Studie av dendrittisk celleutvikling ved kort hårnål RNA-mediert gen knockdown i en hematopoietisk stamme og forfedercellelinje in vitro
Summary
Her gir vi en protokoll for screening av potensielle transkripsjonsfaktorer involvert i utviklingen av dendritisk celle (DC) ved hjelp av lentiviral transduksjon av shRNA for å oppnå stabile knockdown-cellelinjer for in vitro DC-differensiering.
Abstract
Dendrittiske celler (DCs) er viktige antigen-presenterende celler som forbinder medfødte og adaptive immunresponser. Domenekontrollere er heterogene og kan deles inn i konvensjonelle domenekontrollere (CDC-er) og plasmacytoid-domenekontrollere (PDC-er). cDC-er spesialiserer seg på å presentere antigener for og aktivere naive T-celler. På den annen side kan PDC-er produsere store mengder type I interferoner (IFN-I) under virusinfeksjon. Spesifikasjonen av domenekontrollere skjer på et tidlig stadium av DC-forfedre i benmargen (BM) og defineres av et nettverk av transkripsjonsfaktorer (TFer). CDCer uttrykker for eksempel SVÆRT ID2, mens PDCer uttrykker E2-2. Siden flere og flere delsett av domenekontrollere identifiseres, er det en økende interesse for å forstå spesifikke TFer som kontrollerer DC-utvikling. Her etablerer vi en metode for å screene TFer som er kritiske for DCs differensiering in vitro ved å levere lentivirus som bærer kort hårnål RNA (shRNA) inn i en udødeliggjort hematopoietisk stamme og stamcelle (iHSPCs) linje. Etter utvelgelsen og in vitro differensiering analyseres cDC- og pDC-potensialet til de stabile nedslagscellelinjene ved strømningscytometri. Denne tilnærmingen gir en plattform for å identifisere gener som potensielt styrer DC-skjebner fra forfedre in vitro.
Introduction
Domenekontrollere er sentrale regulatorer for medfødt og adaptiv immunitet1. Domenekontrollere er hovedsakelig klassifisert i to funksjonelt forskjellige populasjoner, nemlig PDCer og CDC-er. I tillegg består cDCer av to delsett, nemlig type I og type II cDCer eller cDC1s og cDC2s, henholdsvis2. pDC-er, som uttrykker BST2, Siglec-H og mellomnivåer av CD11c hos mus3,4, er cellene som kan skille ut store mengder IFN-I under betennelse og virusinfeksjon5. På grunn av deres robuste IFN-I-produserende evne mistenkes de også å spille en nøkkelrolle i utviklingen av autoimmune sykdommer, inkludert systemisk lupus erythematosus (SLE)6. cDC1s, definert av overflateuttrykket til XCR1, CD8a, CLEC9A og CD103 hos mus7, er spesialisert på aktivering og polarisering av cytotoksiske CD8 + T-celler (CTLer) gjennom antigen krysspresentasjon, og dermed initiere type I immunitet som svar på intracellulære patogener og kreft8,9. På den annen side kan cDC2s, som uttrykker CD11b og CD172α (også kjent som Sirpα) hos både mennesker og mus, aktivere CD4+ T-celler og fremme type II immunrespons mot allergen og parasitter10, samt modulere type III-immunitet etter ekstracellulære bakterier og mikrobiotagjenkjenning11,12.
Diversifisering av DCer bestemmes av en gruppe TFer fra hematopoietiske stamme- og stamceller (HSPCer) i BM. E2-2 (kodet av Tcf4) er en hovedregulator for differensiering og funksjon av PDCer13,14. Derimot driver hemmeren av DNA-binding 2 (ID2) cDC-spesifikasjonen og hemmer pDC-utvikling gjennom blokkering av E-proteinaktivitet15. Videre krever utviklingen av cDC1s IRF8 og BATF3, mens differensiering av cDC2s er svært avhengig av IRF416. Nyere arbeider har utforsket heterogeniteten til PC-er17 og CDC-er og deres transkripsjonsregulering18. På grunn av kompleksiteten i DC-nettverket er det et udekket behov for å etablere en plattform for å identifisere andre TFer som kontrollerer utviklingen og funksjonaliteten til domenekontrollere.
