Her gir vi en protokoll for screening av potensielle transkripsjonsfaktorer involvert i utviklingen av dendritisk celle (DC) ved hjelp av lentiviral transduksjon av shRNA for å oppnå stabile knockdown-cellelinjer for in vitro DC-differensiering.
Dendrittiske celler (DCs) er viktige antigen-presenterende celler som forbinder medfødte og adaptive immunresponser. Domenekontrollere er heterogene og kan deles inn i konvensjonelle domenekontrollere (CDC-er) og plasmacytoid-domenekontrollere (PDC-er). cDC-er spesialiserer seg på å presentere antigener for og aktivere naive T-celler. På den annen side kan PDC-er produsere store mengder type I interferoner (IFN-I) under virusinfeksjon. Spesifikasjonen av domenekontrollere skjer på et tidlig stadium av DC-forfedre i benmargen (BM) og defineres av et nettverk av transkripsjonsfaktorer (TFer). CDCer uttrykker for eksempel SVÆRT ID2, mens PDCer uttrykker E2-2. Siden flere og flere delsett av domenekontrollere identifiseres, er det en økende interesse for å forstå spesifikke TFer som kontrollerer DC-utvikling. Her etablerer vi en metode for å screene TFer som er kritiske for DCs differensiering in vitro ved å levere lentivirus som bærer kort hårnål RNA (shRNA) inn i en udødeliggjort hematopoietisk stamme og stamcelle (iHSPCs) linje. Etter utvelgelsen og in vitro differensiering analyseres cDC- og pDC-potensialet til de stabile nedslagscellelinjene ved strømningscytometri. Denne tilnærmingen gir en plattform for å identifisere gener som potensielt styrer DC-skjebner fra forfedre in vitro.
Domenekontrollere er sentrale regulatorer for medfødt og adaptiv immunitet1. Domenekontrollere er hovedsakelig klassifisert i to funksjonelt forskjellige populasjoner, nemlig PDCer og CDC-er. I tillegg består cDCer av to delsett, nemlig type I og type II cDCer eller cDC1s og cDC2s, henholdsvis2. pDC-er, som uttrykker BST2, Siglec-H og mellomnivåer av CD11c hos mus3,4, er cellene som kan skille ut store mengder IFN-I under betennelse og virusinfeksjon5. På grunn av deres robuste IFN-I-produserende evne mistenkes de også å spille en nøkkelrolle i utviklingen av autoimmune sykdommer, inkludert systemisk lupus erythematosus (SLE)6. cDC1s, definert av overflateuttrykket til XCR1, CD8a, CLEC9A og CD103 hos mus7, er spesialisert på aktivering og polarisering av cytotoksiske CD8 + T-celler (CTLer) gjennom antigen krysspresentasjon, og dermed initiere type I immunitet som svar på intracellulære patogener og kreft8,9. På den annen side kan cDC2s, som uttrykker CD11b og CD172α (også kjent som Sirpα) hos både mennesker og mus, aktivere CD4+ T-celler og fremme type II immunrespons mot allergen og parasitter10, samt modulere type III-immunitet etter ekstracellulære bakterier og mikrobiotagjenkjenning11,12.
Diversifisering av DCer bestemmes av en gruppe TFer fra hematopoietiske stamme- og stamceller (HSPCer) i BM. E2-2 (kodet av Tcf4) er en hovedregulator for differensiering og funksjon av PDCer13,14. Derimot driver hemmeren av DNA-binding 2 (ID2) cDC-spesifikasjonen og hemmer pDC-utvikling gjennom blokkering av E-proteinaktivitet15. Videre krever utviklingen av cDC1s IRF8 og BATF3, mens differensiering av cDC2s er svært avhengig av IRF416. Nyere arbeider har utforsket heterogeniteten til PC-er17 og CDC-er og deres transkripsjonsregulering18. På grunn av kompleksiteten i DC-nettverket er det et udekket behov for å etablere en plattform for å identifisere andre TFer som kontrollerer utviklingen og funksjonaliteten til domenekontrollere.
Her brukte vi en iHSPC som ble generert ved å uttrykke østrogenregulert kjernefysisk translokasjon av Hoxb8 i BM-celler (også referert til som Hoxb8-FL-celler)19. iHSPCer kan spre seg og forbli i et uavklart stadium i nærvær av β-østradiol og Flt3 ligand (FL), mens de begynner å skille seg ut i forskjellige DC-typer i nærvær av FL ved tilbaketrekking av β-østradiol19. Basert på denne funksjonen kan vi slå ned gener av interesse på forfedrestadiet, etterfulgt av å undersøke effekten på in vitro differensiering av PDC og CDC. Derfor er denne metoden et kraftig verktøy for å oppdage genene som regulerer utviklingen og funksjonen til domenekontrollere.
Lentivirusbaserte shRNA-vektorer brukes ofte til genaktivering ved viral transduksjon i celler og tillater stabil integrasjon i vertsgenomet. Imidlertid må ulike transduksjonseffektivitet i forskjellige celletyper vurderes, og en rekke tilnærminger er tatt for å overvinne dette problemet.
Polybrene er en polycationic polymer som kan nøytralisere ladningene på cellemembranen, og dermed forbedre bindingen av virionen til cellene under transduksjon20. Selv om det er …
The authors have nothing to disclose.
Vi er takknemlige for teknisk støtte fra Dr. Tz-Ling Chen. Vi takker National RNAi Core Facility (Academia Sinica, Taiwan) for å ha levert shRNA lentivirus (http://rnai.genmed.sinica.edu.tw). Dette arbeidet ble støttet av Vitenskaps- og teknologidepartementet, Taiwan (MOST 108-2320-B-002-037-MY3 og MOST 109-2320-B-002-054-MY3).
Antibodies | |||
APC/Cy7 anti-mouse CD11c Antibody | Biolegend | 117324 | (Clone: N418) |
FITC anti-mouse/human CD11b Antibody | Biolegend | 101206 | (Clone: M1/70) |
PE anti-mouse/human B220 Antibody | Biolegend | 103208 | (Clone: RA3-6B2) |
Cell culture | |||
1.5 mL Micro tube | ExtraGene | TUBE-170-C | |
12-well tissue culture-treated plate | Falcon | 353043 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
RPMI 1640 medium | gibco | 11875-085 | |
Reagent | |||
β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758-250MG | |
β-mercaptoethanol (β-ME) | Sigma-Aldrich | M6250 | |
FACS buffer | home-made | Formula: 1xPBS+0.5 %FBS+0.1%NaN3 | |
Flt3 ligand (FL) | home-made | ||
Polybrene | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
Puromycin | Invivogen | ant-pr-1 | |
TRIsure | BIOLINE | BIO-38032 | |
shRNA (Taregt sequence/clone ID) | Company | ||
shId2 (GCTTATGTCGAATGATAGCAA/TRCN0000054390) | The RNAi Consortium (TRC) | ||
shLacZ (CGCGATCGTAATCACCCGAGT/TRCN0000072224) | The RNAi Consortium (TRC) | ||
shTcf4 (GCTGAGTGATTTACTGGATTT/TRCN0000012094) | The RNAi Consortium (TRC) |