Summary
В этой рукописи мы описываем простой метод роста, очистки и титрования онколитического вируса простого герпеса для доклинического использования.
Abstract
Онколитические вирусы (ОВ), такие как онколитический вирус простого герпеса (oHSV), являются быстро растущей стратегией лечения в области иммунотерапии рака. ОВ, включая oHSV, избирательно реплицируются и убивают раковые клетки (щадя здоровые / нормальные клетки), одновременно индуцируя противоопухолевый иммунитет. Из-за этих уникальных свойств стратегии лечения на основе oHSV все чаще используются для лечения рака, доклинически и клинически, включая одобренный FDA талимоген лагерпаревек (T-Vec). Рост, очистка и титрование являются тремя основными лабораторными методами для любых ОВ, включая oHSV, прежде чем их можно будет использовать для экспериментальных исследований. В этой статье описывается простой пошаговый метод усиления oHSV в клетках Vero. Когда oHSV размножаются, они производят цитопатический эффект (CPE) в клетках Vero. Как только 90-100% инфицированных клеток показывают CPE, их аккуратно собирают, обрабатывают бензоназой и хлоридом магния (MgCl2),фильтруют и подвергают очистке с использованием метода сахарозы-градиента. После очистки количество инфекционных oHSV (обозначенных как бляшеобразующие единицы или PФУ) определяется с помощью «анализа бляшек» в клетках Vero. Протокол, описанный в настоящем описании, может быть использован для получения высокотитерного запаса oHSV для исследований in vitro в клеточной культуре и экспериментов in vivo на животных.
Introduction
Онколитические вирусы (ОВ) являются новой и уникальной формой иммунотерапии рака. ОВ избирательно реплицируются и лизируют опухолевые клетки (щадя нормальные/здоровые клетки)1, индуцируя противоопухоляющий иммунитет2. Онколитический вирус простого герпеса (oHSV) является одним из наиболее широко изученных вирусов среди всех ОВ. Он находится дальше всего в клинике, причем Talimogene laherparepvec (T-VEC) является первым и единственным OV, получившим одобрение FDA в США для лечения прогрессирующей меланомы3. В дополнение к T-VEC, многие другие генетически модифицированные oHSV тестируются доклинически и клинически при различных типах рака3,4,5,6,7,8. Современная передовая рекомбинантная биотехнология ДНК еще больше повысила возможность разработки новых oHSV-кодирования для терапевтических трансгенов3,5. Эффективная система распространения, очистки и определения титра oHSV имеет решающее значение до того, как любой (недавно разработанный) oHSV может быть протестирован для исследований in vitro и in vivo. В данной работе описывается простой пошаговый метод роста oHSV (в клетках Vero), очистки (методом сахарозы-градиента) и титрования (путем анализа oHSV-бляшек в клетках Vero)(рисунок 1). Он может быть легко принят в любых лабораторных условиях уровня биобезопасности 2 (BSL2) для достижения высококачественного вирусного запаса для доклинических исследований.
Vero, африканская зеленая обезьянья клеточная линия почек, является наиболее часто используемой клеточной линией для распространения oHSV9,10,11,12,13, поскольку клетки Vero имеют дефектный противовирусный интерфероновый сигнальныйпуть 14. Другие клеточные линии с инактивированным стимулятором передачи сигналов генов интерферона (STING) также могут быть использованы для роста oHSV12,13. Этот протокол использует клетки Vero для роста oHSV и анализа бляшек. После размножения oHSV-инфицированные клетки собирают, литизируют и подвергают очистке, при этом лизированные клетки сначала обрабатывают нуклеазой бензоназы для деградации ДНК клеток-хозяев, предотвращения агрегации нуклеиновых кислот-белков и снижения вязкости клеточного лизата. Поскольку правильная активация бензоназы часто требуетMg 2+,1-2 мМ MgCl2 используется в этомпротоколе 15. Обломки клеток-хозяев из обработанного бензоназой клеточного лизата дополнительно удаляются путем последовательной фильтрации перед высокоскоростным центрифугированием градиента сахарозы. Вязкая подушка из 25% раствора сахарозы помогает обеспечить более медленную скорость миграции вируса через слой сахарозы, оставляя компоненты, связанные с клетками-хозяевами, в супернатанте, тем самым улучшая очистку и ограничивая потерю вируса в грануле16. Очищенный oHSV затем титруется на клетках Vero, а вирусные бляшки визуализируются окрашиванием Giemsa17 или окрашиванием X-gal (для LacZ, кодирующей oHSV)18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1) рост oHSV
ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечить одобрение институционального комитета по биобезопасности до начала работы с oHSV. Это исследование проводилось в соответствии с утвержденным Протоколом IBC No 18007. Соблюдайте меры предосторожности BSL2: отбеливайте все пипетки, наконечники, трубки и другие материалы, которые вступают в контакт с вирусом. Распылите перчатки с 70% изопропиловым спиртом перед руками покинуть вытяжку для культивовки клеток BSL2. Всегда тщательно мойте руки с мыльной водой после работы с вирусом.
