Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

ओंकोलिटिक दाद सिंप्लेक्स वायरस का विकास, शुद्धिकरण और टिटरेशन

Published: May 13, 2021 doi: 10.3791/62677
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 1
1Department of Immunotherapeutics and Biotechnology, Jerry H. Hodge School of Pharmacy, Texas Tech University Health Sciences Center, 2Molecular Neurosurgery Laboratory and the Brain Tumor Research Center, Department of Neurosurgery, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School
* These authors contributed equally

Summary

इस पांडुलिपि में, हम प्रीक्लिनिकल उपयोग के लिए ऑन्कोलिटिक दाद सिंप्लेक्स वायरस के विकास, शुद्धिकरण और टिटरेशन की एक सरल विधि का वर्णन करते हैं।

Abstract

ओंकोलिटिक वायरस (ओवी), जैसे ऑनकोलिटिक दाद सिंप्लेक्स वायरस (ओएचएसवी), कैंसर इम्यूनोथेरेपी के क्षेत्र में तेजी से बढ़ती उपचार रणनीति है। OHSV सहित OVs, चुनिंदा में दोहराने और कैंसर की कोशिकाओं को मारने (स्वस्थ बख्शते/सामांय कोशिकाओं) जबकि विरोधी ट्यूमर प्रतिरक्षा उत्प्रेरण । इन अद्वितीय गुणों के कारण, ओएचएसवी-आधारित उपचार रणनीतियों का उपयोग कैंसर के उपचार के लिए तेजी से किया जा रहा है, जो एफडीए-अनुमोदित टैलिमोजीन लाहरपरेवेक (टी-वीईसी) सहित कैंसर, प्रीक्लिनिकली और चिकित्सकीय रूप से उपयोग किया जा रहा है। विकास, शुद्धिकरण, और titration किसी भी OVs के लिए तीन आवश्यक प्रयोगशाला तकनीकों, oHSVs सहित, इससे पहले कि वे प्रयोगात्मक अध्ययन के लिए उपयोग किया जा सकता है । यह पेपर वेरो कोशिकाओं में ओएचएसवी को बढ़ाने के लिए एक सरल कदम-दर-कदम विधि का वर्णन करता है। ओएचएसवी गुणा के रूप में, वे वेरो कोशिकाओं में एक साइटोपैथिक प्रभाव (सीपीई) का उत्पादन करते हैं। एक बार 90-100% संक्रमित कोशिकाएं सीपीई दिखाती हैं, उन्हें धीरे-धीरे काटा जाता है, बेंजोनास और मैग्नीशियम क्लोराइड (एमजीसीएल2)के साथ इलाज किया जाता है, और सुक्रोज-रेडिएंट विधि का उपयोग करके शुद्धिकरण के अधीन होता है। शुद्धिकरण के बाद, संक्रामक oHSV (पट्टिका बनाने इकाइयों या PFUs के रूप में नामित) की संख्या वेरो कोशिकाओं में एक "पट्टिका परख" द्वारा निर्धारित किया जाता है । यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग सेल संस्कृति में और वीवो पशु प्रयोगों में इन विट्रो अध्ययनों के लिए उच्च-टिटर ओएचएसवी स्टॉक तैयार करने के लिए किया जा सकता है।

Introduction

ओन्कोलिटिक वायरस (ओवी) कैंसर इम्यूनोथेरेपी का एक उभरता हुआ और अनूठा रूप है। OVs चुनिंदा में दोहराने और ट्यूमर कोशिकाओं (बख्शते सामांय/स्वस्थ कोशिकाओं)1 जबकि विरोधी ट्यूमर प्रतिरक्षा2inducing । ओन्कोलिटिक दाद सिंप्लेक्स वायरस (oHSV) सभी OVs के बीच सबसे बड़े पैमाने पर अध्ययन वायरस में से एक है। यह क्लिनिक में सबसे दूर है, तालिमोजीन लाहेरपरेप्वेक (टी-वीईसी) उन्नत मेलानोमा3के उपचार के लिए संयुक्त राज्य अमेरिका में एफडीए अनुमोदन प्राप्त करने वाला पहला और एकमात्र OV है। टी-वीईसी के अलावा, कई अन्य आनुवंशिक रूप से इंजीनियर ओएचएसवी का विभिन्न कैंसरप्रकार3,4, 5,6,7,8में पूर्व-कैंसर और चिकित्सकीय रूप से परीक्षण किया जा रहा है। वर्तमान उन्नत पुनः संयोजन डीएनए जैव प्रौद्योगिकी ने चिकित्सीय ट्रांसजीन (एस)3,5के लिए नए ओएचएसवी कोडिंग इंजीनियरिंग की व्यवहार्यता को और बढ़ा दिया है। ओएचएसवी प्रचार, शुद्धिकरण और टाइटर दृढ़ संकल्प की एक कुशल प्रणाली महत्वपूर्ण है इससे पहले कि किसी भी (नव विकसित) ओएचएसवी को इन विट्रो और वीवो अध्ययनों के लिए परीक्षण किया जा सके। यह पेपर ओएचएसवी विकास (वेरो कोशिकाओं में), शुद्धिकरण (सुक्रोज-ढाल विधि द्वारा), और टिटरेशन (वेरो कोशिकाओं में ओएचएसवी पट्टिका परख द्वारा)(चित्र 1)की एक सरल चरण-दर-चरण विधि का वर्णन करता है। इसे प्रीक्लीनिकल अध्ययन के लिए उच्च गुणवत्ता वाले वायरल स्टॉक को प्राप्त करने के लिए किसी भी बायोसेफ्टी लेवल 2 (बीएसएल 2) प्रयोगशाला सेटिंग में आसानी से अपनाया जा सकता है।

वेरो,एक अफ्रीकी ग्रीन मंकी किडनी सेल लाइन, ओएचएसवी प्रचार9,10, 11, 12,13के लिए सबसे अधिक उपयोग की जाने वाली सेल लाइन है क्योंकि वेरो कोशिकाओं में दोषपूर्ण एंटीवायरल इंटरफेरॉन सिग्नलिंग पाथवे14है। इंटरफेरॉन जीन (स्टिंग) सिग्नलिंग के निष्क्रिय उत्तेजक के साथ अन्य कोशिका रेखाओं का उपयोग ओएचएसवी विकास12,13के लिए भी किया जा सकता है । यह प्रोटोकॉल ओएचएसवी विकास और पट्टिका परख के लिए वेरो कोशिकाओं का उपयोग करता है। प्रचार-प्रसार के बाद ओएचएसवी संक्रमित कोशिकाओं को काटा जाता है, उन्हें शुद्धिकरण के अधीन किया जाता है, जिसमें lysed कोशिकाओं को पहले मेजबान कोशिका डीएनए को नीचा दिखाने के लिए बेंजोनास नाभिक के साथ इलाज किया जाता है, नाभिक एसिड-प्रोटीन एकत्रीकरण को रोकता है, और कोशिका की चिपचिपाहट को कम करता है। चूंकि बेंजोनेज की उचित सक्रियता के लिए अक्सर एमजी2+की आवश्यकता होती है, इस प्रोटोकॉल 15 में 1-2 एमएमएम एमजीसीएल2 का उपयोग कियाजाताहै। बेंजोनासे-इलाज सेल लिस्लेट से मेजबान सेल मलबे को हाई-स्पीड सुक्रोज-रेडिएंट अपकेंद्री से पहले सीरियल फिल्ट्रेशन द्वारा और खत्म कर दिया जाता है । एक चिपचिपा 25% सुक्रोज समाधान तकिया सुक्रोज परत के माध्यम से वायरस माइग्रेशन की धीमी दर सुनिश्चित करने में मदद करता है, जिससे सुपरनैंट में मेजबान सेल से संबंधित घटकों को छोड़ दिया जाता है, इस प्रकार गोली16में शुद्धिकरण और सीमित वायरस के नुकसान में सुधार होता है। शुद्ध oHSV तो वेरो कोशिकाओं पर titrated है, और वायरल सजीले टुकड़े Giemsa धुंधला17 या एक्स लड़की धुंधला (LacZ encoding oHSVs के लिए)18द्वारा कल्पना कर रहे हैं ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1) oHSV विकास

