Detta protokoll syftar till att beskriva en ny metod för att mäta inneboende hjärtbränningshastighet med hjälp av mikroelektrod array registrering av hela sinoatrial nodvävnad för att identifiera pacemaking defekter hos möss. Farmakologiska medel kan också införas i denna metod för att studera deras effekter på inneboende pacemaking.
Den sinoatrial noden (SAN), som ligger i rätt atrium, innehåller pacemaker celler i hjärtat, och dysfunktion i denna region kan orsaka takykardi eller bradykardi. Tillförlitlig identifiering av hjärt pacemaking defekter kräver mätning av inneboende hjärtfrekvenser genom att till stor del förhindra påverkan av det autonoma nervsystemet, som kan maskera hastighet underskott. Traditionella metoder för att analysera inneboende hjärt pacemaker funktion inkluderar droginducerad autonoma blockad för att mäta in vivo hjärtfrekvenser, isolerade hjärtinspelningar för att mäta inneboende hjärtfrekvenser och sinoatrial remsa eller encelliga patch-clamp inspelningar av sinoatrial pacemaker celler för att mäta spontana åtgärder potentiella avfyrning priser. Dessa mer traditionella tekniker kan dock vara tekniskt utmanande och svåra att utföra. Här presenterar vi en ny metod för att mäta inneboende hjärtbränningshastighet genom att utföra mikroelektrodmatrisinspelningar (MEA) av hela berget sinoatrienodpreparat från möss. MeAs består av flera mikroelektroder ordnade i ett rutnätsliknande mönster för registrering av in vitro extracellulära fältpotentialer. Metoden som beskrivs häri har den kombinerade fördelen att vara relativt snabbare, enklare och mer exakt än tidigare metoder för att registrera inneboende hjärtfrekvenser, samtidigt som det möjliggör enkla farmakologiska förhör.
Hjärtat är ett komplext organ som styrs av både hjärt-inneboende och extrinsiska influenser som de som har sitt ursprung i hjärnan. Den sinoatrial noden (SAN) är en definierad region i hjärtat som rymmer pacemakercellerna (även kallade sinoatrial celler, eller SA-celler) som ansvarar för initiering och fortlevnad av däggdjurs hjärtslag1,2. Den inneboende hjärtfrekvensen är den hastighet som drivs av pacemakercellerna utan påverkan av andra hjärt- eller neurohumorala influenser, men traditionella mått på hjärtfrekvens hos människor och levande djur, såsom elektrokardiogram, återspeglar både pacemaker och neurala influenser på hjärtat. Det mest anmärkningsvärda neurala inflytandet på SA-celler är från det autonoma nervsystemet, som ständigt modulerar bränningsmönster för att uppfylla kroppens fysiologiska krav3. Stödja denna idé, både sympatiska och parasympatiska projektioner kan hittas nära SAN4. Det inneboende hjärtnervsystemet (ICNS) är en annan viktig neural påverkan där ganglionated plexi, särskilt i rätt atria, innervate och reglera aktiviteten hos SAN5,6.
Att förstå pacemaking underskott är kliniskt viktigt, eftersom dysfunktion kan lindra många hjärtsjukdomar, samt bidra till risken för andra komplikationer. Sjuk sinus syndrom (SSS) är en kategori av sjukdomar som kännetecknas av dysfunktion i sinoatrial noden som hindrar korrekt pacemaking7,8. SSS kan presentera med sinus bradykardi, sinus pauser, sinus gripande, sinoatrial exit block och alternerande bradyarrythmias och takyarrhythmias9 och kan leda till komplikationer inklusive ökad risk för embolisk stroke och plötslig död8,10. De med Brugada syndrom, en hjärtsjukdom som kännetecknas av ventrikulär förmaksflimmer med en ökad risk för plötslig hjärtdöd, har större risk för arytmogena händelser om de också har komorbid SAN dysfunktion11,12. Sinoatrie dysfunktion kan också ha fysiologiska konsekvenser bortom hjärtat. Till exempel har SSS observerats för att utlösa anfall hos en patient på grund av cerebral hypoperfusion13.
För att identifiera sinoatrial pacemaking underskott, inneboende hjärtfrekvenser måste bestämmas genom att mäta san verksamhet utan påverkan av autonoma nervsystemet eller humorala faktorer. Kliniskt kan detta approximeras av farmakologisk autonom blockad14, men samma teknik kan också tillämpas i däggdjursmodeller för att studera inneboende hjärtfunktion15,16. Medan detta tillvägagångssätt blockerar en stor del av bidragande neurala influenser och möjliggör hjärtundersökning in vivo, eliminerar det inte helt alla extrinsiska influenser på hjärtat. En annan forskningsteknik som används för att studera inneboende hjärtfunktion i djurmodeller är isolerade hjärtinspelningar med Langendorff-perfused hjärtan, som vanligtvis involverar mätningar med hjälp av elektrogram, pacing eller epicardial multielektrod arrayer17,18,19,20. Medan denna teknik är mer specifik för hjärtfunktion eftersom det innebär att ta bort hjärtat från kroppen, kan mätningarna fortfarande påverkas av mekano-elektriska autoregulatoriska mekanismer som kan påverka inneboende pulsmätningar21. De isolerade hjärtinspelningarna kan också fortfarande påverkas av autonom reglering genom ICNS5,6,22,23. Dessutom kan det vara svårt att upprätthålla en fysiologiskt relevant temperatur i hjärtat, vilket är avgörande för hjärtfunktionsmätningar, i isolerade hjärtmetoder20. En mer direkt metod för att studera SAN-funktion är att specifikt isolera SAN-vävnad och mäta dess aktivitet. Detta kan åstadkommas genom SAN-remsor (isolerad SAN-vävnad) eller isolerade SAN pacemakerceller24,25. Båda kräver en hög grad av teknisk utbildning, eftersom SAN är en mycket liten och mycket definierad region, och cellisolering utgör en ännu större utmaning eftersom dissociation kan skada cellens allmänna hälsa om den inte utförs korrekt. Dessutom kräver dessa tekniker expertelektrofiologiska färdigheter för att framgångsrikt registrera från vävnaden eller cellerna med hjälp av enskilda registrering av mikroelektroder.
