Bu protokol, farelerdeki hız yapma kusurlarını tanımlamak için tüm sinoatriyal düğüm dokusunun mikroelekrod dizi kaydını kullanarak içsel kardiyak ateşleme hızını ölçmek için yeni bir metodoloji tanımlamayı amaçlamaktadır. Farmakolojik ajanlar, içsel tempo yapımı üzerindeki etkilerini incelemek için bu yöntemde de tanıtılabilir.
Sağ kulakçıkta bulunan sinoatriyal düğüm (SAN), kalbin kalp pili hücrelerini içerir ve bu bölgenin işlev bozukluğu taşikardi veya bradikardiye neden olabilir. Kardiyak tempo oluşturma kusurlarının güvenilir bir şekilde tanımlanması, oran açıklarını maskeleyebilen otonom sinir sisteminin etkisini büyük ölçüde önleyerek iç kalp atışlarının ölçülmesini gerektirir. İntrinsic kardiyak kalp pili fonksiyonunu analiz etmek için geleneksel yöntemler, in vivo kalp atış hızlarını ölçmek için ilaç kaynaklı otonomik blokajı, içsel kalp atışlarını ölçmek için izole kalp kayıtlarını ve sponyatrial kalp pili hücrelerinin sinoatrial şeridini veya tek hücreli patch-clamp kayıtlarını spontan eylem potansiyel ateşleme hızlarını ölçmek için içerir. Ancak, bu daha geleneksel teknikler teknik olarak zor ve gerçekleştirilmesi zor olabilir. Burada, farelerden tüm montajlı sinoatriyal düğüm preparatlarının mikroelekrod dizisi (MEA) kayıtlarını gerçekleştirerek içsel kardiyak ateşleme hızını ölçmek için yeni bir metodoloji sunuyoruz. MEA’lar, in vitro hücre dışı alan potansiyellerini kaydetmek için ızgara benzeri bir desende düzenlenmiş birden fazla mikroelekroddan oluşur. Burada açıklanan yöntem, içsel kalp atış hızlarını kaydetmek için önceki yaklaşımlardan nispeten daha hızlı, daha basit ve daha kesin olmanın ve aynı zamanda kolay farmakolojik sorgulamaya izin vermenin birleşik avantajına sahiptir.
Kalp, beyinden kaynaklananlar gibi hem kardiyak hem de dışsal etkiler tarafından yönetilen karmaşık bir organdır. Sinoatrial düğüm (SAN), kalp pili hücrelerini (sinoatrial hücreler veya SA hücreleri olarak da adlandırılır) memeli kalp atışının başlatılmasından ve sürekliliğinden sorumlu olan kalp pili hücrelerini barındıran tanımlanmış bir bölgedir1,2. İç kalp atış hızı, kalp pili hücrelerinin diğer kardiyak veya nöro-humoral etkilerden etkilenmeden yönlendirdiği hızdır, ancak insanlarda ve elektrokardiyogramlar gibi canlı hayvanlarda geleneksel kalp atış hızı önlemleri kalp üzerindeki hem kalp pilini hem de sinirsel etkileri yansıtır. SA hücreleri üzerindeki en dikkat çekici sinirsel etki, vücudun fizyolojik gereksinimlerini karşılamak için ateşleme kalıplarını sürekli olarak modüle eden otonom sinir sisteminden3. Bu fikri destekleyen, hem sempatik hem de parasempatik projeksiyonlar SAN4yakınında bulunabilir. İntrinsic kardiyak sinir sistemi (ICNS), ganglionlu pleksilerin, özellikle sağ atriada, SAN5,6aktivitesini içselleştirdikleri ve düzenledikleri bir başka önemli sinirsel etkidir.
Kalp pilimleme açıklarını anlamak klinik olarak önemlidir, çünkü işlev bozukluğu birçok kardiyak bozukluğun altında yatan ve diğer komplikasyonların riskine katkıda bulunabilir. Hasta sinüs sendromu (SSS), uygun tempo yapımını engelleyen sinoatriyal düğümün işlev bozukluğu ile karakterize bir hastalık kategorisidir7,8. SSS sinüs bradikardi, sinüs duraklamaları, sinüs arrest, sinoatrial çıkış bloğu ve alternatif bradyarrythmias ve tachyarrhythmias9 ile sunulabilir ve artan embolik inme riski ve ani ölüm8,10gibi komplikasyonlara yol açabilir. Ani kardiyak ölüm riski artan ve ventriküler fibrilasyon ile işaretlenmiş bir kardiyak bozukluk olan Brugada sendromu olanlar, komorbid SAN disfonksiyonu varsa aritmojenik olaylar için daha fazla risk altındadır11,12. Sinoatriyal disfonksiyonun kalbin ötesinde fizyolojik sonuçları da olabilir. Örneğin, SSS’nin serebral hipoperfüzyon nedeniyle bir hastada nöbetleri tetiklediği gözlenmiştir13.