नोट: oHSV के साथ काम करने से पहले संस्थागत जैवसेफ्टी समिति की मंजूरी सुनिश्चित करें । यह अध्ययन अनुमोदित आईबीसी प्रोटोकॉल नंबर 18007 के तहत किया गया। बीएसएल 2 सावधानियां बनाए रखें: वायरस के संपर्क में आने वाले सभी पिपेट्स, टिप्स, ट्यूब और अन्य सामग्रियों को ब्लीच करें। हाथ BSL2 सेल संस्कृति हुड छोड़ने से पहले 70% आइसोप्रोपिल अल्कोहल के साथ दस्ताने स्प्रे करें। वायरस के साथ काम करने के बाद हमेशा साबुन के पानी से हाथ अच्छी तरह धोएं।

  1. दिन-1 पर, नियमित वेरो सेल माध्यम में 7-8 × 10 6 कोशिकाओं/फ्लास्क के घनत्व पर20 टी-150 सेमी2 फ्लास्क में बीज कम मार्ग वेरो कोशिकाएं।
    नोट: वेरो माध्यम 10% गर्मी में निष्क्रिय भ्रूण बछड़ा सीरम (IFCS) के साथ Dulbecco संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) के पूरक द्वारा तैयार किया जाता है ।
  2. दिन 0 (कोशिकाएं 80-90% कॉन्फ्ल्यूंट हैं), वेरो कोशिकाओं पर ओएचएसवी इनोकुलम जोड़ें।
    1. वायरस इनोकुलम की तैयारी
      1. वायरस प्रवर्धन के लिए वायरस की प्रतिकृति क्षमता के आधार पर 0.01 से 0.1 से 0.1 तक एमओआई संक्रमण की बहुलता (एमओआई) का उपयोग करें। 20 फ्लास्क के लिए वायरस (एमएल) की मात्रा की गणना करने के लिए फॉर्मूला(1)का उपयोग करें।
        20 फ्लास्क के लिए वायरस (एमएल) की मात्रा = वायरस स्टॉक की आवश्यकता (पीएफयू) /टिटर ऑफ वायरस स्टॉक (पीएफयू/एमएल)(1)
      2. वायरस इनोकुलम (7 एमएल प्रति टी-150 सेमी 2 फ्लास्क, यानी ~ 140 एमएल20 फ्लैक्स) तैयार करने के लिए 1% IFCS के साथ पूरक उच्च ग्लूकोज दुलबेको के फॉस्फेट-बफर खारा (डीपीबीएस) का उपयोग करें। उच्च ग्लूकोज DPBS के 140 मिलील करने के लिए OHSV की आवश्यक राशि जोड़ें/
    2. 1% IFCS(10 एमएल/वॉश) के साथ पूरक उच्च ग्लूकोज डीपीबीएस के साथ टी-150 सेमी 2 फ्लास्क 2x धोएं। डीपीबीएस/1% आईएफसी को एस्पिरेट करें और 7 एमएल का वायरस इनोकुलम/टी-150 सेमी2 फ्लास्क जोड़ें।
    3. वेरो मोनोलेयर पर इनोकुलम के उचित वितरण के लिए फ्लास्क रॉकर का उपयोग करके 5 मिनट के लिए फ्लास्क को धीरे-धीरे रॉक करें, और फिर 1.5-2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर फ्लास्क को इनक्यूबेट करें। सुनिश्चित करें कि इनक्यूबेटर शेल्फ स्तर है।
    4. इनोकुलम निकालें और 1% IFCS (25 एमएल/फ्लास्क) के साथ पूरक डीएमईएम जोड़ें। फ्लास्क को 2-4 दिनों तक इनक्यूबेट करें।
  3. 90-100% सीपीई के लिए रोजाना फ्लास्क की जांच करें (चित्रा 2देखें)।
  4. ओएचएसवी संक्रमित वेरो कोशिकाओं को फसल करें।
    1. 50 एमएल शंकुपंकी ट्यूब या मीडिया कंटेनर में प्रत्येक फ्लास्क (प्रत्येक फ्लास्क में ~ 5 एमएल छोड़ दें) से संस्कृति सुपरनेट (~ 20 एमएल) लीजिए।
    2. धीरे-धीरे फ्लास्क के नीचे से कोशिकाओं को कुरेदने के लिए सेल स्क्रैपर का उपयोग करें।
      नोट: कोशिकाओं को जल्दी से फ्लास्क आना चाहिए।
    3. प्रत्येक फ्लास्क में संस्कृति सुपरनैंट (चरण 1.4.1 में एकत्र) के ~ 15 एमएल जोड़ें (जो प्रत्येक फ्लास्क में ~ 20 एमएल की मात्रा लाता है, यानी, 20 फ्लास्क के लिए 400 एमएल) और 10 एमएल बाँझ सेरोलॉजिकल पाइप का उपयोग करके कई बार फ्लास्क के नीचे धीरे-धीरे धोएं।
      नोट: सख्ती से पाइप नहीं है । सभी कोशिकाओं को बरकरार रखने का लक्ष्य रखें।
    4. कोशिकाओं (+ मध्यम) को बर्फ पर 50 एमएल शंकुल सेंट्रलाइज ट्यूबों में ले लीजिए (20 फ्लास्क से 400 एमएल कटी हुई कोशिकाओं को पकड़ने के लिए 8 ट्यूबों का उपयोग करें)।
    5. कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 ग्राम पर स्पिन करें और सुपरनेट को एस्पिरेट करें।
    6. 1.25 एमएल जोड़ें (50%) वायरस बफर (वीबी) और 1.25 एमएल (50%) प्रत्येक अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए संस्कृति सुपरनेट (चरण 1.4.1 में एकत्र) और प्रत्येक गोली को अच्छी तरह से फिर से निलंबित करें। री-निलंबित कोशिकाओं को आठ 50 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब से एक 50 एमएल शंकुल सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
      नोट: तालिका 1में वीबी समाधान की तैयारी का उल्लेख करें । मीडिया नसबंदी फिल्टर का उपयोग करके वीबी समाधान को फ़िल्टर-स्टरलाइज करें। री-सस्पेंशन के लिए 0.5 एमएल वीबी + 0.5 एमएल सुपरनैंट प्रति टी-150 सेमी2 फ्लास्क का इस्तेमाल करें, यानी 20 फ्लास्क (20 एमएल) के लिए, वीबी की 10 एमएल और कल्चर सुपरनेटेंट के 10 एमएल का इस्तेमाल करें।
    7. सूखी बर्फ/100% इथेनॉल का उपयोग करके पुनः निलंबित कोशिकाओं को स्नैप-फ्रीज करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2) ओएचएसवी शुद्धि

