Spatio-temporal In Vivo Imaging af Ocular Drug Delivery Systems ved hjælp af Fiberoptic Confocal Laser Mikroendoskopi

Summary

Vi præsenterer en protokol for brug af fiberoptisk konfokal lasermikroskopi (CLM) til ikke-invasivt at studere den spatio-tidsmæssige fordeling af liposomer i øjet efter subkonjunktival injektion.

Abstract

Subkonjunktival injektion er en attraktiv vej til at administrere okulære lægemidler på grund af nem trans-scleral adgang, der omgår forreste okulære barrierer, såsom hornhinden og bindehinden. Mens terapeutiske virkninger og farmakokinetik af lægemidlerne ved subkonjunktival injektion er blevet beskrevet i nogle undersøgelser, meget få vurdere den okulære fordeling af lægemidler eller narkotika leveringssystemer (DDS). Sidstnævnte er afgørende for optimering af intraokulær DDS design og lægemiddelbiotilgængelighed for at opnå den ønskede okulær lokalisering og varighed af handling (f.eks. akut versus langvarig). Denne undersøgelse etablerer brugen af fiberoptisk konfokal lasermikroskopi (CLM) til kvalitativt at studere den okulære fordeling af fluorescerende liposomer i realtid hos levende mus efter subkonjunktival injektion. Da dette er designet til in vivo visuel inspektion af væv på mikroskopisk niveau, er dette også den første fulde beskrivelse af CLM-billeddannelsesmetoden til at studere spatio-temporal fordeling af injectables i øjet efter subkonjunktival injektion.

Introduction

Blod clearance, væv distribution, og mål belægning af narkotika i levende systemer er søjler til at forstå in vivo narkotika disposition. I prækliniske dyremodeller vurderes disse parametre typisk ved hyppig blodprøvetagning og vævsprøvetagning på bestemte tidspunkter efter lægemiddeladministration. Men disse procedurer er generelt invasive, omfatter ofte ikke-overlevelsesmålinger og nødvendiggør store dyrekohorter til statistisk kraft. Der kan være ekstra omkostninger og tid, sammen med etiske bekymringer for overdreven brug af dyr. Som et resultat, ikke-invasiv billeddannelse er hurtigt ved at blive et integreret skridt i biodistribution undersøgelser. Konfoktal lasermikroskopi (^CLM1,2) er velegnet til okulære anvendelser til ikke-invasivt billede spatio-temporal fordeling af terapeutiske i øjnene af levende dyr med høj følsomhed og høj ^{opløsning1,3,4}.

CLM har potentiale til at lette robust screening af okulære lægemiddelleveringssystemer (DDS), såsom liposomer, før omfattende kvantificering af DDS og lægemiddelbiotilgængelighed. Liposomer er attraktive for deres fleksibilitet i tuning deres fysisk-kemiske og biofysiske egenskaber5,6,7,8,9,10,11 at indkapsle et stort udvalg af terapeutisk last og kontrollere vævsstedet for lægemiddelfrigivelse og varigheden af handling. Liposomer er blevet anvendt i okulære applikationer til levering af store molekyler, såsom monoklonale antistof bevacizumab12, og små molekyler som cyclosporin13 og ganciclovir14. Lægemiddel-loaded liposomer har længere biologiske halveringstider og langvarige terapeutiske virkninger i forhold til ikke-liposomale “frie stof” formuleringer. Men, lægemiddelfordeling i okulært væv er typisk ekstrapoleret fra lægemiddelkoncentrationer i væskekomponenter i øjet (dvs. blod, vandig humor, og glasagtig humor15,16,17). Som den oprindelige in vivo skæbne lastet stof last er defineret af egenskaberne af nanocarrier selv, CLM billeddannelse af fluorescerende liposomer kan tjene som en surrogat for stoffet til at afsløre væv målretning og in situ væv bopæl gange. Desuden kan visuelle beviser for levering med CLM styre DDS re-design, evaluere terapeutiske fordele ved lægemidlet, og måske endda forudsige negative biologiske hændelser (f.eks væv toksicitet på grund af uønsket lokalisering af DDS for langvarige perioder).