- На 1-й день семена низкопроходных клеток Веро в 20 Т-150см2 колбы при плотности 7-8 × 106 клеток/колбу в обычной клеточной среде Веро.
ПРИМЕЧАНИЕ: Среда Vero получают путем добавления модифицированной орлиной среды Dulbecco (DMEM) 10% термоинфактивированной сывороткой для телят плода (IFCS). - На 0-й день (клетки на 80-90% сливаются) добавляют инокулят oHSV на клетки Vero.
- Приготовление вируса инокулят
- Используйте кратность инфекции (MOI) 0,01 (MOI может варьироваться от 0,01 до 0,1 в зависимости от репликационной способности вируса) для амплификации вируса. Используйте формулу(1)для расчета количества вируса (мл) на 20 колбы.
Количество вируса (мл) на 20 колбы = количество необходимого вируса (pfu)/титр запаса вируса (pfu/mL)(1) - Используйте высокоглюкоузный фосфатно-буферный физиологический раствор Dulbecco (DPBS), дополненный 1% IFCS для приготовления инокулята вируса (7 мл на Т-150см2 колбы, т.е. ~ 140 мл на 20 колб). Добавьте необходимое количество oHSV в 140 мл высокоглюкозаглекового раствора DPBS/1% IFCS, вихрь в течение 1 мин и держите смесь готовой к добавлению к клеткам Vero.
- Используйте кратность инфекции (MOI) 0,01 (MOI может варьироваться от 0,01 до 0,1 в зависимости от репликационной способности вируса) для амплификации вируса. Используйте формулу(1)для расчета количества вируса (мл) на 20 колбы.
- Промыть колбы Т-150 см2x с высоким содержанием глюкозы DPBS, дополненной 1% МФХБ (10 мл/промывка). Аспирировать DPBS/1% МФХБ и добавить 7 мл вирусной инокулята/Т-150см2 колбы.
- Аккуратно раскачивают колбы в течение 5 мин с помощью колбы-коромысла для правильного распределения инокулята по монослою Веро, а затем инкубируют колбы при 37 °C в течение 1,5-2 ч. Убедитесь, что полка инкубатора ровная.
- Удалить инокуляту и добавить ДМЭМ, дополненный 1% МФХК (25 мл/колба). Высиживать колбы в течение 2-4 дней.
- Приготовление вируса инокулят
- Ежедневно проверяйте колбы на 90-100% CPE (см. Рисунок 2).
- Соберите oHSV-инфицированные vero клетки.
- Соберите супернатант культуры (~20 мл) из каждой колбы (оставьте ~5 мл в каждой колбе) в 50 мл конических центрифужных трубок или контейнера для среды.
- Используйте скребок для клеток, чтобы аккуратно соскоблить ячейки со дна колб.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки должны быстро отрываться от колбы. - Добавьте ~15 мл супернатанта культуры (собранного на этапе 1.4.1) в каждую колбу (что приносит объем ~20 мл в каждую колбу, т.е. 400 мл на 20 колбы) и осторожно промыть дно колбы несколько раз, используя 10 мл стерильного серологического пипетка.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не пипететь энергично. Стремитесь сохранить все клетки нетронутыми. - Соберите клетки (+ среда) в конические центрифужные трубки по 50 мл на льду (используйте 8 трубок для хранения 400 мл собранных клеток из 20 колб).
- Раскрутите клетки при 300 г в течение 10 мин при 4 °C и аспирировать супернатант.
- Добавить 1,25 мл (50%) вирусного буфера (VB) и 1,25 мл (50%) супернатанта культуры (собранного на этапе 1.4.1) в каждую трубку центрифуги и тщательно суспендировать каждую гранулу. Перенесите повторно взвешенные ячейки из восьми 50 мл центрифужных трубок в одну коническую центрифужную трубку 50 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: См. приготовление раствора VB в таблице 1. Фильтруйте раствор VB с помощью фильтра для стерилизации среды. Используйте 0,5 мл VB + 0,5 мл супернатанта на Т-150см2 колбы для повторной суспензии, т.е. для 20 колб (20 мл), используйте 10 мл VB и 10 мл культивального супернатанта. - Заморозьте повторно взвешенные ячейки с использованием сухого льда / 100% этанола и храните при -80 °C.
2) очистка oHSV
- Замораживание (в сухом льду и 100% этаноле)/оттаивание (на теплой водяной бане 37 °C) клеток с последующей водной баней-ультразвуком в течение 1 мин в общей сложности 3 цикла для обеспечения надлежащего лизиса клеток для высвобождения вируса в супернатанте.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте ультразвук в течение 1 мин, используя мощность 40 кГц, 120 В. Если перестраиваемый ультразвуковой ультракабельный ультразвуковой аппарат для водяной бани недоступен. Возьмите аликвоту 50 мкл для титрования в разделе 3, которая поможет определить, какой из следующих этапов (шагов) отвечает за потенциальную потерю вируса во время процедуры очистки. - Обработать клеточный лизат нуклеазой бензоназы (175 единиц/мл) + 2 мМ MgCl2 (1 М запас = 2 мкл/мл), вихрем и инкубировать в течение 30 мин при 37 °C. Поместите трубку на лед и выполните следующие действия при 4 °C.