  1. स्नैप-फ्रीज (सूखी बर्फ और 100% इथेनॉल में) /गल (37 डिग्री सेल्सियस गर्म पानी के स्नान में) कोशिकाओं के बाद कुल 3 चक्रों के लिए 1 मिनट के लिए पानी स्नान-sonication के बाद कोशिकाओं को अलौकिक में वायरस जारी करने के लिए कोशिकाओं की उचित lysis सुनिश्चित करने के लिए ।
    नोट: 40 किलोहर्ट्ज, 120 वी पावर का उपयोग करके 1 मिनट के लिए सोनिकेशन करें। यदि एक ट्यूनेबल सोनिकेटर उपलब्ध नहीं है, तो अल्ट्रासोनिक वॉटर बाथ सोनिकेटर का उपयोग करें। धारा 3 में टिटरेशन के लिए 50 माइक्रोन एलिकोट लें, जो यह पहचानने में मदद करेगा कि शुद्धिकरण प्रक्रिया के दौरान संभावित वायरस हानि के लिए निम्नलिखित चरण (ओं) कौन सा जिम्मेदार है।
  2. सेल का इलाज बेंजोनास न्यूक्लियज़ (175 यूनिट/एमएल) + 2 एमएमएम एमजीसीएल2 (1 एम स्टॉक = 2 माइक्रोएल/एमएल), भंवर और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट के साथ करें। ट्यूब को बर्फ पर रखें और निम्नलिखित चरणों को 4 डिग्री सेल्सियस पर करें।
  3. कम गति से अपकेंद्री द्वारा सेल मलबे को गोली मारें।
    1. सेल को 10 मिनट के लिए 300 ग्राम पर स्पिन करें।
    2. एक नए 50 एमएल शंकुकीय अपकेंद्रित्र ट्यूब में सुपरनैंट लीजिए (वीबी के 0.5 एमएल में सेल पेलेट को फिर से निलंबित करें, इसे गोली-1 के रूप में नामित करें, और चरण 2.3.5 में उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें; चित्रा 1देखें)।
    3. सुपरनेट (चरण 2.3.2 में प्राप्त) को फिर से 10 मिनट के लिए 500 ग्राम पर स्पिन करें।
    4. एक नए 50 एमएल शंकुल सेंट्रलाइज ट्यूब में सुपरनैंट लीजिए (वीबी के 0.5 एमएल में सेल पेलेट को फिर से निलंबित करें, इसे गोली-2 के रूप में नामित करें, और चरण 2.3.5 में उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें; चित्रा 1देखें)।
    5. पुनः निलंबित गोली-1 (2.3.2 से) और गोली-2 (2.3.4 से) को एक नए 1.7 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब, भंवर/सोनीकेट (पानी स्नान) 2x में मिलाएं, और 10 मिनट के लिए 400 ग्राम पर स्पिन करें। सुपरनैंट लीजिए और इसे चरण 2.3.4 में प्राप्त सुपरनैंट के साथ मिलाएं; चित्रा 1देखें) ।
      नोट: चरण 2.4 में फिल्ट्रेशन प्रक्रिया से पहले वायरल एकत्रीकरण को रोकने के लिए 40 किलोहर्ट्ज, 120 वी पावर का उपयोग करके 1 मिनट के लिए सोनीशन करें। धारा 3 में टिटरेशन के लिए संयुक्त सुपरनेट का 50 माइक्रोन एलिकोट लें।
  4. निम्नलिखित 3-चरण निस्पंदन विधि का उपयोग करके संयुक्त सुपरनिटेंट (~ 21 एमएल, यानी, 1.4.6 से 20 एमएल, 2.3.2 से 0.5 एमएल, 2.3.4 से 0.5 एमएल) फ़िल्टर करें।
    1. फिल्टर के माध्यम से आसान मार्ग के लिए हर बार 10 एमएल सिरिंज (5-7 मिलील) का उपयोग करके सुपरनैंट के 21 एमएल ड्रा करें और इसे एक नए 50 एमएल शंकुकीय अपकेंद्रित्र ट्यूब (ट्यूब 1के रूप में लेबल) पर रखे एक बाँझ 5 माइक्रोनिलाइडन डिफ्लोराइड (पीवीडीएफ) झिल्ली फिल्टर के माध्यम से पारित करें।
      1. 2.4.1 में खाली की गई 50 एमएल शंकुकीय अपकेंद्रित्र ट्यूब में वीबी के 1 एमएल जोड़ें (वायरस सुपरनैंट की शेष ट्रेस मात्रा एकत्र करने के लिए), भंवर, और ट्यूब 1 पर रखे गए उसी 5 माइक्रोन पीवीडीएफ फिल्टर से गुजरता है (कुल को 22 मिलियन फिल्ट्रेट में लाना)। 2.4.2 चरण के लिए आगे बढ़ें।
    2. ट्यूब 1 से फिल्ट्रेट के 22 एमएल ड्रा (2.4.1 में) और इसे एक बाँझ 0.8 माइक्रोन मिश्रित सेल्यूलोज एस्टर (एमसीई) झिल्ली फिल्टर के माध्यम से पारित एक नई 50 मिलीएल शंकुकीय अपकेंद्रित्र ट्यूब पर रखा (ट्यूब 2 के रूप में लेबल) ।
      1. चरण 2.4.2, भंवर में खाली ट्यूब 1 में वीबी के 1 एमसीएल जोड़ें, और इसे ट्यूब 2 पर रखे गए उसी 0.8 माइक्रोन एमसीई फिल्टर के माध्यम से पारित करें (कुल को फिल्ट्रेट के 23 एमएल तक लाना)। 2.4.3 चरण के लिए आगे बढ़ें।
