Preparación de la solución de naringenina para aplicación in vivo
Summary
Aquí, el protocolo presenta la preparación de la solución de naringenina para la administración intraperitoneal in vivo . Naringenina se disuelve completamente en una mezcla de dimetilsulfóxido, Tween 80 y solución salina. Los efectos osteoporóticos antidiabéticos de la naringenina se evaluaron mediante pruebas de glucosa en sangre, tinción de fosfatasa ácida resistente al tartrato y ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas.
Abstract
La preparación de una solución compuesta (fitoquímica) es un paso pasado por alto pero crítico antes de su aplicación en estudios como la detección de fármacos. La solubilización completa del compuesto es necesaria para su uso seguro y resultados relativamente estables. Aquí, se demuestra como ejemplo un protocolo para preparar solución de naringenina y su administración intraperitoneal en un modelo diabético inducido por estreptozotocina (STZ) y dieta alta en grasas y estreptozotocina. Se utilizó una pequeña cantidad de naringenina (3,52-6,69 mg) para probar su solubilización en disolventes, incluyendo etanol, dimetilsulfóxido (DMSO) y DMSO más Tween 80 reconstituido en solución salina fisiológica (PS), respectivamente. La solubilización completa del compuesto se determina observando el color de la solución, la presencia de precipitados después de la centrifugación (2000 x g durante 30 s) o dejando reposar la solución durante 2 h a temperatura ambiente (RT). Después de obtener un compuesto estable/solución fitoquímica, la concentración/cantidad final del compuesto requerida para los estudios in vivo puede prepararse en una solución madre de disolvente solamente (sin PS), y luego diluirse/mezclarse con PS según se desee. Los efectos osteoporóticos antidiabéticos de naringenina en ratones (administración intraperitoneal a 20 mg/kg p.v., 2 mg/ml) se evaluaron midiendo la glucosa en sangre, la masa ósea (micro-CT) y la tasa de resorción ósea (tinción TRAP y ELISA). Los investigadores que buscan preparaciones detalladas de soluciones orgánicas / fitoquímicas se beneficiarán de esta técnica.
Introduction
Con el aumento de los estudios sobre el uso de compuestos fitoquímicos para la detección de fármacos, vale la pena prestar atención a los enfoques para preparar soluciones fitoquímicas para evaluar sus efectos óptimos. Muchos aspectos, como la metodología de disolución, la dosis y la concentración, deben considerarse al preparar el compuesto1.
La disolución a base de solvente es ampliamente utilizada para la preparación de compuestos orgánicos1. Los disolventes comúnmente utilizados incluyen agua, aceite, dimetilsulfóxido (DMSO), metanol, etanol, ácido fórmico, Tween, glicerina, etc2. Aunque una suspensión con sustancias no disueltas es aceptable cuando el compuesto se administra por sonda gástrica, un soluto completamente disuelto es crítico para la administración intravenosa. Dado que la solución de aceite, la suspensión y la emulsión pueden causar embolias capilares, se sugiere una solución acuosa para la preparación del compuesto, especialmente cuando se administran inyecciones intravenosas, intramusculares e intraperitoneales3.
El rango de dosis efectivas varía entre compuestos e incluso entre enfermedades tratadas con el mismo compuesto. Las determinaciones de la dosis efectiva y segura y de la concentración dependen de la literatura y de los experimentos preliminares4. Aquí, la preparación del compuesto naringenina se demuestra como ejemplo.
La naringenina (4,5,7-trihidroxiflavanona), un compuesto polifenólico, se ha estudiado en el tratamiento de enfermedades por sus actividades hepatoprotectoras5, antidiabéticas6, antiinflamatorias7 y antioxidantes8. Para aplicaciones in vivo, la administración oral de naringenina se utiliza comúnmente. Estudios previos informaron la preparación de una solución de naringenina en 0,5% -1% de carboximetilcelulosa, dosis de metilcelulosa al 0,5%, DMSO al 0,01% y solución salina fisiológica (PS) a 50-100 mg / kg, administrada por sonda oral 9,10,11,12. Además, otros estudios han reportado suplementar naringenina con comida al 3% (peso / peso) para la ingesta oral a una dosis de 3,6 g / kg / día13,14. Los estudios también han reportado el uso de etanol (0,5% v/v), PS y DMSO para disolver naringenina para inyección intraperitoneal a dosis de 10-50 mg/kg15,16,17,18. En un estudio de epilepsia del lóbulo temporal, los ratones recibieron una inyección de naringenina suspendida en carboximetilcelulosa al 0,25% disuelta en PS19. Aunque estos estudios informan el uso de diferentes disolventes para preparar soluciones de naringenina, no se han informado más detalles, como el estado de disolución y la respuesta animal.