- Гранулирование клеточного мусора низкоскоростным центрифугированием.
- Раскрутите клетку лисатом при 300 г в течение 10 мин.
- Соберите супернатант в новую коническую центрифужную трубку емкостью 50 мл (повторно суспендируйте ячейку гранулы в 0,5 мл VB, обозначьте ее как гранулу-1 и храните при 4 °C для использования на этапе 2.3.5; см. Рисунок 1).
- Раскрутите супернатант (полученный на этапе 2.3.2) снова при 500 г в течение 10 мин.
- Соберите супернатант в новую коническую центрифужную трубку емкостью 50 мл (повторно суспендируйте ячейку гранулы в 0,5 мл VB, обозначьте ее как гранулу-2 и храните при 4 °C для использования на этапе 2.3.5; см. Рисунок 1).
- Смешайте повторно суспендированную гранулу-1 (от 2.3.2) и гранулу-2 (от 2.3.4) в новую центрифужную трубку 1,7 мл, вихревую/ультразвуковую (водяную баню) 2x и вращаем при 400 г в течение 10 мин. Соберите супернатант и объедините его с супернатантом, полученным на шаге 2.3.4; см. рисунок 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте ультразвуковую работу в течение 1 мин, используя мощность 40 кГц, 120 В для предотвращения вирусной агрегации перед процедурой фильтрации на этапе 2.4. Возьмем 50 мкл аликвоты комбинированного супернатанта для титрования в разделе 3.
- Фильтруйте комбинированный супернатант (~21 мл, т.е. 20 мл из 1,4,6, 0,5 мл из 2,3,2 и 0,5 мл из 2,3,4) с использованием следующего 3-ступенчатого метода фильтрации.
- Дотяните 21 мл супернатанта с помощью шприца 10 мл (каждый раз по 5-7 мл для легкого прохождения через фильтр) и пропустите его через стерильный мембранный фильтр из поливинилидендифторида (PVDF) размером 50 мл, помещенный на новую коническую центрифужную трубку 50 мл (обозначенную как TUBE 1).
- Добавьте 1 мл VB в 50 мл конической центрифужной трубки, опорожненной в 2.4.1 (для сбора оставшегося количества супернатанта вируса), и пройдите через тот же 5-мкм PVDF-фильтр, размещенный на TUBE 1 (в результате чего общее количество фильтрата составит 22 мл). Перейдите к шагу 2.4.2.
- Вытяните 22 мл фильтрата из TUBE 1 (как в 2.4.1) и пропустите его через стерильный мембранный фильтр смешанного эфира целлюлозы (MCE) 0,8 мкм, помещенный на новую коническую центрифужную трубку 50 мл (маркированную как TUBE 2).
- Добавьте 1 мл VB в ТРУБУ 1, опорожненную на этапе 2.4.2, вихревую, и пропустите ее через тот же фильтр MCE 0,8 мкм, размещенный на TUBE 2 (в результате чего общее количество фильтрата составит 23 мл). Перейдите к шагу 2.4.3.
- Вытяните 23 мл фильтрата из TUBE 2 (как в 2.4.1) и пропустите его через стерильный ПВДФ-фильтр 0,45 мкм, размещенный на новой конической центрифужной трубке 50 мл (обозначенной как TUBE 3).
- Добавьте 1 мл VB в ТРУБУ 2, опорожненную на этапе 2.4.3, вихревую, и пропустите ее через тот же 0,45 мкм PVDF-фильтр, размещенный на TUBE 3 (в результате чего общее количество фильтрата составит 24 мл).
ПРИМЕЧАНИЕ: Возьмите 50 мкл аликвоты фильтрата для титрования в разделе 3.
- Добавьте 1 мл VB в ТРУБУ 2, опорожненную на этапе 2.4.3, вихревую, и пропустите ее через тот же 0,45 мкм PVDF-фильтр, размещенный на TUBE 3 (в результате чего общее количество фильтрата составит 24 мл).
- Дотяните 21 мл супернатанта с помощью шприца 10 мл (каждый раз по 5-7 мл для легкого прохождения через фильтр) и пропустите его через стерильный мембранный фильтр из поливинилидендифторида (PVDF) размером 50 мл, помещенный на новую коническую центрифужную трубку 50 мл (обозначенную как TUBE 1).
- Высокоскоростное центрифугирование методом сахарозы-градиента
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе использовался ротор с фиксированным углом F13-14x50cy. Как ротор, так и центрифуга должны находиться при 4 °C, прежде чем приступать к следующим шагам.- Добавьте 10 мл ледяного, стерильно-фильтрованного 25% раствора сахарозы (приготовленного путем растворения 25 г порошка сахарозы в 100 мл сбалансированного солевого раствора Хэнка) в новую 50 мл коническую центрифужную трубку.