    3. ट्यूब 2 से फिल्ट्रेट के 23 एमएल ड्रा (2.4.1 के रूप में) और इसे एक बाँझ 0.45 माइक्रोन पीवीडीएफ फिल्टर के माध्यम से पारित एक नया 50 मिलीएल शंकुकीय अपकेंद्रित्र ट्यूब पर रखा (ट्यूब 3के रूप में लेबल) ।
      1. चरण 2.4.3, भंवर में खाली ट्यूब 2 में वीबी के 1 एमएल जोड़ें, और इसे ट्यूब 3 पर रखे गए उसी 0.45 माइक्रोन पीवीडीएफ फिल्टर के माध्यम से पारित करें (कुल को फिल्ट्रेट के 24 एमएल तक लाना)।
        नोट: धारा 3 में टिटरेशन के लिए फिलट्रेट का 50 माइक्रोन एलिकोट लें।
  5. सुक्रोज-रेडिएंट विधि का उपयोग करके हाई-स्पीड अपकेंद्रित्र
    नोट: इस प्रोटोकॉल में एक निश्चित कोण F13-14x50cy रोटर का उपयोग किया गया था। निम्नलिखित चरणों के साथ आगे बढ़ने से पहले रोटर और अपकेंद्रित्र दोनों 4 डिग्री सेल्सियस पर होना चाहिए।
    1. एक नई 50 मिली लीटर शंकुकीय अपकेंद्रित्र ट्यूब में एक बर्फ-ठंड, बाँझ-फ़िल्टर 25% सुक्रोज समाधान (हांक के संतुलित नमक समाधान के 100 एमएल में 25 ग्राम सुक्रोज पाउडर को भंग करके तैयार) के 10 एमएल जोड़ें।
    2. धीरे-धीरे (3 एमएल/न्यूनतम) सुक्रोज लेयर के शीर्ष पर वायरस फिल्ट्रेट (चरण 2.4.3.1 से प्राप्त) के 24 एमएल जोड़ें। वायरस फिल्ट्रेट और सुक्रोज समाधान की अलग-अलग परतों को बनाए रखने का ध्यान रखें।
      नोट: वायरस परत के 30 एमएल तक सुक्रोज समाधान के 10 एमएल से अधिक जोड़ा जा सकता है।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 22,620 ग्राम पर 90 मिनट के लिए ट्यूब सेंट्रलाइज करें।
    4. 50 एमएल शंकुल सेंट्रलाइज ट्यूब से सुपरनेट और सुक्रोज लेयर निकालें।
      नोट: वायरस गोली सफ़ेद होना चाहिए। धारा 3 में टिटराशन के लिए सुपरनेट का 50 माइक्रोन एलिकोट और सुक्रोज लेयर का 50 माइक्रोन एलिकोट लें।
  6. 10% ग्लाइसरोल/पीबीएस सॉल्यूशन में पैलेट को फिर से सस्पेंड करें।
    1. पैलेट को कवर करने के लिए 50 एमएल शंकुल सेंट्रलाइज ट्यूब में बाँझ 10% ग्लाइसरोल (पीबीएस में पतला) का 1 एमएल जोड़ें।
      नोट: फिर से निलंबित मिश्रण की मात्रा (जैसे 0.8-1.2 एमएल) पैलेट आकार के आधार पर भिन्न हो सकती है। एक छोटी मात्रा वायरस की एक उच्च एकाग्रता देना होगा ।
    2. 50 एमएल शंकुधारी सेंट्रलाइज ट्यूब को 2-4 घंटे के लिए बर्फ पर रखें। इस अवधि के दौरान, 30 एस के लिए हर 15 मिनट में गोली को नार्मल/भंवर से निकालने/गोली को फिर से निलंबित करने में मदद करने के लिए ।
    3. 2 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में री-सस्पेंड्ड पेलेट (10% ग्लिसरोल/पीबीएस + का 1 एमएल ले लीजिए, गोली का आकार कुल वॉल्यूम को ~1.3 एमएल तक लाएगा। [वैकल्पिक: गोली की शेष ट्रेस राशि को इकट्ठा करने के लिए एक ही 50 मिलियन ग्लिसेरोल/पीबीएस के 10% ग्लाइसरोल/पीबीएस का एक और 0.3 एमएल जोड़ें, और कुल मात्रा को ~ 1.6 एमएल तक लाने के लिए चरण 2.6.3 में फिर से निलंबित गोली के साथ गठबंधन करें।
      1. यदि चरण 2.6.3 में निलंबन टर्बिड या बादल (सेल मलबे के कारण), 10 मिनट के लिए 500 ग्राम पर ट्यूब अपकेंद्रित्र है, एक नए 2 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में सुपरनेट्ट स्थानांतरित करें, और 2.6.4 चरण के लिए आगे बढ़ें।
    4. धारा 3 में ओएचएसवी टिटरेशन के लिए 50 माइक्रोन एलिकोट लें। बाकी समाधान (250 μL/aliquot) को पेंच कैप्स के साथ बाँझ माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में (लंबी अवधि के भंडारण के लिए अच्छी तरह से सील), स्नैप-फ्रीज, और उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें (एक बार ओएचएसवी टिटर निर्धारित होने के बाद प्रयोगात्मक अध्ययन के लिए तैयार)।
      नोट: वायरस के संपर्क में आने वाली सभी सामग्रियों को हुड या निपटान से हटाने से पहले पराबैंगनी विकिरण के साथ प्रक्षालित या इलाज किया जाना चाहिए।