Her brukte vi en iHSPC som ble generert ved å uttrykke østrogenregulert kjernefysisk translokasjon av Hoxb8 i BM-celler (også referert til som Hoxb8-FL-celler)19. iHSPCer kan spre seg og forbli i et uavklart stadium i nærvær av β-østradiol og Flt3 ligand (FL), mens de begynner å skille seg ut i forskjellige DC-typer i nærvær av FL ved tilbaketrekking av β-østradiol19. Basert på denne funksjonen kan vi slå ned gener av interesse på forfedrestadiet, etterfulgt av å undersøke effekten på in vitro differensiering av PDC og CDC. Derfor er denne metoden et kraftig verktøy for å oppdage genene som regulerer utviklingen og funksjonen til domenekontrollere.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lentivirusbaserte shRNA-vektorer brukes ofte til genaktivering ved viral transduksjon i celler og tillater stabil integrasjon i vertsgenomet. Imidlertid må ulike transduksjonseffektivitet i forskjellige celletyper vurderes, og en rekke tilnærminger er tatt for å overvinne dette problemet.
Polybrene er en polycationic polymer som kan nøytralisere ladningene på cellemembranen, og dermed forbedre bindingen av virionen til cellene under transduksjon20. Selv om det er …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er takknemlige for teknisk støtte fra Dr. Tz-Ling Chen. Vi takker National RNAi Core Facility (Academia Sinica, Taiwan) for å ha levert shRNA lentivirus (http://rnai.genmed.sinica.edu.tw). Dette arbeidet ble støttet av Vitenskaps- og teknologidepartementet, Taiwan (MOST 108-2320-B-002-037-MY3 og MOST 109-2320-B-002-054-MY3).
Materials
| Antibodies | |||
| APC/Cy7 anti-mouse CD11c Antibody | Biolegend | 117324 | (Clone: N418) |
| FITC anti-mouse/human CD11b Antibody | Biolegend | 101206 | (Clone: M1/70) |
| PE anti-mouse/human B220 Antibody | Biolegend | 103208 | (Clone: RA3-6B2) |
| Cell culture | |||
| 1.5 mL Micro tube | ExtraGene | TUBE-170-C | |
| 12-well tissue culture-treated plate | Falcon | 353043 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| RPMI 1640 medium | gibco | 11875-085 | |
| Reagent | |||
| β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758-250MG | |
| β-mercaptoethanol (β-ME) | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| FACS buffer | home-made | Formula: 1xPBS+0.5 %FBS+0.1%NaN3 | |
| Flt3 ligand (FL) | home-made | ||
| Polybrene | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| Puromycin | Invivogen | ant-pr-1 | |
| TRIsure | BIOLINE | BIO-38032 | |
| shRNA (Taregt sequence/clone ID) | Company | ||
| shId2 (GCTTATGTCGAATGATAGCAA/TRCN0000054390) | The RNAi Consortium (TRC) | ||
| shLacZ (CGCGATCGTAATCACCCGAGT/TRCN0000072224) | The RNAi Consortium (TRC) | ||
| shTcf4 (GCTGAGTGATTTACTGGATTT/TRCN0000012094) | The RNAi Consortium (TRC) | ||
References
- Steinman, R. M., Witmer, M. D. Lymphoid dendritic cells are potent stimulators of the primary mixed leukocyte reaction in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 75 (10), 5132-5136 (1978).
- Guilliams, M., et al. Dendritic cells, monocytes and macrophages: a unified nomenclature based on ontogeny. Nature Reviews Immunology. 14 (8), 571-578 (2014).
- Blasius, A. L., Cella, M., Maldonado, J., Takai, T., Colonna, M. Siglec-H is an IPC-specific receptor that modulates type I IFN secretion through DAP12. Blood. 107 (6), 2474-2476 (2006).
- Swiecki, M., Colonna, M. Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells during viral infections, autoimmunity, and tolerance. Immunology Reviews. 234 (1), 142-162 (2010).
- Liu, Y. -. J. IPC: Professional Type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors. Annual Review of Immunology. 23 (1), 275-306 (2005).
- Panda, S. K., Kolbeck, R., Sanjuan, M. A. Plasmacytoid dendritic cells in autoimmunity. Current Opinion in Immunology. 44, 20-25 (2017).
- Durai, V., Murphy, K. M. Functions of murine dendritic cells. Immunity. 45 (4), 719-736 (2016).
- Mashayekhi, M., et al. CD8α(+) dendritic cells are the critical source of interleukin-12 that controls acute infection by Toxoplasma gondii tachyzoites. Immunity. 35 (2), 249-259 (2011).
- Anderson, D. A., Dutertre, C. -. A., Ginhoux, F., Murphy, K. M. Genetic models of human and mouse dendritic cell development and function. Nature Reviews Immunology. 21 (2), 101-115 (2021).
- Plantinga, M., et al. Conventional and monocyte-derived CD11b(+) dendritic cells initiate and maintain T helper 2 cell-mediated immunity to house dust mite allergen. Immunity. 38 (2), 322-335 (2013).
- Persson, E. K., et al. IRF4 transcription-factor-dependent CD103(+)CD11b(+) dendritic cells drive mucosal T helper 17 cell differentiation. Immunity. 38 (5), 958-969 (2013).
- Kumamoto, Y., et al. CD301b+ dermal dendritic cells drive T helper 2 cell-mediated immunity. Immunity. 39 (4), 733-743 (2013).
- Cisse, B., et al. Transcription factor E2-2 is an essential and specific regulator of plasmacytoid dendritic cell development. Cell. 135 (1), 37-48 (2008).
- Grajkowska, L. T., et al. Isoform-specific expression and feedback regulation of E protein TCF4 control dendritic cell lineage specification. Immunity. 46 (1), 65-77 (2017).
- Jackson, J. T., et al. Id2 expression delineates differential checkpoints in the genetic program of CD8α+ and CD103+ dendritic cell lineages. The EMBO Journal. 30 (13), 2690-2704 (2011).
- Suzuki, S., et al. Critical roles of interferon regulatory factor 4 in CD11bhighCD8alpha- dendritic cell development. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 101 (24), 8981-8986 (2004).
- Rodrigues, P. F., et al. Distinct progenitor lineages contribute to the heterogeneity of plasmacytoid dendritic cells. Nature Immunology. 19 (7), 711-722 (2018).
- Brown, C. C., et al. Transcriptional basis of mouse and human dendritic cell heterogeneity. Cell. 179 (4), 846-863 (2019).
- Redecke, V., et al. Hematopoietic progenitor cell lines with myeloid and lymphoid potential. Nature Methods. 10 (8), 795-803 (2013).
- Abe, A., Miyanohara, A., Friedmann, T. Polybrene increases the efficiency of gene transfer by lipofection. Gene Therapy. 5 (5), 708-711 (1998).
- Sorgi, F. L., Bhattacharya, S., Huang, L. Protamine sulfate enhances lipid-mediated gene transfer. Gene Therapy. 4 (9), 961-968 (1997).
- Kirkling, M. E., et al. Notch signaling facilitates in vitro generation of cross-presenting classical dendritic cells. Cell Reports. 23 (12), 3658-3672 (2018).
- Pearce, E. J., Everts, B. Dendritic cell metabolism. Nature Reviews. Immunology. 15 (1), 18-29 (2015).
- Wculek, S. K., Khouili, S. C., Priego, E., Heras-Murillo, I., Sancho, D. Metabolic Control of Dendritic Cell Functions: Digesting Information. Frontiers in Immunology. 10 (775), (2019).
- Saxton, R. A., Sabatini, D. M. mTOR signaling in growth, metabolism, and disease. Cell. 168 (6), 960-976 (2017).