- Медленно (3 мл/мин) добавляют 24 мл фильтрата вируса (полученного из этапа 2.4.3.1) поверх слоя сахарозы. Позаботьтесь о поддержании отдельных слоев фильтрата вируса и раствора сахарозы.
ПРИМЕЧАНИЕ: До 30 мл вирусного слоя может быть добавлено более 10 мл раствора сахарозы. - Центрифугировать пробирку в течение 90 мин при 22,620 г при 4 °C.
- Удалите супернатант и слой сахарозы из конической центрифужной трубки 50 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Гранула вируса должна быть беловатой. Возьмем 50 мкл аликвоты супернатанта и 50 мкл аликвоты слоя сахарозы для титрования в разделе 3.
- Повторно суспендируют гранулы в 10% растворе глицерина/ПБС.
- Добавьте 1 мл стерильного 10% глицерина (разбавленный в PBS) в 50 мл конической центрифужной трубки для покрытия гранулы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество повторно суспензированной смеси может варьироваться (например, 0,8-1,2 мл) в зависимости от размера гранул. Меньший объем даст более высокую концентрацию вируса. - Поместите коническую центрифужную трубку 50 мл на лед на 2-4 ч. В течение этого периода вышивайте / вихрь гранулы каждые 15 минут в течение 30 с, чтобы помочь выбить / повторно приостановить гранулу.
- Соберите повторно суспендированную гранулу (1 мл 10% глицерина / PBS + размер гранулы доведет общий объем до ~ 1,3 мл) в микроцентрифужную трубку объемом 2 мл. [Необязательно: Добавьте еще 0,3 мл 10% глицерина/PBS в ту же 50 мл коническую центрифужную трубку для сбора оставшегося количества следов гранулы, пипеткой вверх и вниз и соедините с повторно суспендированной гранулой на этапе 2.6.3, чтобы довести общий объем до ~1,6 мл.]
- Если суспензия на этапе 2.6.3 мутная или мутная (из-за остатков клеток), центрифугируют трубку при 500 г в течение 10 мин, переложите супернатант в новую микроцентрифужную трубку 2 мл и перейдите к этапу 2.6.4.
- Возьмите аликвоту 50 мкл для титрования oHSV в разделе 3. Аликвотировать остальную часть раствора (250 мкл/аликвот) в стерильные микроцентрифужные трубки с винтовыми колпачками (хорошо герметизированными для длительного хранения), заморозить и хранить при -80 °C до использования (готовы к экспериментальным исследованиям после определения титра oHSV).
ПРИМЕЧАНИЕ: Все материалы, которые вступают в контакт с вирусом, должны быть отбелено или обработаны ультрафиолетовым излучением перед удалением из вытяжки или утилизацией.
- Добавьте 1 мл стерильного 10% глицерина (разбавленный в PBS) в 50 мл конической центрифужной трубки для покрытия гранулы.
3. титрование oHSV и анализ бляшек
- Семена 1,7-1,8 х 105 клеток Vero/скважина в 6-скважинной клеточной культурной пластине в клеточной среде Vero (DMEM с 10% IFCS; см. этап 1.1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что клетки однородно распределены по всей скважине; не закручивайте пластину, что может вызвать скопление клеток в середине колодцев. Чтобы предотвратить закрутку, медленно раскачивайте пластину вручную вертикально, затем горизонтально, а затем аккуратно поместите пластину в инкубатор. - На следующий день (когда клетки достигают 70-80% конфлюентности) аспирируют культурную среду и добавляют 1 мл/гольцо высокоглюкого PBS, дополненного 1% МФХБ. Оставьте пластину в вытяжке для культивирований клеток до завершения шага 3.3.
- Последовательно разбавляют вирус в 5 мл полипропиленовых пробирок с использованием PBS/1% IFCS(рисунок 3).
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте аликвоту 50 мкл, собранную на этапе 2.6.4, для последовательного разбавления. В1-ю пробирку (10-3 разведения) добавляют 2 мкл вируса в 1998 г. мкл PBS/1%IFCS, вихревой. Во2-й пробирке (10-5 разведение) берут 10 мкл из 1-й пробирки в 990 мкл PBS/1% IFCS, вихревом. В3-й пробирке (10-6 разведение) берут 100 мкл из2-й пробирки в 900 мкл PBS/1% IFCS, вихревом; продолжайте это 10-кратное последовательное разведение до 10-9 разведения. Подробности см. на рисунке 3. - Аспирировать PBS/1% МФХБ и добавлять 0,7 мл/хорошо последовательно разбавленный вирус (начиная с 10-5 до 10-9)к клеткам Vero.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не дайте клеткам высохнуть. - Аккуратно покачайте пластину на коромысле в течение 5 мин при комнатной температуре (для обеспечения однородного распределения вируса инокулята).