Sinoatriyal tempo yapma açıklarını tanımlamak için, otonom sinir sisteminin veya humoral faktörlerin etkisi olmadan SAN’ın aktivitesi ölçülerek içsel kalp atış hızlarının belirlenmesi gerekir. Klinik olarak, bu farmakolojik otonomik blokaj14ile yaklaşık olarak kullanılabilir, ancak aynı teknik memeli modellerinde içsel kardiyak fonksiyon15,16‘ yı incelemek için de uygulanabilir. Bu yaklaşım, katkıda bulunan sinirsel etkilerin büyük bir kısmını bloke ederken ve in vivo kardiyak muayeneye izin verirken, kalp üzerindeki tüm dışsal etkileri tamamen ortadan kaldırmaz. Hayvan modellerinde içsel kardiyak fonksiyonu incelemek için kullanılan bir başka araştırma tekniği, tipik olarak elektrogramlar, volta veya epikardiyal multielekrod dizileri17 , 18 , 19,20kullanılarak ölçümler içeren Langendorff perfüzyonlu kalpler kullanılarak izole edilmiş kalp kayıtlarıdır. Bu teknik kalbi vücuttan çıkarmayı içerdiğinden kardiyak fonksiyona daha spesifik olsa da, ölçümler hala içsel kalp atış hızı ölçümlerini etkileyebilecek mekano-elektrikli otoregülatör mekanizmalardan etkilenebilir21. İzole kalp kayıtları da ICNS 5,6,22,23aracılığıyla otonom düzenlemeden etkilenebilir. Ayrıca, kalp fonksiyon ölçümleri için kritik olan kalbin fizyolojik olarak ilgili bir sıcaklığını korumak, izole kalp yaklaşımlarında zor olabilir20. SAN fonksiyonunu incelemek için daha doğrudan bir yöntem, SAN dokusunu özellikle izole etmek ve aktivitesini ölçmektir. Bu, SAN şeritleri (izole SAN dokusu) veya izole SAN kalp pili hücreleri24,25aracılığıyla gerçekleştirilebilir. SAN çok küçük ve yüksek tanımlı bir bölge olduğu için her ikisi de yüksek derecede teknik eğitim gerektirir ve doğru yapılmazsa ayrışma hücrenin genel sağlığına zarar verebileceğinden hücre izolasyonu daha da büyük bir zorluk oluşturur. Ayrıca, bu teknikler bireysel kayıt mikroelektrodlarını kullanarak dokudan veya hücrelerden başarılı bir şekilde kayıt yapmak için uzman elektrofizyolojik beceriler gerektirir.
Bu protokolde, içsel kalp atış hızı ölçümleri elde etmek için bir mikroelektod dizisi (MEA) kullanarak SAN in vitrosunu kaydetme tekniğini açıklıyoruz. Bu yaklaşım, yoğun elektrofizyolojik becerilerden yoksun araştırmacılar için son derece spesifik elektrofizyolojik kayıtları erişilebilir hale getirme avantajına sahiptir. MEA’lar daha önce birincil kardiyomiyosit kültürlerinde kardiyomiyosit fonksiyonunu incelemek için kullanılmıştır26,27,28,29,30,31,32, kalp tabakaları33,34,35,36,37,38,39ve doku bütün binekler40, 41,42,43,44,45,46,47. SAN dokusu41,42’dekialan potansiyellerini incelemek için daha önce de çalışma yapılmıştır. Burada, murine içSEL SAN atış hızlarını kaydetmek ve analiz etmek için MEA’yı kullanmak için bir metodoloji sunuyoruz. Ayrıca, voltaj kapılı bir K+ kanal engelleyici olan 4-aminopyridinin (4-AP) etkilerini gösteren bir örnek deney sağlayarak ilaçların SAN iç ateşleme oranları üzerindeki farmakolojik etkilerini test etmek için bu tekniğin nasıl kullanılabileceğini açıklıyoruz. Tanımlanmış anatomik yer işaretlerini kullanarak, diğer yöntemlerde gerekli olan geniş doku diseksiyonlarını veya hücre izolasyonlarını yapmak zorunda kalmadan SAN’ı doğru bir şekilde kaydedebiliriz. MEA maliyet-yasaklayıcı olsa da, kayıtlar çok çeşitli klinik ve fizyolojik araştırma uygulamalarında kullanılabilecek son derece spesifik ve güvenilir pacemaking önlemleri sağlar.