3. oHSV टिटरेशन और पट्टिका परख

  1. बीज 1.7-1.8 x 105 वेरो कोशिकाओं/वेरो सेल माध्यम में एक 6 अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट में अच्छी तरह से (10% IFCS के साथ DMEM; चरण १.१ देखें) ।
    नोट: सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को सजातीय रूप से पूरे कुएं में वितरित किया जाता है; प्लेट को चक्कर न लगाएं, जिससे कुओं के बीच में कोशिकाओं का संचय हो सकता है। घूमता रोकने के लिए, धीरे-धीरे प्लेट को लंबवत हाथ से रॉक करें, फिर क्षैतिज रूप से, और फिर धीरे-धीरे प्लेट को इनक्यूबेटर में रखें।
  2. अगले दिन (जब कोशिकाएं 70-80% तक पहुंचती हैं), संस्कृति माध्यम को जिम्मेदार मानते हैं, और 1% IFCS के साथ पूरक उच्च ग्लूकोज पीबीएस के 1 एमएल/वेल जोड़ते हैं। चरण 3.3 पूरा हो गया है जब तक सेल संस्कृति हुड में थाली छोड़ दें।
  3. पीबीएस/1% आईएफसी(चित्रा 3)का उपयोग करके 5 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूबों में वायरस को क्रमिक रूप से पतला करें।
    नोट: धारावाहिक कमजोर पड़ने के लिए चरण 2.6.4 में एकत्र किए गए 50 μL aliquot का उपयोग करें। 1सेंट ट्यूब (10-3 कमजोर पड़ने) में, पीबीएस/1% IFCS, भंवर के 1998 μL में वायरस के 2 μL जोड़ें। 2ट्यूब (10-5 कमजोर पड़ने) में पीबीएस/1% आईएफसी, भंवर के 990 माइक्रोन में 1सेंट ट्यूब से 10 माइक्रोन लें। 3ट्यूब (10-6 कमजोर पड़ने) में, पीबीएस/1% IFCS, भंवर के 900 माइक्रोन में2 ट्यूब से 100 माइक्रोन लें; 10-9 कमजोर पड़ने तक इस 10 गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने जारी रखें। चित्रा 3में विवरण देखें ।
  4. पीबीएस/1% IFCS aspirate, और 0.7 एमएल जोड़ें/
    नोट: कोशिकाओं को सूखने न दें।
  5. धीरे कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए एक झूली कुरसी पर थाली रॉक (वायरस इनोकुलम के सजातीय वितरण सुनिश्चित करने के लिए) ।
  6. 37 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 घंटे के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।
    नोट: इस इनक्यूबेशन अवधि के दौरान, डीएमईएम में 1:1000 कमजोर मानव इम्यूनोग्लोबुलिन जी (आईजीजी) तैयार करें, जो 1% IFCS के साथ पूरक है। 6-वेल प्लेट के लिए, 12.5 एमएल तैयार करें ताकि 2 एमएल/वेल का उपयोग चरण 3.7 में किया जा सके। मानव आईजीजी में बहुत विविधताओं के लिए खाते में कमजोर पड़ने को समायोजित करें।
  7. कुओं से वायरस इनोकुलम को हटा दें, और 1% IFCS के साथ पूरक डीएमईएम में 2 मिलीएल/0.1% मानव आईजीजी (ओएचएसवी को बेअसर करने और माध्यमिक सजीले टुकड़े के गठन को रोकने के लिए) जोड़ें। 3-4 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट को इनक्यूबेट करें।
    नोट: स्पष्ट सजीले टुकड़े आमतौर पर 3 दिनों में बनाते हैं।
  8. फिक्सिंग और धुंधला प्लेटें
    1. सुपरनेट को निकालें, और 5 मिनट के लिए शुद्ध मेथनॉल (1 एमएल/वेल) में कोशिकाओं को ठीक करें। मेथनॉल निकालें, और प्लेटों को हवा-सूखी होने दें।
    2. डिओनाइज्ड पानी के साथ पतला गिमसा दाग (1:5) और प्रति अच्छी तरह पतला गिमसा दाग का 1 एमएल जोड़ें। 10-15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर थाली इनक्यूबेट।
    3. दाग को हटा दें, नल के पानी से कुल्ला करें, और प्लेटों को हवा-सूखी होने दें।
    4. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग कर सजीले टुकड़े गिनती।
    5. lacZ अभिव्यक्ति के साथ oHSVs के लिए वैकल्पिक:
      1. सुपरनेट को निकालें, और कमरे के तापमान पर 5-10 मिनट के लिए ठंड 0.2% ग्लूटारल्डिहाइड/2% पैराफॉर्मल्डिहाइड के साथ कोशिकाओं को ठीक करें।
      2. फिक्सेटिव समाधान निकालें, और पीबीएस के साथ कोशिकाओं को 3x धोएं।
      3. कोशिकाओं (1 एमएल/वेल) में एक्स-गल समाधान जोड़ें, और 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट को इनक्यूबेट करें।
        नोट: एक्स-लड़की दाग धुंधला के दिन हौसले से तैयार किया जाना चाहिए; दीर्घकालिक भंडारण रंग की लुप्त होती करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। तालिका 1 में एक्स-गलसमाधान की तैयारी देखें।
      4. एक्स-गल दाग निकालें, और 1 मिनट के लिए नल के पानी के साथ थाली धो लें।
      5. कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए तटस्थ लाल समाधान (1 एमएल/वेल) के साथ काउंटर-दाग।
        नोट: तालिका 1में तटस्थ लाल समाधान की तैयारी देखें ।
      6. 1 मिनट के लिए नल के पानी के साथ थाली धोएं; प्लेटों को हवा-शुष्क होने दें।
      7. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप(चित्रा 4)का उपयोग कर नीले सजीले टुकड़े गिनती ।
  9. सूत्र का उपयोग करके टिटर की गणना करें(2)
    Pfu/mL (पट्टिका बनाने इकाइयों) में टाइटर = सजीले टुकड़े की संख्या/०.७ एमएल × कमजोर पड़ने कारक(2)
    नोट: उदाहरण के लिए, यदि10-9 कमजोर पड़ने में 25 सजीले टुकड़े अच्छी तरह से पाए जाते हैं, तो टाइटर 25/0.7 × 109 = 35.7 × 109 = 3.57 ×10 10 pfu/mL है। यह एलिकोट्स का अंतिम oHSV टाइटर है जो चरण 2.6.4 में तैयार किया गया है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

पूरे प्रोटोकॉल का एक संक्षिप्त अवलोकन चित्र 1में दर्शाया गया है, जो ओएचएसवी के विकास, शुद्धिकरण और टिशन में शामिल महत्वपूर्ण कदमों का प्रतिनिधित्व करता है। वेरो कोशिकाओं में सीपीई 4 घंटे के बाद एचएसवी संक्रमण19के रूप में जल्दी से पता लगाया जा सकता है । चित्रा 2 oHSV संक्रमण के बाद तीन अलग समय बिंदुओं पर वेरो कोशिकाओं में सीपीई को दर्शाता है । समय के साथ सीपीई का स्तर बढ़ जाता है। इस प्रोटोकॉल में, 90-100% सीपीई आमतौर पर कम-एमओआई ओएचएसवी टीका के 48 एच के भीतर मनाया जाता है (जो शुद्धिकरण के लिए कोशिकाओं को फसल करने का सबसे अच्छा समय है)। हालांकि, यह OHSV MOI चरण १.२ और/या oHSV प्रतिकृति क्षमता में टीका के आधार पर 4 दिनों तक ले जा सकते हैं । इस अवधि के अलावा, सीपीई के साथ कोशिकाओं को lysed किया जा सकता है, जिससे सुपरनैंट में वायरस की रिहाई होती है। इस प्रकार, एक उच्च वायरल टाइटर प्राप्त करने के लिए, जब वे बरकरार होते हैं तो सीपीई प्रभावित कोशिकाओं की कटाई करना महत्वपूर्ण होता है। एक अन्य महत्वपूर्ण कारक जो अंतिम वायरस टिटर में योगदान देता है वह ओएचएसवी प्रवर्धन के लिए उपयोग किए जाने वाले ऊतक संस्कृति फ्लास्क की संख्या या आकार है। चित्रा 3 एक दिया वायरस स्टॉक के धारावाहिक कमजोर पड़ने (10-3 से10 -9)की प्रक्रिया को दर्शाया गया है (कदम 2.6.4 में प्राप्त) पट्टिका परख द्वारा टाइटर दृढ़ संकल्प के लिए आवश्यक है । lacZ अभिव्यक्ति के साथ oHSVs के लिए, वायरल सजीले टुकड़े एक्स-लड़की धुंधला(चित्रा 4)द्वारा कल्पना की जा सकती है । इस प्रोटोकॉल में 20 टी-150 सेमी2 टिश्यू कल्चर फ्लास्क का इस्तेमाल किया गया था, जिसके लिए ओएचएसवी स्टॉक के 1.3-1.6 एमएल के 1 ×10 10 पीएलयू/एमएल के टाइटर के साथ उम्मीद की जा सकती है ।