- Инкубировать пластину в течение 1,5 ч при 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: В течение этого инкубационного периода готовят 1:1000 разведения человеческого иммуноглобулина G (IgG) в DMEM, дополненном 1% IFCS. Для плиты с 6 скважинами подготовьте 12,5 мл, чтобы на этапе 3,7 можно было использовать 2 мл/скважину. Отрегулируйте разбавление, чтобы учесть вариации партии в IgG человека. - Удалить вирусный инокулят из скважин и добавить 2 мл/0,1% человеческого IgG (для нейтрализации oHSV в культуральной среде и предотвращения образования вторичных бляшек) в DMEM, дополненный 1% IFCS. Инкубировать пластину при 37 °C в течение 3-4 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: Прозрачные бляшки обычно образуются через 3 дня. - Крепежные и окрашивающие пластины
- Удалите супернатант и зафиксируйте клетки в чистом метаноле (1 мл/лунка) в течение 5 мин. Удалите метанол и дайте пластинам высохнуть на воздухе.
- Разбавьте пятно Giemsa (1:5) деионизированной водой и добавьте 1 мл разбавленного пятна Giemsa на скважину. Инкубировать пластину при комнатной температуре в течение 10-15 мин.
- Удалите пятно, промойте водопроводной водой и дайте пластинам высохнуть на воздухе.
- Подсчитайте бляшки с помощью рассекающего микроскопа.
- Опционально для oHSV с выражением lacZ:
- Удалите супернатант и зафиксируйте клетки холодным 0,2% глутаровым альдегидом/2% параформальдегидом в течение 5-10 мин при комнатной температуре.
- Удалите фиксаторный раствор и промыть ячейки 3x PBS.
- Добавьте раствор X-gal в ячейки (1 мл/хорошо) и инкубируют пластину при 37 °C в течение 2 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пятно X-gal должно быть приготовлено свежим в день окрашивания; длительное хранение может привести к выцветание цвета. Смотрите приготовление раствора X-gal в таблице 1. - Удалите пятно X-gal и промойте пластину водопроводной водой в течение 1 мин.
- Противопоставляемое окрашивание нейтральным красным раствором (1 мл/колодец) в течение 2 мин при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: См. приготовление нейтрального красного раствора в таблице 1. - Промыть тарелку водопроводной водой в течение 1 мин; дайте пластинам высохнуть на воздухе.
- Подсчитайте синие бляшки с помощью рассекающего микроскопа(рисунок 4).
- Вычисление титра по формуле (2)
Титр в пФУ/мл = Количество бляшек/0,7 мл × коэффициент разбавления (2)
ПРИМЕЧАНИЕ: Например, если в разбавляемом колодке 10-9 обнаружено 25 бляшек, титр составляет 25/0,7 ×10 9 = 35,7 ×10 9 = 3,57 × 1010 pfu/мл. Это заключительный титр аликвот oHSV, подготовленный на этапе 2.6.4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Краткий обзор всего протокола показан на рисунке 1,который представляет критические этапы, связанные с ростом, очисткой и титрованием oHSV. CPE в клетках Vero может быть обнаружен уже через 4 ч после ВПГ-инфекции19. Рисунок 2 демонстрирует CPE в клетках Vero в трех различных временных точках после инфекции oHSV. Уровень CPE увеличивается с течением времени. В этом протоколе 90-100% CPE обычно наблюдается в течение 48 ч после инокуляции с низким MOI oHSV (что является лучшим временем для сбора клеток для очистки). Однако это может занять до 4 дней в зависимости от МВД oHSV, привитого на этапе 1.2, и / или потенциала репликации oHSV. По истечении этого периода клетки с CPE могут быть лизированы, что приводит к высвобождению вируса в супернатанте. Таким образом, чтобы получить высокий вирусный титр, крайне важно собирать клетки, пораженные CPE, когда они неповреждены. Другим важным фактором, который способствует окончательному титру вируса, является количество или размер колб для культуры тканей, используемых для амплификации oHSV. На рисунке 3 показан процесс последовательного разбавления (от 10-3 до 10-9)данного запаса вируса (полученного на этапе 2.6.4), необходимого для определения титра с помощью анализа бляшек. Для oHSV с экспрессией lacZ вирусные бляшки могут быть визуализированы окрашиванием X-gal(рисунок 4). В этом протоколе использовали колбы для посева тканей20 Т-150 см2, для которых можно ожидать 1,3-1,6 мл запаса oHSV с титром 1 ×10 pfu/mL.