Este protocolo introduce un procedimiento para preparar una solución de naringenina para su aplicación in vivo en la osteoporosis inducida por diabéticos. La preparación de la solución inyectable incluye la preparación de disolventes y compuestos, la estimación de la dosis, el proceso de disolución y la filtración. La dosis se determinó en base a la investigación bibliográfica y experimentos preliminares mediante el monitoreo de ratones después de administrar inyecciones todos los días durante 3 días y modificando la dosis de acuerdo con los comportamientos del ratón. La concentración final elegida (20 mg/kg p.v.) se administró por vía intraperitoneal 5 días a la semana durante 8 semanas en ratones diabéticos inducidos por estreptozotocina (STZ)20,21. Los efectos de la naringenina en la osteoporosis diabética se evaluaron mediante pruebas de glucosa en sangre, micro-CT, tinción de fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP) y ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).
En general, se observó que la naringenina en un rango de concentración de 40-400 mg / ml no se disolvió completamente en etanol o DMSO o 5% (etanol o DMSO) más 95% PS (v / v). Sin embargo, la naringenina se disolvió completamente en una mezcla de 3,52% DMSO, 3,52% Tween 80 y 92,96% PS. El procedimiento detallado ayudará a los investigadores a preparar el compuesto como una solución de inyección para la aplicación in vivo .
Protocol
Representative Results
Discussion
La preparación de la solución fitoquímica es la base para su aplicación in vivo. En este protocolo, la preparación de la solución de naringenina se demostró mediante el uso de diferentes disolventes, como etanol, DMSO, Tween 80 y PS al 0,9%. La solución en estado completamente disuelto debe controlarse aún más permitiendo que permanezca a temperatura ambiente durante algunas horas prolongadas y luego filtrada antes de usarse in vivo.
La determinación del disolvente…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81973607 y 81573992).
Materials
| 1.5 mL microtubes | Corning Science (Wujiang) Co. | 23218392 | Holding liquid |
| Automatic Dehydrator | Leica Microsystems (Shanghai) Co. | LEICA ASP 300S | Dehydrate samples |
| Blood glucose test strips | Johnson & Johnson (China) Medical Equipment Co. | 4130392 | |
| Centrifuge | MIULAB | Minute centrifuge | Centrifugal solution |
| Dehydrator | Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co. | LEICA ASP300S | Dehydration |
| DMSO | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | E918BA0041 | Co-Solvent |
| ELISA assay kit | Elabscience Biotechnology Co.,Ltd | Mouse COL1(Collagen Type I) ELISA Kit: E-EL-M0325c Mouse CTX I ELISA Kit: E-EL-M0366c Mouse PICP ELISA Kit: E-EL-M0231c Mouse PINP ELISA Kit: E-EL-M0233c |
|
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | Co-Solvent |
| Ethylene glycol monoethyl ether | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | A501118-0500 | TRAP staining |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009617 | Decalcification |
| Filter | Merck Millpore LTD. | Millex-GP, 0.22 µm | filter solution |
| Glacial acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10000218 | TRAP staining |
| Glucose meter | Johnson & Johnson (China) Medical Equipment Co. | One Touch Ultra Vue | Serial number:COJJG8GW |
| Grinder | Shanghaijingxin Experimental Technology | Tissuelyser-24 | |
| Hematoxylin | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | D005 | TRAP staining |
| Insulin syringe | Shanghai Kantaray Medical Devices Co. | 0.33 mm x 13 mm, RW LB | Intraperitoneal injection |
| L-(+) tartaric acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 100220008 | TRAP staining |