Figure 1
चित्रा 1:oHSV विकास, शुद्धिकरण, और पट्टिका परख में शामिल प्रमुख कदमों की एक योजनाबद्ध प्रस्तुति। संक्षिप्त रूप: oHSV = oncolytic दाद सिंप्लेक्स वायरस; सीपीई = साइटोपैथिक प्रभाव; वीबी = वायरस बफर; HBSS = हांक संतुलित नमक समाधान; पीबीएस = फॉस्फेट-बफर खारा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:ओएचएसवी संक्रमण के बाद वेरो कोशिकाओं में साइटोपैथिक प्रभाव। वेरो कोशिकाओं को 0.01 के एमओआई पर 1.01 और इमेज्ड (10x आवर्धन) पर 36, 48 और 72 घंटे के बाद वायरस संक्रमण के लिए oHSV कोडिंग के साथ टीका लगाया गया था। सीपीई की पहचान ओएचएसवी-संक्रमित कोशिकाओं (काले तीरों द्वारा इंगित) की गोलाई द्वारा की जाती है। स्केल बार = 200 माइक्रोन। संक्षिप्त: oHSV = oncolytic दाद सिंप्लेक्स वायरस। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:पट्टिका परख के लिए एक oHSV स्टॉक का एक धारावाहिक कमजोर पड़ने । प्रोटोकॉल के चरण 3.3 भी देखें। संक्षिप्त: oHSV = oncolytic दाद सिंप्लेक्स वायरस। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:72 घंटे के बाद oHSV संक्रमण पर एक्स-गल-दाग सजीले टुकड़े की एक प्रतिनिधि छवि। अन पतला (ऊपरी अच्छी तरह से) और पतला (1:10; लोअर वेल) ओएचएसवी-संक्रमित सेल कल्चर सुपरनेटेंट को वेरो कोशिकाओं (70-80% कॉन्फ्लोटेंट) में जोड़ा गया, इसके बाद धारा 3.8.5 (तटस्थ लाल के साथ काउंटर-धुंधला को छोड़कर) में वर्णित एक्स-गल धुंधला प्रोटोकॉल द्वारा वर्णित किया गया है। एक्स-गल-दाग वायरस पट्टिका (बाएं पैनल से) की प्रतिनिधि छवियां बीच में प्रस्तुत की जाती हैं (4x; स्केल बार = 1000 माइक्रोन) और दाएं (10x; स्केल बार = 200 माइक्रोन) पैनल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

समाधान संरचना
वायरस बफर की तैयारी परिमाण
1 मीटर सोडियम क्लोराइड 15 एमएल
1 एम ट्रिस-हाइड्रोक्लोराइड 3 एमएल
शुद्ध पानी 132 एमएल
पीएच को 6.8 में समायोजित करें
एक्स-गल समाधान की तैयारी (एक 6-अच्छी प्लेट के लिए ~ 6.5 एमएल)
250 m पोटेशियम फेरीक्यानाइड 130 माइक्रोल
250 m पोटेशियम फेरोसायनाइड 130 माइक्रोल
1 एम मैग्नीशियम क्लोराइड 13 माइक्रोन
एक्स-गल प्री-भंग (20 मिलीग्राम/एमएल) डिमेथिल सल्फॉक्साइड (डीएमएसओ) में 162.5 माइक्रोन
पीबीएस 6064.5 माइक्रोन
एक 6-अच्छी प्लेट के लिए तटस्थ लाल समाधान की तैयारी
तटस्थ लाल समाधान 100 माइक्रोल
मेथनॉल 1 एमएल
शुद्ध पानी 7 एमएल

तालिका 1: समाधान संरचना।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

प्रोटोकॉल कम मार्ग वेरो कोशिकाओं में oHSV के विकास के साथ शुरू होता है । वेरो सेल मोनोलेयर की घुलनशीलता वायरस टीका के समय ~ 80% होनी चाहिए क्योंकि अधिक विकसित कोशिकाएं तंग रेशेदार संरचनाएं विकसित कर सकती हैं जो वेरो कोशिकाओं में ओएचएसवी प्रवेश को कम कर सकती हैं20. एक बार 90-100% सीपीई मनाया जाता है, संस्कृति सुपरनैंट को हटा दिया जाता है, कोशिकाओं को काटा जाता है, वीबी/सुपरनैंट में पुनर्नॉपित किया जाता है (चरण 1.4.6 देखें), स्नैप-फ्रोजन, और बाद में शुद्धिकरण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत। ब्लाहो और उनके सहयोगियों ने संक्रमित वेरो कोशिकाओं की कटाई और भंडारण की थोड़ी अलग विधि नियोजित की। उदाहरण के लिए, कोशिकाओं और संस्कृति मीडिया युक्त फ्लैक्स (पोटेशियम के साथ 1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन और पीबीएस के साथ पूरक) शुरू में कम से कम 15 मिनट के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए जाते हैं, जिसके बाद कमरे के तापमान पर फ्लास्क की धीमी गति से वार्मिंग होती है। कोशिकाओं को तब काटा जाता है, बाँझ दूध के साथ मिलाया जाता है, और शुद्धिकरण20तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है। इस मामले में, बाँझ दूध एक स्टेबलाइजर के रूप में कार्य करता है, और यह प्रदर्शित किया गया था कि एक वायरस स्टॉक के टाइटर नाटकीय रूप से अधिक है जब यह बाँझ दूध में संग्रहीत कियाजाताहै/ हालांकि, एक अन्य अध्ययन में, -80 डिग्री सेल्सियस पर कई दाद के भंडारण के लिए उपयोग किए जाने वाले विभिन्न स्टेबलाइजर (बाँझ दूध सहित) के बीच सीधी तुलना अंतिम वायरस टाइटर्स21पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं दिखा। यहां, सेल पेलेट को वीबी में फिर से निलंबित कर दिया गया था, जिसमें ट्रिस-बफर नमकीन (पीएच 6.8) और 10% ग्लिसरोल के साथ स्टोरेज स्टेबलाइजर के रूप में गठित किया गया था, जो आमतौर पर प्रायोगिक अध्ययनों के लिए एक उच्च वायरस टिटर (जैसा कि चरण 3.10 में उल्लिखित) देता है।