Рисунок 1:Схематическое представление основных этапов, участвующих в росте, очистке и анализе бляшек oHSV. Сокращения: oHSV = онколитический вирус простого герпеса; CPE = цитопатический эффект; VB = вирусный буфер; HBSS = Сбалансированный солевой раствор Хэнка; PBS = фосфатно-буферный физиологический раствор. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Цитопатический эффект в клетках Vero после oHSV-инфекции. Клетки Vero инокулировали с кодированием oHSV для mCherry (показанным в красной флуоресценции) при MOI 0,01 и визуалировали (10-кратное увеличение) через 36, 48 и 72 ч поствирусной инфекции. CPE идентифицируется путем округления oHSV-инфицированных клеток (обозначенных черными стрелками). Шкала стержней = 200 мкм. Аббревиатура: oHSV = онколитический вирус простого герпеса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Последовательное разведение запаса oHSV для анализа бляшек. См. также шаг 3.3 протокола. Аббревиатура: oHSV = онколитический вирус простого герпеса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Репрезентативное изображение окрашенных X-галлонами бляшек через 72 ч после оГСВ-инфекции. Неразбавленные (верхний колодец) и разбавленные (1:10; нижний колодец) oHSV-инфицированные супернатанты клеточной культуры, добавляемые к клеткам Vero (70-80% слияние), за которым следует протокол окрашивания X-gal, описанный в разделе 3.8.5 (исключая встречное окрашивание нейтральным красным). Репрезентативные изображения окрашенной В X-галлон вирусной бляшки (с левой панели) представлены на средней (4x; шкала = 1000 мкм) и правой (10x; шкала = 200 мкм) панелях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Состав раствора | |
| Подготовка вирусного буфера | количество |
| 1 M Хлорид натрия | 15 мл |
| 1 М Трис-гидрохлорид | 3 мл |
| Очищенная вода | 132 мл |
| отрегулируйте pH до 6,8 | |
| Приготовление раствора X-gal (~6,5 мл на одну 6-скважинную пластину) | |
| 250 мМ феррицианида калия | 130 мкл |
| 250 мМ ферроцианида калия | 130 мкл |
| 1 M Хлорид магния | 13 мкл |
| X-галлон предварительно растворенный (20 мг/мл) в диметилсульфоксиде (ДМСО) | 162.5 мкл |
| ПБС | 6064.5 мкл |
| Приготовление нейтрального красного раствора для одной 6-скважинной плиты | |
| Нейтральный красный раствор | 100 мкл |
| метанол | 1 мл |
| Очищенная вода | 7 мл |
Таблица 1: Состав раствора.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол начинается с роста oHSV в низкопролетных клетках Vero. Слияние монослоя клеток Vero должно составлять ~ 80% во время инокуляции вируса, так как разросшиеся клетки могут развивать плотные волокнистые структуры, которые могут уменьшить проникновение oHSV в клетки Vero20. После наблюдения 90-100% CPE супернатант культуры удаляют, клетки собирают, повторно суспендируют в VB/супернатанте (см. шаг 1.4.6), замораживают и хранят при -80 °C для последующей очистки. Блахо и его коллеги использовали несколько иной метод сбора и хранения инфицированных клеток Vero. Например, колбы, содержащие клетки и культуральная среда (дополненные 1% бычим сывороточным альбумином и PBS с калием), первоначально хранят при -80 °C в течение не менее 15 мин, с последующим медленным прогревом колб при комнатной температуре. Затем клетки собирают, смешивают со стерильным молоком и хранят при -80 °C до очистки20. В этом случае стерильное молоко действует как стабилизатор, и было продемонстрировано, что титр запаса вируса значительно выше, когда он хранится в стерильном молоке / среде, чем всреде только 20. Однако в другом исследовании прямое сравнение между различными стабилизаторами (включая стерильное молоко), используемыми для хранения нескольких герпесвирусов при -80 °C, не показало какого-либо существенного влияния на конечные титры вируса21. Здесь клеточную гранулу повторно суспендировали в VB, составленном с трис-буферным физиологическим раствором (рН 6,8) и 10% глицерином в качестве стабилизатора хранения, что обычно дает высокий титр вируса (как описано на этапе 3.10) для экспериментальных исследований.
Крайне важно удалить все компоненты, связанные с клетками и средами, из повторно взвешенной гранулы для получения высококачественного запаса вируса. Удаление невирусных частиц имеет решающее значение для предотвращения потенциальных иммунных реакций во время экспериментов in vivo. Описано несколько способов очистки вируса, включая центрифугирование22,различные градиентные методы23,фильтрацию24и аффинную хроматографию25. Хотя этот протокол основан на высокоскоростном центрифугировании с использованием метода сахарозы-градиента, множество других градиентных методов использовались другими, такими как йодиксанол11,26,Перколл27и Фиколл-Никоденц23. Эти градиентные методы разделяют вирус по плотности и требуют выделения полосы от градиента, а не сахарозной подушки, где вирус гранулируется. Метод сахарозы-градиента предлагает мягкий подход к раздельным вирусным частицам, поскольку он сводит к минимуму риск разрушения белков вирусной оболочки при сохранении вирусной инфекционности. Несмотря на эти преимущества, высокая осмолярность концентрированного раствора сахарозы может обезвоживать вирусные частицы; поэтому для преодоления этого недостатка был разработан метод градиента йодиксанола. Однако метод градиента йодиксанола требует ультрацентрифуги и сбора вирионной полосы. Другими факторами, которые необходимо учитывать при очистке oHSV, являются скорость и время центрифугирования и выбор вирусного буфера, используемого для длительного хранения. Этот протокол имеет ограничение, что чистота oHSV не подтверждена; однако большое количество функциональных вирусных частиц было обнаружено в данном очищенном запасе oHSV путем титрования на клетках Vero (см. раздел 3).