Doku kırılgan olduğundan ve başarılı bir kayıt için sağlıklı doku gerektiğinden, SAN diseksiyon sürecini uygulamak ve mastering yapmak zorunludur. SAN diseksiyonu sırasında, dokunun uygun bölgesini elde etmek için doğru yönlendirme esastır. Bununla birlikte, diseksiyon işlemi sırasında kalbin orijinal yönelimi kolayca kaybolabilir, bu da bu çabayı zorlaştırır. Bu nedenle, doğru sol-sağ yönlendirmesini sağlamak için, atria görsel olarak denetlenmelidir. Tipik olarak, sağ atriyum daha ş…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri, R01NS100954 ve R01NS099188 hibe numaraları tarafından finanse edildi.
4-Aminopyridine | Sigma | A78403-25G | |
22 gauge syringe needle | Fisher Scientific | 14-826-5A | Used for dissection |
23 gauge syringe needle | Fisher Scientific | 14-826-6C | Used for dissection |
60mm Petri Dishes | Genesee Scientific | 32-105G | |
500mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1C | Used to store solutions |
1000 mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1D | Used to store solutions |
Bone Forceps | Fine Science Tools | 16060-11 | |
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | |
Carbogen (95% O2, 5% CO2) | |||
Castroviejo Scissors, 4" | Fine Science Tools | 15024-10 | |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
Data Acquisition PC | CPU: Intel Xeon or Intel Core i7, Memory: 8GB, HDD: 1TB, Graphic Card: NVIDIA or On-board, Screen: 1920×1080 | ||
Dissection Microscope | Jenco | ||
Dissecting Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
Dumont #2 Laminectomy Forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
Glass Chamber | Grainger | 49WF30 | Used for mouse euthanization |
Harp Anchor Kit | Warner Instruments | SHD-22CL/15 WI 64-0247 | |
HCl | Fisher Chemicals | SA48-4 | Used for pH balancing |
Hemostat | Fine Science Tools | 13013-14 | |
Heparin | Aurobindo Pharma Limited IDA, Pashamylaram | NDC 63739-953-25 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
Inverted Microscope | Motic | AE2000 | |
Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
Lab Tape | Fisher Scientific | 15-950 | |
Light for Dissection Microscope | Dolan-Jenner | MI150DG 660000391014 | |
Magesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 208337-100G | |
MED64 Head Amplifier | MED64 | MED-A64HE1S | |
MED64 Main Amplifier | MED64 | MED-A64MD1A | |
MED64 Perfusion Cap | MED64 | MED-KCAP01 | |
MED64 Perfusion Pipe Holder Kit | MED64 | MED-KPK02 | |
MED64 ThermoConnector | MED64 | MED-CP04 | |
Mesh | Warner Instruments | 640246 | |
Microelectrode array (MEA) | Alpha Med Scientific | MED-R515A | |
Mobius Software | WitWerx Inc. | Specific software for the MED64 | |
NaOH | Fisher Chemicals | S320-500 | Used for pH balancing |
Normal Saline | Ultigiene | NDC 50989-885-17 | |
Paint Brush | Fisher Scientific | NC1751733 | |
Parafilm | Genesee Scientific | PM-996 | |
Peristaltic Pump | Gilson | F155009 | |
Peristaltic Pump Tubing | Fisher Scientific | 14-171-298 | 1/8'' Interior Diameter |
Polyethyleneimine | Sigma | P3143 | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655-500G | |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S6297 | |
Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-3 | |
Sylgruard Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S6566 | |
Sodium tetraborate | Sigma | S9640 | |
Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14074-09 | |
Transfer Pipets (3mL graduated) | Samco Scientific | 225 |