उच्च गुणवत्ता वाले वायरस स्टॉक प्राप्त करने के लिए पुनः निलंबित गोली से सभी सेलुलर और मीडिया से संबंधित घटकों को हटाना महत्वपूर्ण है। वीवो प्रयोगों के दौरान संभावित प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं से बचने के लिए गैर-वायरल कणों को हटाना महत्वपूर्ण है। विषाणु शुद्धिकरण के अनेक तरीकों का वर्णन किया गया है जिनमें अपकेंद्रित्र22, विभिन्न ढाल विधियां23, निस्पंदन24और आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी25शामिल हैं . यद्यपि यह प्रोटोकॉल सुक्रोज-रेडिएंट विधि का उपयोग करके उच्च गति अपकेंद्रित्र पर आधारित है, लेकिन अन्य ढाल विधियों की एक किस्म का उपयोग अन्य लोगों द्वारा किया गया है, जैसे कि आयोडेक्सनॉल11,26,पर्कोल27,और फिकोल-न्याकोडेंज23। ये ढाल विधियां घनत्व से वायरस को अलग करते हैं और सुक्रोज कुशन के बजाय, जहां वायरस को गोली मार दिया जाता है, ढाल से बैंड के अलगाव की आवश्यकता होती है। सुक्रोज-ढाल विधि वायरल कणों को अलग करने के लिए एक सौम्य दृष्टिकोण प्रदान करती है क्योंकि यह वायरल संक्रमण को बनाए रखते हुए वायरल लिफाफा प्रोटीन को बाधित करने के जोखिम को कम करती है। इन फायदों के बावजूद, केंद्रित सुक्रोज समाधान की उच्च ऑस्मोलैरिटी वायरल कणों को निर्जलित कर सकती है; इसलिए, इस कमी को दूर करने के लिए iodixanol ढाल विधि विकसित की गई थी। हालांकि, आयोडिक्सनॉल रेडिएंट विधि के लिए अल्ट्रासेंट्राइज और विरियन बैंड के संग्रह की आवश्यकता होती है। ओएचएसवी शुद्धिकरण के दौरान जिन अन्य कारकों पर विचार करने की आवश्यकता है, वे लंबी अवधि के भंडारण के लिए उपयोग किए जाने वाले वायरस बफर की गति और समय और विकल्प हैं। इस प्रोटोकॉल की सीमा है कि ओएचएसवी की शुद्धता की पुष्टि नहीं की जाती है; हालांकि, वेरो कोशिकाओं पर टिटरेशन द्वारा दिए गए शुद्ध ओएचएसवी स्टॉक में कार्यात्मक वायरस कणों की एक उच्च संख्या पाई गई (धारा 3 देखें)।

oHSV वेरो कोशिकाओं(चित्रा 4)पर सजीले टुकड़े रूपों । वायरल सजीले टुकड़े गिमसा स्टेनिंग द्वारा पहचाने जा सकते हैं, जो एक आसान और सुविधाजनक तरीका है। गिमसा वेरो कोशिकाओं को दाग देता है, वायरल सजीले टुकड़े को पारदर्शी या खाली छोड़ देता है जिसे आसानी से कल्पना (नग्न आंखों) किया जा सकता है और एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके गिना जाता है। जबकि एगर उठे या मिथाइलसेलुलोस के साथ मीडिया को ओवरले करने का उपयोग आमतौर पर प्लेक गठन (चरण 3.7 में) के दौरान किया जाता है ताकि वायरस और माध्यमिक संक्रमणों और पट्टिका पूंछ28के प्रसार को रोका जा सके, संस्कृति सुपरनैट में ओएचएसवी को बेअसर करने के लिए मानव आईजीजी का उपयोग आसान और अधिक सुविधाजनक है। लैक्ज़व्यक्त करने वाले ओएचएसवी के लिए, सजीले टुकड़े एक्स-गल स्टेनिंग(चित्रा 4)द्वारा कल्पना की जा सकती है, जबकि फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग फ्लोरोसेंट प्रोटीन (यानी, हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन) के लिए किया जाता है- ओएचएसवी18व्यक्त करता है। ओएचएसवी-संक्रमित कोशिकाओं का पता लगाने के लिए अतिरिक्त परख में ओएचएसवी-विशिष्ट एंटीबॉडी29 या लेजर-आधारित स्कैनिंग के साथ इम्यूनो-हिस्टोकेमिकल या फ्लोरेसेंस शामिल है, जो निकट-अवरक्त फ्लोरोफोर-संयुग्मित ओएचएसवी-विशिष्ट एंटीबॉडी30है।

माइक्रोबियल (बैक्टीरिया, खमीर, या मोल्ड) संदूषण और स्वस्थ वेरो कोशिकाओं को रोकने के लिए बंध्यता बनाए रखने जैसे एक अच्छे वायरस स्टॉक को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण उपाय किए जाने चाहिए। ओएचएसवी का लिफाफा बेहद थर्मोसेंसिटिव20है, इसलिए ओएचएसवी स्टॉक को क्रायोप्रोटेक्टेंट जैसे 10% ग्लाइसरोल में संभाला जाना चाहिए। कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल को प्रयोगशाला सेटिंग में आसानी से नियोजित और अभ्यास किया जा सकता है, लेकिन बड़े पैमाने पर वायरस उत्पादन के लिए उपयोगी नहीं हो सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

एसडीआर ऑन्कोलिटिक दाद सिंप्लेक्स वायरस से संबंधित पेटेंट पर एक सह-आविष्कारक है, जो जॉर्जटाउन विश्वविद्यालय और मैसाचुसेट्स जनरल अस्पताल द्वारा स्वामित्व और प्रबंधित है, जिसे एम्जेन और ActiVec इंक से रॉयल्टी प्राप्त हुई है और यह ईजी 427 के वैज्ञानिक सलाहकार बोर्ड पर है। अन्य लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

साहा लैब में अनुसंधान को डीओडी (W81XWH-20-1-0702) और चकमा जोंस फाउंडेशन-एबिलीन से धन द्वारा भाग में समर्थित किया गया था । सैमुअल डी रब्किन और मेलिसा आर.M हम्फ्रे को एनआईएच (R01 CA160762) द्वारा आंशिक रूप से समर्थन दिया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.7 mL centrifuge tubes Sigma CLS3620
15 mL polypropylene centrifuge tubes Falcon 352097
5 mL polypropylene tubes Falcon 352063
50 mL polypropylene centrifuge tubes Falcon 352098
6-well cell culture plates Falcon 353046
Benzonase Nuclease Sigma E8263-25KU
Cell scraper Fisher Scientific 179693
Dimethyl sulfoxide Sigma D2650-100ML
Dulbecco’s Modified Eagle Medium Corning MT-10-013-CV
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Corning MT-21-031-CV
Fetal Bovine Serum Hyclone SH3007003
Giemsa Stain Sigma G3032
Glutaraldehyde Fisher Scientific 50-262-23
Glycerol Sigma G5516
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Corning MT-21-021-CV
High-Glucose Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline Sigma D4031
Human immune globulin Gamastan NDC 13533-335-12
Magnesium chloride Fisher Chemical M33-500
Media Sterilization filter, 250 mL Nalgene, Fisher Scientific 09-740-25E
Media Sterilization filter, 500 mL Nalgene, Fisher Scientific 09-740-25C
Neutral Red solution Sigma N4638
Paraformaldehyde Fisher scientific  15710S
Plate rocker Fisher 88861043
Potassium Ferricyanide Sigma P8131
Potassium Ferrocyanide Sigma P9387
Sodium chloride Fisher Chemical S271-3
Sorvall ST 16R Centrifuge ThermoFisher Scientific 75004381
Sorvall ST 21R Centrifuge ThermoFisher Scientific 75002446
Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps Fisher Scientific 02-681-371
Sucrose Fisher Scientific BP220-1
Syringe Filter, 0.45 PVDF MilliporeSigma SLHV033RS
Syringe Filter, 0.8 MCE MilliporeSigma SLAA033SS
Syringe filter, 5 µm PVDF MilliporeSigma SLSV025LS
T150 culture flask Falcon 355001
Tris-HCl MP Biomedicals LLC 816116
Ultrasonic water bath Branson CPX-952-116R
X-gal Corning 46-101-RF

