den nåværende avanserte rekombinante DNA bioteknologi har ytterligere økt muligheten for å konstruere nye oHSVs koding for terapeutiske transgene (er)3,5. Et effektivt system for oHSV-forplantning, rensing og titerbestemmelse er avgjørende før noen (nyutviklet) oHSV kan testes for in vitro- og in vivo-studier. Dette dokumentet beskriver en enkel trinnvis metode for oHSV-vekst (i Vero-celler), rensing (ved sukrosegradientmetoden) og titrering (ved en oHSV-plakkanalyse i Vero-celler) (Figur 1). Det kan enkelt tas i bruk i alle Biosafety Level 2 (BSL2) laboratorieinnstillinger for å oppnå en høy kvalitet viral lager for prekliniske studier.
Vero, en afrikansk grønn ape nyrecellelinje, er den mest brukte cellelinjen for oHSV-forplantning9,10,11,12,13 da Vero-celler har en defekt antiviral interferonsignaleringsvei14. Andre cellelinjer med inaktivert stimulator av interferongener (STING) signalering kan også brukes til oHSV vekst12,13. Denne protokollen benytter Vero-celler for oHSV-vekst og plakkanalyse. Etter forplantning høstes, lyser og utsettes oHSV-infiserte celler for rensing, hvor lysede celler først behandles med benzonasekjernen for å forringe vertscelle-DNA, forhindre nukleinsyreproteinaggregering og redusere viskositeten til cellelysatet. Som riktig aktivering av benzonase krever ofte Mg2 +, 1-2 mM MgCl2 brukes i denne protokollen15. Vertscellerester fra benzonasebehandlet cellelysat elimineres ytterligere ved seriell filtrering før høyhastighets sukrosegradient sentrifugering. En viskøs 25% sukrose løsning pute bidrar til å sikre en langsommere grad av virusmigrering gjennom sukroselaget, slik at vertscellerelaterte komponenter blir igjen i supernatanten, og dermed forbedrer rensing og begrenser virustap ipellets 16. Den rensede oHSV titreres deretter på Vero-celler, og virale plakk visualiseres av Giemsa-flekker17 eller X-gal farging (for LacZ-koding av oHSVer)18.
Protokollen starter med veksten av oHSV i veroceller med lav passasje. Sammenløpet av Vero-cellemonolayeren bør være ~ 80% på tidspunktet for virusinokulering, da overgrodde celler kan utvikle tette fibrøse strukturer som kan redusere oHSV-oppføring i Vero-celler20. Når 90-100% CPE er observert, fjernes kulturen supernatant, celler høstes, resuspenderes i VB / supernatant (se trinn 1.4.6), snap-frossen og lagres ved -80 °C for senere rensing. Blaho og kollegene brukte en litt annen metode…
The authors have nothing to disclose.
Forskning i Saha-laboratoriet ble delvis støttet av midler fra DOD (W81XWH-20-1-0702) og Dodge Jones Foundation-Abilene. Samuel D. Rabkin og Melissa R.M. Humphrey ble delvis støttet av NIH (R01 CA160762).
1.7 mL centrifuge tubes | Sigma | CLS3620 | |
15 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352097 | |
5 mL polypropylene tubes | Falcon | 352063 | |
50 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352098 | |
6-well cell culture plates | Falcon | 353046 | |
Benzonase Nuclease | Sigma | E8263-25KU | |
Cell scraper | Fisher Scientific | 179693 | |
Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ML | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Corning | MT-10-013-CV | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Corning | MT-21-031-CV | |
Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH3007003 | |
Giemsa Stain | Sigma | G3032 | |
Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
Glycerol | Sigma | G5516 | |
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | MT-21-021-CV | |
High-Glucose Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline | Sigma | D4031 | |
Human immune globulin | Gamastan | NDC 13533-335-12 | |
Magnesium chloride | Fisher Chemical | M33-500 | |
Media Sterilization filter, 250 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25E | |
Media Sterilization filter, 500 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25C | |
Neutral Red solution | Sigma | N4638 | |
Paraformaldehyde | Fisher scientific | 15710S | |
Plate rocker | Fisher | 88861043 | |
Potassium Ferricyanide | Sigma | P8131 | |
Potassium Ferrocyanide | Sigma | P9387 | |
Sodium chloride | Fisher Chemical | S271-3 | |
Sorvall ST 16R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004381 | |
Sorvall ST 21R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002446 | |
Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | 02-681-371 | |
Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
Syringe Filter, 0.45 PVDF | MilliporeSigma | SLHV033RS | |
Syringe Filter, 0.8 MCE | MilliporeSigma | SLAA033SS | |
Syringe filter, 5 µm PVDF | MilliporeSigma | SLSV025LS | |
T150 culture flask | Falcon | 355001 | |
Tris-HCl | MP Biomedicals LLC | 816116 | |
Ultrasonic water bath | Branson | CPX-952-116R | |
X-gal | Corning | 46-101-RF |