Summary

光ファイバー共焦点レーザー微小内視鏡検査を用いた眼内ドラッグデリバリーシステムの時空間的イン ビボ イメージング

Published: September 27, 2021
doi:

Summary

我々は、結膜下注射後の眼のリポソームの時空間分布を非侵襲的に研究するための光ファイバー共焦点レーザー微小内視鏡検査(CLM)の使用のためのプロトコルを提示する。

Abstract

結膜下注射は、角膜や結膜などの前眼の障壁をバイパスする容易なトランスクレラルアクセスのために眼薬を投与するための魅力的なルートです。結膜下注射時の薬剤の治療効果および薬物動態は、いくつかの研究で説明されているが、非常に少数は、薬物または薬物送達システム(DDS)の眼の分布を評価する。後者は、眼内DDS設計と薬物バイオアベイラビリティの最適化のために、所望の眼の局在化および作用持続時間(例えば、急性対長期)を達成するために重要である。本研究は、結膜下注射後の生きたマウスにおける蛍光リポソームの眼分布をリアルタイムで定性的に研究するための光ファイバー共焦点レーザー顕微鏡(CLM)の使用を確立する。これは、顕微鏡レベルでの組織の 生体内 視視検査のために設計されており、結膜下注射後に眼の注射剤の時空間分布を研究するCLMイメージング法の最初の完全な説明でもあります。

Introduction

生体系における薬物の血クリアランス、組織分布、および標的占有率は、生体内薬物の性質を理解するための柱である。前臨床動物モデルでは、これらのパラメータは、通常、薬物投与後の特定の時点で頻繁に血液および組織サンプリングによって評価される。しかし、これらの手順は、一般に侵襲的であり、多くの場合、非生存測定、および統計的パワーのための大きな動物コホートを必要とすることを含む。動物の過度の使用に対する倫理的な懸念と共に、余分なコストと時間が発生する可能性があります。その結果、非侵襲的イメージングは、バイオディストリビューション研究の不可欠なステップになりつつあります。共焦点レーザー顕微鏡(CLM1,2)は、高感度かつ高分解能の生きている動物の目の中で治療の時空間分布を非侵襲的に画像化する眼球用途に適しています1,3,4

CLMは、DDSおよび薬物バイオアベイラビリティの包括的な定量化に先立ち、リポソームなどの眼内薬物送達システム(DDS)の堅牢なスクリーニングを容易にする可能性を有する。リポソームは、物理化学的および生物物理学的特性を調整する柔軟性に対して魅力的です5,6,7,8,9,10,11は、多種多様な治療貨物をカプセル化し、薬物放出および作用持続期間の組織部位を制御する。リポソームは、モノクローナル抗体ベバシズマブ12などの大きな分子の送達のための眼球用途で使用されており、シクロスポリン13やガンシクロビル14のような小分子が使用されている。薬物を含むリポソームは、非リポソーム「フリードラッグ」製剤と比較して、生物学的半減期および長期治療効果を有する。しかし、眼組織における薬物分布は、典型的には、眼の流体成分(すなわち、血液、房水、および膜膜房151617)における薬物濃度から外挿される。装填された薬物貨物の初期のin vivo運命は、ナノキャリア自体の特性によって定義されるので、蛍光リポソームのCLMイメージングは、組織ターゲティングおよびその地で組織の滞留時間を明らかにする薬物の代理として役立つことができる。さらに、CLMによる送達の視覚的証拠は、DDS再設計を操縦し、薬物の治療上の利点を評価し、おそらく有害な生物学的事象(例えば、長引く期間のDDSの好ましくない局在化による組織毒性)を予測することさえできる。

ここで、デュアルバンドCLM系を有する生きたマウスにおけるリポソームの眼の生体分布を研究する方法について、ステップバイステップの手順を詳述する。この特定のCLMシステムは8フレーム/sの頻度の2色蛍光(緑および赤色の励磁レーザーは488 nmおよび660 nmで)をリアルタイムで検出できる。このプロトコルは、検出プローブを目の上に物理的に配置することにより、2%エバンスブルー(EB)染料で静脈内注射されたマウス(IV)での結膜下投与時の緑色蛍光リポソームの画像取得および分析を示す。EB色素は、赤い蛍光チャネルで血管形成構造を可視化するのに役立ちます。我々は、リン脂質POPC(すなわち、1-パルミトイル-2-オレロイルグリセロ-3-ホスホコリン)とフルオレセインタグリン脂質Fl-DHPE(すなわち、リン脂質を含む)で構成される100nm中性リポソームを評価する研究の代表的な結果を示す N-(フルオレセイン-5-チオカルバモイル)-1,2-ジヘキサ-デカノイルスン-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン) 95% POPC: 5% Fl-DHPE (図1B)).CLMは、EB染色された眼組織境界の線引きによって、15 μm軸方向および3.30 μmの横方向分解能で緑色のフルオレセインタグ付きリポソームを捕捉することができます。

Protocol

ここに記載されているすべての方法は、SingHealth(シンガポール)の制度的動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されています。メスのC57BL/6 Jマウス(生後6~8週、18~20g)はシンガポールのInVivosから入手し、シンガポールのデュークNUS医学部の温度と光制御されたビバリウムに収容された。動物は、眼科および視覚研究における動物の使用に関する視覚・眼科研究協会(ARVO)のガイドラインに従…

Representative Results

このプロトコルは、結膜下注射によって投与される緑色蛍光リポソームの時空間的眼分布を評価するためのCLMの有用性を示す。CLM系のデュアルカラー機能(488nmおよび660nm励起波長)を利用するために、注入される100nm中性POPCリポソームを5%Fl-DHPE(組成および特性評価データを 図1Bに示す)でドープし、EBをIV注入して目のランドマークを識別した。高血管化されたエピスクレ?…

Discussion

結果から示されるように、CLMは目のリポソームの眼分布をイメージする簡単で実現可能な方法を提供する。我々は、以前に、時間1のマウスアイ内の様々なリポソーム製剤の局在化を特徴付けるためにCLMを使用することを実証した。非侵襲的な適用のために、CLMは、同じ動物から眼の中でリポソームがどのように分布しているかの洞察のために前眼表面のリアルタイムの画像…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、NTU-Northwesternナノ医学研究所(NNIN)助成金(SV)が授与され、シンガポール国立研究財団グラントAG/CIV/GC70-C/NRF/2013/2、シンガポールの健康・生物医学(HBMS)産業整合基金事前位置決め(IAF-PP)助成金H18/01/a0/018によって資金提供されました。 技術と研究(A*STAR)(AMCへ)。デュークNUSトランスレーショナル・アンド・モレキュライメージング研究所(LTMI)のメンバーに感謝し、機器の研究とトレーニングのロジスティクスと実行を促進しました。ウィスナ・ナフォラ氏の編集支援に感謝します。

Materials

0.08 µm polycarbonate filter Whatman, USA 110604
0.22 µm syringe filter Fisherbrand, Ireland 09-720-3
0.5% Proxymetacaine hydrochloride sterile opthalmic solution Alcon, Singapore
10 µL Glass Syringe Hamilton, USA 65460-06
1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) Avanti, USA 850457
32 G needle (Hamilton, 0.5” PT4) Hamilton, USA 7803-04
Animal Temperature Controller with heating plate (15 cm x 20 cm) WPI, USA ATC 2000 & 61800
Cellvizio Dual Band, S1500 Probe and Quantikit (Calibration kit in step 3.5) Mauna Kea Technologies, France Tip diameter: 1.5 mm, field of view: 600 µm x 500 µm, axial resolution: 15 µm, lateral resolution: 3.3 µm
Chloroform Sigma Aldrich, USA 472476
Dumont Tweezers #5, Dumostar WPI, USA 500233 11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm Tips
Evans Blue Sigma Aldrich, USA E2129
Fusidic acid eye drop LEO Pharma, Denmark
ImageJ National Institutes of Health, USA https://imagej.nih.gov/ij/
Isoflurane Piramal, USA
Malvern Zetasizer Nano ZS Malvern Panalytical, UK
Methanol Sigma Aldrich, USA 179337
Mini Extruder Avanti, USA 610020
N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine (triethylammonium salt) (FL-DHPE) Invitrogen, USA F362
Phosphate Buffered Saline Gibco, USA 10010023
Stereomicroscope System with table clamp stand Olympus, Tokyo, Japan SZ51 & SZ2-STU3

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Chaw, S. Y., Wong, T. T. L., Venkatraman, S., Chacko, A. Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy. J. Vis. Exp. (175), e62685, doi:10.3791/62685 (2021).

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