I det här protokollet beskriver vi en teknik för att spela in SAN in vitro med hjälp av en mikroelektrod array (MEA) för att erhålla inneboende pulsmätningar. Detta tillvägagångssätt har fördelen att göra mycket specifika elektrofysiologiska inspelningar tillgängliga för forskare som saknar intensiva elektrofysiologiska färdigheter. MEAs har tidigare använts för att studera kardiomyocyt funktion i primära kardiomyocyt kulturer26,27,28,29,30,31,32,hjärt täcker33,34,35,36,37, 38,39,och vävnad hela fästen40, 41,42,43,44,45,46,47. Tidigare arbete har också gjorts för att undersöka fältpotentialer iSAN-vävnad 41,42. Här tillhandahåller vi en metodik för att använda MEA för att registrera och analysera murin inneboende SAN-avfyrningshastigheter. Vi beskriver också hur denna teknik kan användas för att testa farmakologiska effekter av läkemedel på SAN inneboende avfyrningshastigheter genom att tillhandahålla ett provexperiment som visar effekterna av 4-aminopyridin (4-AP), en spänning-gated K+ kanalblockerare. Med hjälp av definierade anatomiska landmärken kan vi noggrant registrera SAN utan att behöva utföra de omfattande vävnadsdesektioner eller cellisoleringar som krävs i andra metoder. Även om mea kan vara kostnadsöverkomliga, ger inspelningarna mycket specifika och tillförlitliga mått på pacemaking som kan användas i ett stort antal kliniska och fysiologiska forskningsapplikationer.
Att öva och behärska SAN-dissekeringsprocessen är absolut nödvändigt eftersom vävnaden är bräcklig och frisk vävnad är nödvändig för en framgångsrik inspelning. Under SAN dissekering är korrekt orientering avgörande för att få rätt region av vävnad. Hjärtats ursprungliga orientering kan dock lätt gå förlorad under dissekeringsprocessen, vilket komplicerar denna strävan. För att säkerställa rätt vänster-högerorientering bör atria därför inspekteras visuellt. Vanligtvis tenderar det högra…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansierades av National Institutes of Health, bidragsnumren R01NS100954 och R01NS099188.
4-Aminopyridine | Sigma | A78403-25G | |
22 gauge syringe needle | Fisher Scientific | 14-826-5A | Used for dissection |
23 gauge syringe needle | Fisher Scientific | 14-826-6C | Used for dissection |
60mm Petri Dishes | Genesee Scientific | 32-105G | |
500mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1C | Used to store solutions |
1000 mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1D | Used to store solutions |
Bone Forceps | Fine Science Tools | 16060-11 | |
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | |
Carbogen (95% O2, 5% CO2) | |||
Castroviejo Scissors, 4" | Fine Science Tools | 15024-10 | |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
Data Acquisition PC | CPU: Intel Xeon or Intel Core i7, Memory: 8GB, HDD: 1TB, Graphic Card: NVIDIA or On-board, Screen: 1920×1080 | ||
Dissection Microscope | Jenco | ||
Dissecting Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
Dumont #2 Laminectomy Forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
Glass Chamber | Grainger | 49WF30 | Used for mouse euthanization |
Harp Anchor Kit | Warner Instruments | SHD-22CL/15 WI 64-0247 | |
HCl | Fisher Chemicals | SA48-4 | Used for pH balancing |
Hemostat | Fine Science Tools | 13013-14 | |
Heparin | Aurobindo Pharma Limited IDA, Pashamylaram | NDC 63739-953-25 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
Inverted Microscope | Motic | AE2000 | |
Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
Lab Tape | Fisher Scientific | 15-950 | |
Light for Dissection Microscope | Dolan-Jenner | MI150DG 660000391014 | |
Magesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 208337-100G | |
MED64 Head Amplifier | MED64 | MED-A64HE1S | |
MED64 Main Amplifier | MED64 | MED-A64MD1A | |
MED64 Perfusion Cap | MED64 | MED-KCAP01 | |
MED64 Perfusion Pipe Holder Kit | MED64 | MED-KPK02 | |
MED64 ThermoConnector | MED64 | MED-CP04 | |
Mesh | Warner Instruments | 640246 | |
Microelectrode array (MEA) | Alpha Med Scientific | MED-R515A | |
Mobius Software | WitWerx Inc. | Specific software for the MED64 | |
NaOH | Fisher Chemicals | S320-500 | Used for pH balancing |
Normal Saline | Ultigiene | NDC 50989-885-17 | |
Paint Brush | Fisher Scientific | NC1751733 | |
Parafilm | Genesee Scientific | PM-996 | |
Peristaltic Pump | Gilson | F155009 | |
Peristaltic Pump Tubing | Fisher Scientific | 14-171-298 | 1/8'' Interior Diameter |
Polyethyleneimine | Sigma | P3143 | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655-500G | |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S6297 | |
Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-3 | |
Sylgruard Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S6566 | |
Sodium tetraborate | Sigma | S9640 | |
Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14074-09 | |
Transfer Pipets (3mL graduated) | Samco Scientific | 225 |