oHSV образует бляшки на клетках Vero(рисунок 4). Вирусные бляшки могут быть идентифицированы с помощью окрашивания Giemsa, что является простым и удобным методом. Giemsa окрашивает клетки Vero, оставляя вирусные бляшки прозрачными или пустыми, которые можно легко визуализировать (невооруженным глазом) и подсчитать с помощью рассекающего микроскопа. В то время как наложение среды с агарозой или метилцеллюлозой обычно используется во время образования бляшек (на этапе 3.7) для предотвращения распространения вируса и вторичных инфекций и хвостов бляшек28,использование человеческого IgG для нейтрализации oHSV в культуре супернатанта проще и удобнее. Для oHSV, экспрессирующих lacZ,бляшки могут быть визуализированы окрашиванием X-gal(рисунок 4),в то время как флуоресцентная микроскопия используется для флуоресцентного белка (т.е. зеленого флуоресцентного белка), экспрессирующего oHSV18. Дополнительные анализы для выявления oHSV-инфицированных клеток включают иммуно-гистохимическую или -флуоресценцию с oHSV-специфическими антителами29 или лазерное сканирование флуорофор-конъюгированных oHSV-специфических антител 30 в ближнем инфракрасномдиапазоне.
Существуют критические меры, которые необходимо соблюдать для достижения хорошего запаса вируса, такие как поддержание стерильности для предотвращения микробного (бактерий, дрожжей или плесени) загрязнения и здоровых клеток Vero. Поскольку оболочка oHSV чрезвычайно термочувствительна20,запас oHSV следует обрабатывать в криопротекторе, таком как 10% глицерин. В целом, этот протокол может быть легко использован и практиковаться в лабораторных условиях, но может быть не полезен для крупномасштабного производства вирусов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
SDR является соавтором патентов, относящихся к онколитическим вирусам простого герпеса, принадлежащих и управляемых Джорджтаунским университетом и Массачусетской больницей общего профиля, которые получили роялти от Amgen и ActiVec Inc. и вступают в Научно-консультативный совет EG 427. Другим авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Исследования в лаборатории Saha частично поддерживались средствами DoD (W81XWH-20-1-0702) и Dodge Jones Foundation-Abilene. Сэмюэл Д. Рабкин и Мелисса Р.M. Хамфри были частично поддержаны NIH (R01 CA160762).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL centrifuge tubes | Sigma | CLS3620 | |
| 15 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352097 | |
| 5 mL polypropylene tubes | Falcon | 352063 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352098 | |
| 6-well cell culture plates | Falcon | 353046 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma | E8263-25KU | |
| Cell scraper | Fisher Scientific | 179693 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ML | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Corning | MT-10-013-CV | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Corning | MT-21-031-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH3007003 | |
| Giemsa Stain | Sigma | G3032 | |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | MT-21-021-CV | |
| High-Glucose Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline | Sigma | D4031 | |
| Human immune globulin | Gamastan | NDC 13533-335-12 | |
| Magnesium chloride | Fisher Chemical | M33-500 | |
| Media Sterilization filter, 250 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25E | |
| Media Sterilization filter, 500 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25C | |
| Neutral Red solution | Sigma | N4638 | |
| Paraformaldehyde | Fisher scientific | 15710S | |
| Plate rocker | Fisher | 88861043 | |
| Potassium Ferricyanide | Sigma | P8131 | |
| Potassium Ferrocyanide | Sigma | P9387 | |
| Sodium chloride | Fisher Chemical | S271-3 | |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004381 | |
| Sorvall ST 21R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002446 | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | 02-681-371 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Syringe Filter, 0.45 PVDF | MilliporeSigma | SLHV033RS | |
| Syringe Filter, 0.8 MCE | MilliporeSigma | SLAA033SS | |
| Syringe filter, 5 µm PVDF | MilliporeSigma | SLSV025LS | |
| T150 culture flask | Falcon | 355001 | |
| Tris-HCl | MP Biomedicals LLC | 816116 | |
| Ultrasonic water bath | Branson | CPX-952-116R | |
| X-gal | Corning | 46-101-RF |
References
- Harrington, K., Freeman, D. J., Kelly, B., Harper, J., Soria, J. -C. Optimizing oncolytic virotherapy in cancer treatment. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (9), 689-706 (2019).
- Zhang, S., Rabkin, S. D. The discovery and development of oncolytic viruses: are they the future of cancer immunotherapy. Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (4), 391-410 (2021).
- Bommareddy, P. K., Peters, C., Saha, D., Rabkin, S. D., Kaufman, H. L. Oncolytic herpes simplex viruses as a paradigm for the treatment of cancer. Annual Review of Cancer Biology. 2 (1), 155-173 (2018).