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Harrington, K., Freeman, D. J., Kelly, B., Harper, J., Soria, J. -C. Optimizing oncolytic virotherapy in cancer treatment. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (9), 689-706 (2019).
  2. Zhang, S., Rabkin, S. D. The discovery and development of oncolytic viruses: are they the future of cancer immunotherapy. Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (4), 391-410 (2021).
  3. Bommareddy, P. K., Peters, C., Saha, D., Rabkin, S. D., Kaufman, H. L. Oncolytic herpes simplex viruses as a paradigm for the treatment of cancer. Annual Review of Cancer Biology. 2 (1), 155-173 (2018).
  4. Peters, C., Rabkin, S. D. Designing herpes viruses as oncolytics. Molecular Therapy-Oncolytics. 2, 15010 (2015).
  5. Nguyen, H. -M., Saha, D. The current state of oncolytic herpes simplex virus for glioblastoma treatment. Oncolytic Virotherapy. 10, 1-27 (2021).
  6. Koch, M. S., Lawler, S. E., Chiocca, E. A. HSV-1 oncolytic viruses from bench to bedside: an overview of current clinical trials. Cancers. 12 (12), 3514 (2020).
  7. Menotti, L., Avitabile, E. Herpes simplex virus oncolytic immunovirotherapy: the blossoming branch of multimodal therapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 8310 (2020).
  8. Nguyen, H. M., Guz-Montgomery, K., Saha, D. Oncolytic virus encoding a master pro-inflammatory cytokine interleukin 12 in cancer immunotherapy. Cells. 9 (2), 400 (2020).
  9. Agarwalla, P. K., Aghi, M. K. Oncolytic herpes simplex virus engineering and preparation. Methods in Molecular Biology. 797, 1-19 (2012).
  10. Grosche, L., et al. Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves. Bio-protocol. 9 (23), 3441 (2019).
  11. Sutter, S. O., Marconi, P., Meier, A. F. Herpes simplex virus growth, preparation, and assay. Methods in Molecular Biology. 2060, 57-72 (2020).
  12. Froechlich, G., et al. Integrity of the antiviral STING-mediated DNA sensing in tumor cells is required to sustain the immunotherapeutic efficacy of herpes simplex oncolytic virus. Cancers. 12 (11), 3407 (2020).
  13. Froechlich, G., et al. Generation of a novel mesothelin-targeted oncolytic herpes virus and implemented strategies for manufacturing. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 477 (2021).
  14. Mosca, J. D., Pitha, P. M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis. Molecular and Cellular Biology. 6 (6), 2279-2283 (1986).
  15. Gousseinoz, E., Kools, W., Pattnaik, P. Nucleic acid impurity reduction in viral vaccine manufacturing. BioProcess International. 12 (2), 59-68 (2014).
  16. Herpes simplex virus: methods and protocols. Methods in Molecular Biology. Diefenbach, R. J., Fraefel, C. , Humana Press. New York, USA. (2014).
  17. Hadi, A. M., et al. An experimental trial to prepared γ1 34.5 herpes simplex virus 1 immunogene by cloning technique. Systematic Review Pharmacy. 11 (5), 140-149 (2020).
  18. Kuroda, T., Martuza, R. L., Todo, T., Rabkin, S. D. Flip-Flop HSV-BAC: bacterial artificial chromosome based system for rapid generation of recombinant herpes simplex virus vectors using two independent site-specific recombinases. BMC Biotechnology. 6, 40 (2006).
  19. Motamedifar, M., Noorafshan, A. Cytopathic effect of the herpes simplex virus type 1 appears stereologically as early as 4 h after infection of Vero cells. Micron. 39 (8), 1331-1334 (2008).
  20. Blaho, J. A., Morton, E. R., Yedowitz, J. C. Herpes simplex virus: propagation, quantification, and storage. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 14, Unit 14E 1 (2005).
  21. Malenovska, H. The influence of stabilizers and rates of freezing on preserving of structurally different animal viruses during lyophilization and subsequent storage. Journal of Applied Microbiology. 117 (6), 1810-1819 (2014).
  22. Vahlne, A. G., Blomberg, J. Purification of herpes simplex virus. Journal of General Virology. 22 (2), 297-302 (1974).
  23. Sathananthan, B., Rodahl, E., Flatmark, T., Langeland, N., Haarr, L. Purification of herpes simplex virus type 1 by density gradient centrifugation and estimation of the sedimentation coefficient of the virion. APMIS: Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 105 (3), 238-246 (1997).
  24. Mundle, S. T., et al. High-purity preparation of HSV-2 vaccine candidate ACAM529 is immunogenic and efficacious in vivo. PLoS One. 8 (2), 57224 (2013).
  25. Jiang, C., et al. Immobilized cobalt affinity chromatography provides a novel, efficient method for herpes simplex virus type 1 gene vector purification. Journal of Virology. 78 (17), 8994-9006 (2004).
  26. Grosche, L., et al. Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves. Bio-protocol. 9 (23), 3441 (2019).
  27. Svennerholm, B., et al. Separation of herpes simplex virus virions and nucleocapsids on Percoll gradients. Journal of Virological Methods. 1 (6), 303-309 (1980).
  28. Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e52065 (2014).
  29. Miyatake, S., Iyer, A., Martuza, R. L., Rabkin, S. D. Transcriptional targeting of herpes simplex virus for cell-specific replication. Journal of Virology. 71 (7), 5124-5132 (1997).
  30. Fabiani, M., Limongi, D., Palamara, A. T., De Chiara, G., Marcocci, M. E. A novel method to titrate herpes simplex virus-1 (HSV-1) using laser-based scanning of near-infrared fluorophores conjugated antibodies. Frontiers in Microbiology. 8, 1085 (2017).

Tags

इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 171 ओंकोलिटिक वायरस साइटोपैथिक प्रभाव एचएसवी वायरस विकास वायरस शुद्धिकरण सुक्रोज-ढाल विधि पट्टिका परख
ओंकोलिटिक दाद सिंप्लेक्स वायरस का विकास, शुद्धिकरण और टिटरेशन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nguyen, H. M., Sah, N., Humphrey, M. … More

Nguyen, H. M., Sah, N., Humphrey, M. R. M., Rabkin, S. D., Saha, D. Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus. J. Vis. Exp. (171), e62677, doi:10.3791/62677 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter