Studie van dendritische celontwikkeling door korte haarspeld RNA-gemedieerde gen knockdown in een hematopoëtische stam en voorlopercellijn in vitro
Summary
Hier bieden we een protocol voor het screenen van potentiële transcriptiefactoren die betrokken zijn bij de ontwikkeling van dendritische cel (DC) met behulp van lentivirale transductie van shRNA om stabiele knockdown-cellijnen te verkrijgen voor in vitro DC-differentiatie.
Abstract
Dendritische cellen (DC’s) zijn belangrijke antigeen-presenterende cellen die aangeboren en adaptieve immuunresponsen verbinden. DC’s zijn heterogeen en kunnen worden onderverdeeld in conventionele DC’s (cDC’s) en plasmacytoïde DC’s (pDC’s). cDC’s zijn gespecialiseerd in het presenteren van antigenen aan en het activeren van naïeve T-cellen. Aan de andere kant kunnen pDC’s grote hoeveelheden type I interferonen (IFN-I) produceren tijdens virale infectie. De specificatie van DC’s vindt plaats in een vroeg stadium van DC-voorlopercellen in het beenmerg (BM) en wordt gedefinieerd door een netwerk van transcriptiefactoren (TF’s). CDC’s drukken bijvoorbeeld ID2 zeer uit, terwijl pDC’s E2-2 zeer goed uitdrukken. Aangezien er steeds meer subsets van DC’s worden geïdentificeerd, is er een groeiende interesse in het begrijpen van specifieke TF’s die dc-ontwikkeling beheersen. Hier stellen we een methode vast om TF’s te screenen die cruciaal zijn voor DC-differentiatie in vitro door lentivirus met kort haarspeld RNA (shRNA) af te leveren in een onsterfelijke hematopoietische stam en voorlopercel (iHSPC’s) lijn. Na de selectie en in vitro differentiatie worden cDC- en pDC-potentiaal van de stabiele knockdown-cellijnen geanalyseerd door middel van flowcytometrie. Deze aanpak biedt een platform om genen te identificeren die mogelijk dc-loten van voorlopers in vitro beheersen.
Introduction
DC’s zijn belangrijke regulatoren van aangeboren en adaptieve immuniteit1. DC’s worden voornamelijk ingedeeld in twee functioneel verschillende populaties, namelijk pDC’s en cDC’s. Bovendien bestaan cDC’s uit twee subsets, namelijk type I en type II cDC’s of cDC1’s en cDC2’s, respectievelijk2. pDC’s, die BST2, Siglec-H en intermediaire niveaus van CD11c bij muizen tot expressie brengen3,4, zijn de cellen die grote hoeveelheden IFN-I kunnen afscheiden tijdens ontsteking en virale infectie5. Vanwege hun robuuste IFN-I-producerende vermogen wordt ook vermoed dat ze een sleutelrol spelen in de progressie van auto-immuunziekten, waaronder systemische lupus erythematosus (SLE)6. cDC1’s, gedefinieerd door de oppervlakte-expressie van XCR1, CD8a, CLEC9A en CD103 bij muizen7, zijn gespecialiseerd in de activering en polarisatie van cytotoxische CD8 + T-cellen (CTL’s) door de antigeenkruispresentatie, waardoor type I-immuniteit wordt geïnitieerd in reactie op intracellulaire pathogenen en kanker8,9. Aan de andere kant kunnen cDC2’s, die CD11b en CD172α (ook bekend als Sirpα) tot expressie brengen bij zowel mensen als muizen, CD4 + T-cellen activeren en de type II immuunrespons tegen allergenen en parasieten10 bevorderen, evenals type III-immuniteit moduleren na extracellulaire bacteriën en microbiota-herkenning11,12.
Diversificatie van DC’s wordt bepaald door een groep TF’s van hematopoietische stam- en voorlopercellen (HSPC’s) in de BM. E2-2 (gecodeerd door Tcf4) is een hoofdregulator voor differentiatie en functie van pDC’s13,14. Daarentegen stimuleert de remmer van DNA-binding 2 (ID2) de cDC-specificatie en remt de pDC-ontwikkeling door de E-eiwitactiviteit te blokkeren15. Bovendien vereist de ontwikkeling van cDC1’s IRF8 en BATF3, terwijl differentiatie van cDC2’s sterk afhankelijk is van IRF416. Recente werken hebben de heterogeniteit van pDC’s17 en cDC’s en hun transcriptionele regulatie18 onderzocht. Vanwege de complexiteit van het DC-netwerk is er een onvervulde behoefte om een platform op te zetten om andere TF’s te identificeren die de ontwikkeling en functionaliteit van DC’s beheersen.
Hier gebruikten we een iHSPC die werd gegenereerd door oestrogeen-gereguleerde nucleaire translocatie van Hoxb8 in BM-cellen (ook wel Hoxb8-FL-cellen genoemd) tot expressie te brengen19. iHSPC’s kunnen zich vermenigvuldigen en in een ongedifferentieerd stadium blijven in de aanwezigheid van β-estradiol en Flt3-ligand (FL), terwijl ze beginnen te differentiëren in verschillende DC-typen in de aanwezigheid van FL na terugtrekking van β-estradiol19. Op basis van deze functie kunnen we genen van belang neerhalen in het voorloperstadium, gevolgd door het onderzoeken van het effect op in vitro differentiatie van pDC’s en cDC’s. Daarom is deze methode een krachtig hulpmiddel om de genen te ontdekken die de ontwikkeling en functie van DC’s reguleren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lentivirus-gebaseerde shRNA-vectoren worden vaak gebruikt voor gen-uitschakeling door virale transductie in cellen en maken stabiele integratie in het gastheergenoom mogelijk. Er moet echter rekening worden gehouden met verschillende transductie-efficiëntie in verschillende celtypen en er zijn een aantal benaderingen gevolgd om dit probleem op te lossen.
Polybreen is een polycationisch polymeer dat de ladingen op het celmembraan kan neutraliseren, waardoor de binding van het virion aan de ce…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn dankbaar voor de technische ondersteuning van Dr. Tz-Ling Chen. We bedanken de National RNAi Core Facility (Academia Sinica, Taiwan) voor het leveren van shRNA lentivirus (http://rnai.genmed.sinica.edu.tw). Dit werk werd ondersteund door het Ministerie van Wetenschap en Technologie, Taiwan (MOST 108-2320-B-002-037-MY3 en MOST 109-2320-B-002-054-MY3).
Materials
| Antibodies | |||
| APC/Cy7 anti-mouse CD11c Antibody | Biolegend | 117324 | (Clone: N418) |
| FITC anti-mouse/human CD11b Antibody | Biolegend | 101206 | (Clone: M1/70) |
| PE anti-mouse/human B220 Antibody | Biolegend | 103208 | (Clone: RA3-6B2) |
| Cell culture | |||
| 1.5 mL Micro tube | ExtraGene | TUBE-170-C | |
| 12-well tissue culture-treated plate | Falcon | 353043 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| RPMI 1640 medium | gibco | 11875-085 | |
| Reagent | |||
| β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758-250MG | |
| β-mercaptoethanol (β-ME) | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| FACS buffer | home-made | Formula: 1xPBS+0.5 %FBS+0.1%NaN3 | |
| Flt3 ligand (FL) | home-made | ||
| Polybrene | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| Puromycin | Invivogen | ant-pr-1 | |
| TRIsure | BIOLINE | BIO-38032 | |
| shRNA (Taregt sequence/clone ID) | Company | ||
| shId2 (GCTTATGTCGAATGATAGCAA/TRCN0000054390) | The RNAi Consortium (TRC) | ||
| shLacZ (CGCGATCGTAATCACCCGAGT/TRCN0000072224) | The RNAi Consortium (TRC) | ||
| shTcf4 (GCTGAGTGATTTACTGGATTT/TRCN0000012094) | The RNAi Consortium (TRC) | ||
References
- Steinman, R. M., Witmer, M. D. Lymphoid dendritic cells are potent stimulators of the primary mixed leukocyte reaction in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 75 (10), 5132-5136 (1978).
- Guilliams, M., et al. Dendritic cells, monocytes and macrophages: a unified nomenclature based on ontogeny. Nature Reviews Immunology. 14 (8), 571-578 (2014).
- Blasius, A. L., Cella, M., Maldonado, J., Takai, T., Colonna, M. Siglec-H is an IPC-specific receptor that modulates type I IFN secretion through DAP12. Blood. 107 (6), 2474-2476 (2006).
- Swiecki, M., Colonna, M. Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells during viral infections, autoimmunity, and tolerance. Immunology Reviews. 234 (1), 142-162 (2010).
- Liu, Y. -. J. IPC: Professional Type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors. Annual Review of Immunology. 23 (1), 275-306 (2005).
- Panda, S. K., Kolbeck, R., Sanjuan, M. A. Plasmacytoid dendritic cells in autoimmunity. Current Opinion in Immunology. 44, 20-25 (2017).
- Durai, V., Murphy, K. M. Functions of murine dendritic cells. Immunity. 45 (4), 719-736 (2016).
- Mashayekhi, M., et al. CD8α(+) dendritic cells are the critical source of interleukin-12 that controls acute infection by Toxoplasma gondii tachyzoites. Immunity. 35 (2), 249-259 (2011).
- Anderson, D. A., Dutertre, C. -. A., Ginhoux, F., Murphy, K. M. Genetic models of human and mouse dendritic cell development and function. Nature Reviews Immunology. 21 (2), 101-115 (2021).
- Plantinga, M., et al. Conventional and monocyte-derived CD11b(+) dendritic cells initiate and maintain T helper 2 cell-mediated immunity to house dust mite allergen. Immunity. 38 (2), 322-335 (2013).
- Persson, E. K., et al. IRF4 transcription-factor-dependent CD103(+)CD11b(+) dendritic cells drive mucosal T helper 17 cell differentiation. Immunity. 38 (5), 958-969 (2013).
- Kumamoto, Y., et al. CD301b+ dermal dendritic cells drive T helper 2 cell-mediated immunity. Immunity. 39 (4), 733-743 (2013).
- Cisse, B., et al. Transcription factor E2-2 is an essential and specific regulator of plasmacytoid dendritic cell development. Cell. 135 (1), 37-48 (2008).
- Grajkowska, L. T., et al. Isoform-specific expression and feedback regulation of E protein TCF4 control dendritic cell lineage specification. Immunity. 46 (1), 65-77 (2017).
- Jackson, J. T., et al. Id2 expression delineates differential checkpoints in the genetic program of CD8α+ and CD103+ dendritic cell lineages. The EMBO Journal. 30 (13), 2690-2704 (2011).
- Suzuki, S., et al. Critical roles of interferon regulatory factor 4 in CD11bhighCD8alpha- dendritic cell development. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 101 (24), 8981-8986 (2004).
- Rodrigues, P. F., et al. Distinct progenitor lineages contribute to the heterogeneity of plasmacytoid dendritic cells. Nature Immunology. 19 (7), 711-722 (2018).
- Brown, C. C., et al. Transcriptional basis of mouse and human dendritic cell heterogeneity. Cell. 179 (4), 846-863 (2019).
- Redecke, V., et al. Hematopoietic progenitor cell lines with myeloid and lymphoid potential. Nature Methods. 10 (8), 795-803 (2013).
- Abe, A., Miyanohara, A., Friedmann, T. Polybrene increases the efficiency of gene transfer by lipofection. Gene Therapy. 5 (5), 708-711 (1998).
- Sorgi, F. L., Bhattacharya, S., Huang, L. Protamine sulfate enhances lipid-mediated gene transfer. Gene Therapy. 4 (9), 961-968 (1997).
- Kirkling, M. E., et al. Notch signaling facilitates in vitro generation of cross-presenting classical dendritic cells. Cell Reports. 23 (12), 3658-3672 (2018).
- Pearce, E. J., Everts, B. Dendritic cell metabolism. Nature Reviews. Immunology. 15 (1), 18-29 (2015).
- Wculek, S. K., Khouili, S. C., Priego, E., Heras-Murillo, I., Sancho, D. Metabolic Control of Dendritic Cell Functions: Digesting Information. Frontiers in Immunology. 10 (775), (2019).
- Saxton, R. A., Sabatini, D. M. mTOR signaling in growth, metabolism, and disease. Cell. 168 (6), 960-976 (2017).