| Microscope | OLYMPUS | sz61 | Observation |
| Microtome | Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co. | LEICA RM 2135 | Section |
| Mini centrifuge | Hangzzhou Miu Instruments Co., Ltd. | Mini-6KC | Centrifuge |
| Naphthol AS-BI phosphate | SIGMA-ALDRICH | BCBS3419 | TRAP staining |
| Naringenin | Jiangsu Yongjian Pharmaceutical Co.,Ltd | 102764 | Solute |
| Paraffin Embedding station | Leica Microsystems (Shanghai) Co. | LEICA EG 1150 H, LEICA EG 1150 C | Embed samples |
| Pararosaniline base | BBI Life Sciences | E112BA0045 | TRAP staining |
| Pipettes | eppendorf | 2–20 µL, 100–1000 µL, 20–200 µL | transferre Liquid |
| Plate reader | BioTek Instruments USA, Inc. | BioTek CYTATION 3 imaging reader | ELISA |
| Resin | Shanghai Yyang Instrument Co., Ltd. | Neutral balsam | TRAP staining |
| saline (0.9 PS) | Baxter Healthcare (Shanghai) Co.,Ltd | A6E1323 | Solvent |
| Sodium acetate anhydrous | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | Merck-1.06268.0250 | 250g | TRAP staining |
| Sodium nitrite | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10020018 | TRAP staining |
| Tween-80 | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | E819BA0006 | Emulsifier |
| Zirconia beads | Shanghaijingxin Experimental Technology | 11079125z 454g | Grinding |
References
- Stoye, D. Solvents. Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry. , (2000).
- Bouchard, D., et al. Optimization of the solvent-based dissolution method to sample volatile organic compound vapors for compound-specific isotope analysis. Journal of Chromatography A. 1520, 23-34 (2017).
- Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 50 (5), 600-613 (2011).
- Vandenberg, L. N., et al. Hormones and endocrine-disrupting chemicals: low-dose effects and nonmonotonic dose responses. Endocrine Reviews. 33 (3), 378-455 (2012).
- Hernández-Aquino, E., Muriel, P. Beneficial effects of naringenin in liver diseases: Molecular mechanisms. World Journal of Gastroenterology. 24 (16), 1679-1707 (2018).
- Den Hartogh, D. J., Tsiani, E. Antidiabetic properties of naringenin: A citrus fruit polyphenol. Biomolecules. 9 (3), (2019).
- Tutunchi, H., Naeini, F., Ostadrahimi, A., Hosseinzadeh-Attar, M. J. Naringenin, a flavanone with antiviral and anti-inflammatory effects: A promising treatment strategy against COVID-19. Phytotherapy Research. 34 (12), 3137-3147 (2020).
- Zaidun, N. H., Thent, Z. C., Latiff, A. A. Combating oxidative stress disorders with citrus flavonoid: Naringenin. Life Sciences. 208, 111-122 (2018).
- Tsuhako, R., Yoshida, H., Sugita, C., Kurokawa, M. Naringenin suppresses neutrophil infiltration into adipose tissue in high-fat diet-induced obese mice. Journal of Natural Medicines. 74 (1), 229-237 (2020).
- Annadurai, T., et al. Antihyperglycemic and anti-oxidant effects of a flavanone, naringenin, in streptozotocin-nicotinamide-induced experimental diabetic rats. Journal of Physiology and Biochemistry. 68 (3), 307-318 (2012).
- Li, S., et al. Naringenin improves insulin sensitivity in gestational diabetes mellitus mice through AMPK. Nutrition & Diabetes. 9 (1), 28 (2019).
- Devan, S., Janardhanam, V. A. Effect of Naringenin on metabolic markers, lipid profile and expression of GFAP in C6 glioma cells implanted rat’s brain. Annals of Neurosciences. 18 (4), 151-155 (2011).
- Burke, A. C., et al. Naringenin enhances the regression of atherosclerosis induced by a chow diet in Ldlr-/- mice. Atherosclerosis. 286, 60-70 (2019).
- Assini, J. M., et al. Naringenin prevents obesity, hepatic steatosis, and glucose intolerance in male mice independent of fibroblast growth factor 21. Endocrinology. 156 (6), 2087-2102 (2015).