- Peters, C., Rabkin, S. D. Designing herpes viruses as oncolytics. Molecular Therapy-Oncolytics. 2, 15010 (2015).
- Nguyen, H. -M., Saha, D. The current state of oncolytic herpes simplex virus for glioblastoma treatment. Oncolytic Virotherapy. 10, 1-27 (2021).
- Koch, M. S., Lawler, S. E., Chiocca, E. A. HSV-1 oncolytic viruses from bench to bedside: an overview of current clinical trials. Cancers. 12 (12), 3514 (2020).
- Menotti, L., Avitabile, E. Herpes simplex virus oncolytic immunovirotherapy: the blossoming branch of multimodal therapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 8310 (2020).
- Nguyen, H. M., Guz-Montgomery, K., Saha, D. Oncolytic virus encoding a master pro-inflammatory cytokine interleukin 12 in cancer immunotherapy. Cells. 9 (2), 400 (2020).
- Agarwalla, P. K., Aghi, M. K. Oncolytic herpes simplex virus engineering and preparation. Methods in Molecular Biology. 797, 1-19 (2012).
- Grosche, L., et al. Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves. Bio-protocol. 9 (23), 3441 (2019).
- Sutter, S. O., Marconi, P., Meier, A. F. Herpes simplex virus growth, preparation, and assay. Methods in Molecular Biology. 2060, 57-72 (2020).
- Froechlich, G., et al. Integrity of the antiviral STING-mediated DNA sensing in tumor cells is required to sustain the immunotherapeutic efficacy of herpes simplex oncolytic virus. Cancers. 12 (11), 3407 (2020).
- Froechlich, G., et al. Generation of a novel mesothelin-targeted oncolytic herpes virus and implemented strategies for manufacturing. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 477 (2021).
- Mosca, J. D., Pitha, P. M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis. Molecular and Cellular Biology. 6 (6), 2279-2283 (1986).
- Gousseinoz, E., Kools, W., Pattnaik, P. Nucleic acid impurity reduction in viral vaccine manufacturing. BioProcess International. 12 (2), 59-68 (2014).
- Herpes simplex virus: methods and protocols. Methods in Molecular Biology. Diefenbach, R. J., Fraefel, C. , Humana Press. New York, USA. (2014).
- Hadi, A. M., et al. An experimental trial to prepared γ1 34.5 herpes simplex virus 1 immunogene by cloning technique. Systematic Review Pharmacy. 11 (5), 140-149 (2020).
- Kuroda, T., Martuza, R. L., Todo, T., Rabkin, S. D. Flip-Flop HSV-BAC: bacterial artificial chromosome based system for rapid generation of recombinant herpes simplex virus vectors using two independent site-specific recombinases. BMC Biotechnology. 6, 40 (2006).
- Motamedifar, M., Noorafshan, A. Cytopathic effect of the herpes simplex virus type 1 appears stereologically as early as 4 h after infection of Vero cells. Micron. 39 (8), 1331-1334 (2008).
- Blaho, J. A., Morton, E. R., Yedowitz, J. C. Herpes simplex virus: propagation, quantification, and storage. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 14, Unit 14E 1 (2005).
- Malenovska, H. The influence of stabilizers and rates of freezing on preserving of structurally different animal viruses during lyophilization and subsequent storage. Journal of Applied Microbiology. 117 (6), 1810-1819 (2014).
- Vahlne, A. G., Blomberg, J.
- Sathananthan, B., Rodahl, E., Flatmark, T., Langeland, N., Haarr, L. Purification of herpes simplex virus type 1 by density gradient centrifugation and estimation of the sedimentation coefficient of the virion. APMIS: Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 105 (3), 238-246 (1997).
- Mundle, S. T., et al. High-purity preparation of HSV-2 vaccine candidate ACAM529 is immunogenic and efficacious in vivo. PLoS One. 8 (2), 57224 (2013).
- Jiang, C., et al. Immobilized cobalt affinity chromatography provides a novel, efficient method for herpes simplex virus type 1 gene vector purification. Journal of Virology. 78 (17), 8994-9006 (2004).
- Grosche, L., et al. Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves. Bio-protocol. 9 (23), 3441 (2019).
- Svennerholm, B., et al. Separation of herpes simplex virus virions and nucleocapsids on Percoll gradients. Journal of Virological Methods. 1 (6), 303-309 (1980).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e52065 (2014).
- Miyatake, S., Iyer, A., Martuza, R. L., Rabkin, S. D. Transcriptional targeting of herpes simplex virus for cell-specific replication. Journal of Virology. 71 (7), 5124-5132 (1997).
- Fabiani, M., Limongi, D., Palamara, A. T., De Chiara, G., Marcocci, M. E. A novel method to titrate herpes simplex virus-1 (HSV-1) using laser-based scanning of near-infrared fluorophores conjugated antibodies. Frontiers in Microbiology. 8, 1085 (2017).