Heri er en trinvis procedure detaljeret om, hvordan man studerer den okulære biodistribution af liposomer i levende mus med et dual-band CLM-system. Dette specifikke CLM-system kan registrere tofarvet fluorescens (med grønne og røde excitation lasere ved 488 nm og 660 nm) i realtid, med en frekvens på 8 billeder / s. Ved fysisk at placere detektionssonden på øjet demonstrerer protokollen billedopsamling og analyse af grøn-fluorescerende liposomer ved subkonjunktival administration hos mus, der injiceres intravenøst (IV) med 2% Evans Blue (EB) farvestof. EB farvestof hjælper visualisere vascularized strukturer i den røde fluorescens kanal. Vi viser repræsentative resultater fra en undersøgelse, der vurderer 100 nm neutrale liposomer, der består af fosfolipid-POPC (dvs. 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-fosfocholin) og dopet med fluorescein-tagged fosfolipid Fl-DHPE (dvs. N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexa-decanoylsn-glycero-3-fosphoethanolamin) i et forhold på 95% POPC: 5% Fl-DHPE (Figur 1B ). CLM er i stand til at fange de grønne fluorescein-mærkede liposomer ved 15 μm aksial og 3,30 μm lateral opløsning ved afgrænsning af EB-farvede okulære vævsgrænser.

Protocol

Alle metoder, der er beskrevet her, er blevet godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) i SingHealth (Singapore). Kvindelige C57BL/6 J mus (6- 8 uger gamle; 18-20 g) blev fremstillet fra InVivos, Singapore, og opstaldes i en temperatur og lys-kontrolleret vivarium af Duke-NUS Medical School, Singapore. Dyr blev behandlet i overensstemmelse med retningslinjerne fra Association for Research in Vision and Oftalmology (ARVO) erklæring om brug af dyr i oftalmisk og visionsforskning. <p class="jove_c…

Representative Results

Protokollen viser nytten af CLM til at vurdere den spatio-tidsmæssige okulære fordeling af grønne fluorescerende liposomer administreres gennem subkonjunktival injektion. For at gøre brug af dual-color kapacitet (488 nm og 660 nm excitation bølgelængder) af CLM-systemet, 100 nm neutral POPC liposomer, der skal injiceres blev dopet med 5% Fl-DHPE (sammensætning og karakterisering data er vist i figur 1B), og EB blev injiceret IV at identificere landemærker i øjet. Tilstedeværelsen a…

Discussion

Som det fremgår af resultaterne, CLM giver en enkel og mulig metode til at billedet den okulære fordeling af liposomer i øjet. Vi har tidligere demonstreret brugen af CLM til at karakterisere lokaliseringen af forskellige liposomale formuleringer i museøjet over ^tid1. Til ikke-invasive anvendelser tillader CLM realtidsbilleddannelse af den forreste okulære overflade for indsigt i, hvordan liposomer fordeles i øjet fra det samme dyr. Dette gør CLM egnet til pre-screen nanocarrier / DDS før …

Materials

0.08 µm polycarbonate filter	Whatman, USA	110604
0.22 µm syringe filter	Fisherbrand, Ireland	09-720-3
0.5% Proxymetacaine hydrochloride sterile opthalmic solution	Alcon, Singapore
10 µL Glass Syringe	Hamilton, USA	65460-06
1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Avanti, USA	850457
32 G needle (Hamilton, 0.5” PT4)	Hamilton, USA	7803-04
Animal Temperature Controller with heating plate (15 cm x 20 cm)	WPI, USA	ATC 2000 & 61800
Cellvizio Dual Band, S1500 Probe and Quantikit (Calibration kit in step 3.5)	Mauna Kea Technologies, France		Tip diameter: 1.5 mm, field of view: 600 µm x 500 µm, axial resolution: 15 µm, lateral resolution: 3.3 µm
Chloroform	Sigma Aldrich, USA	472476
Dumont Tweezers #5, Dumostar	WPI, USA	500233	11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm Tips
Evans Blue	Sigma Aldrich, USA	E2129
Fusidic acid eye drop	LEO Pharma, Denmark
ImageJ	National Institutes of Health, USA		https://imagej.nih.gov/ij/
Isoflurane	Piramal, USA
Malvern Zetasizer Nano ZS	Malvern Panalytical, UK
Methanol	Sigma Aldrich, USA	179337
Mini Extruder	Avanti, USA	610020
N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine (triethylammonium salt) (FL-DHPE)	Invitrogen, USA	F362
Phosphate Buffered Saline	Gibco, USA	10010023
Stereomicroscope System with table clamp stand	Olympus, Tokyo, Japan	SZ51 & SZ2-STU3