- Alifarsangi, A., Esmaeili-Mahani, S., Sheibani, V., Abbasnejad, M. The citrus flavanone naringenin prevents the development of morphine analgesic tolerance and conditioned place preference in male rats. The American Journal of Drug and Alcohol Abuse. 47 (1), 43-51 (2020).
- Sirovina, D., Oršolić, N., Gregorović, G., Končić, M. Z. Naringenin ameliorates pathological changes in liver and kidney of diabetic mice: a preliminary study. Archives of Occupational Hygiene and Toxicology. 67 (1), 19-24 (2016).
- Nguyen-Ngo, C., Willcox, J. C., Lappas, M. Anti-diabetic, anti-inflammatory, and anti-oxidant effects of Naringenin in an In vitro human model and an in vivo murine model of gestational diabetes mellitus. Molecular Nutrition & Food Research. 63 (19), 1900224 (2019).
- Ahmed, L. A., Obaid, A. A. Z., Zaki, H. F., Agha, A. M. Naringenin adds to the protective effect of L-arginine in monocrotaline-induced pulmonary hypertension in rats: favorable modulation of oxidative stress, inflammation and nitric oxide. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 62, 161-170 (2014).
- Park, J., et al. Naringenin ameliorates kainic acid-induced morphological alterations in the dentate gyrus in a mouse model of temporal lobe epilepsy. Neuroreport. 27 (15), 1182-1189 (2016).
- Matsui, H., et al. Early-stage Type 2 diabetes mellitus impairs erectile function and neurite outgrowth from the major pelvic ganglion and downregulates the gene expression of neurotrophic factors. Urology. 99, 1-7 (2017).
- Sharma, G., Ashhar, M. U., Aeri, V., Katare, D. P. Development and characterization of late-stage diabetes mellitus and -associated vascular complications. Life Sciences. 216, 295-304 (2019).
- Rowe, R. C., Sheskey, P. J., Owen, S. C. . Handbook of Pharmaceutical Excipients. , (2003).
- Fallahi, F., Roghani, M., Moghadami, S. Citrus flavonoid naringenin improves aortic reactivity in streptozotocin-diabetic rats. Indian Journal of Pharmacology. 44 (3), 382-386 (2012).
- Liu, F., Yang, H., Zhou, W. Comparison of the characteristics of induced and spontaneous db/db mouse models of type 2 diabetes mellitus. Acta Laboratorium Animalis Scientia Sinica. 22 (6), 54-59 (2014).
- Liu, S., Dong, J., Bian, Q. A dual regulatory effect of naringenin on bone homeostasis in two diabetic mice models. Traditional Medicine and Modern Medicine. 03 (02), 101-108 (2020).
- Sun, C., Wu, Z., Wang, Z., Zhang, H. Effect of ethanol/water solvents on phenolic profiles and anti-oxidant properties of beijing propolis extracts. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2015, 595393 (2015).
- Huaman-Castilla, N. L., et al. The impact of temperature and ethanol concentration on the global recovery of specific polyphenols in an integrated HPLE/RP process on carménère pomace extracts. Molecules. 24 (17), (2019).
- van Thriel, C. Toxicology of solvents (including alcohol). Reference Module in Biomedical Sciences. , (2014).
- Linakis, J. G., Cunningham, C. L. Effects of concentration of ethanol injected intraperitoneally on taste aversion, body temperature, and activity. Psychopharmacology. 64 (1), 61-65 (1979).
- Magwaza, L. S., et al. Rapid methods for extracting and quantifying phenolic compounds in citrus rinds. Food Science & Nutrition. 4 (1), 4-10 (2016).
- Smith, E. R., Hadidian, Z., Mason, M. M. The single–and repeated–dose toxicity of dimethyl sulfoxide. Annals of the New York Academy of Sciences. 141 (1), 96-109 (1967).
- Colucci, M., et al. New insights of dimethyl sulphoxide effects (DMSO) on experimental in vivo models of nociception and inflammation. Pharmacological Research. 57 (6), 419-425 (2008).
- Kawakami, K., Oda, N., Miyoshi, K., Funaki, T., Ida, Y. Solubilization behavior of a poorly soluble drug under combined use of surfactants and co-solvents. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 28 (1-2), 7-14 (2006).
