Aquí, el protocolo presenta la preparación de la solución de naringenina para la administración intraperitoneal in vivo . Naringenina se disuelve completamente en una mezcla de dimetilsulfóxido, Tween 80 y solución salina. Los efectos osteoporóticos antidiabéticos de la naringenina se evaluaron mediante pruebas de glucosa en sangre, tinción de fosfatasa ácida resistente al tartrato y ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas.
La preparación de una solución compuesta (fitoquímica) es un paso pasado por alto pero crítico antes de su aplicación en estudios como la detección de fármacos. La solubilización completa del compuesto es necesaria para su uso seguro y resultados relativamente estables. Aquí, se demuestra como ejemplo un protocolo para preparar solución de naringenina y su administración intraperitoneal en un modelo diabético inducido por estreptozotocina (STZ) y dieta alta en grasas y estreptozotocina. Se utilizó una pequeña cantidad de naringenina (3,52-6,69 mg) para probar su solubilización en disolventes, incluyendo etanol, dimetilsulfóxido (DMSO) y DMSO más Tween 80 reconstituido en solución salina fisiológica (PS), respectivamente. La solubilización completa del compuesto se determina observando el color de la solución, la presencia de precipitados después de la centrifugación (2000 x g durante 30 s) o dejando reposar la solución durante 2 h a temperatura ambiente (RT). Después de obtener un compuesto estable/solución fitoquímica, la concentración/cantidad final del compuesto requerida para los estudios in vivo puede prepararse en una solución madre de disolvente solamente (sin PS), y luego diluirse/mezclarse con PS según se desee. Los efectos osteoporóticos antidiabéticos de naringenina en ratones (administración intraperitoneal a 20 mg/kg p.v., 2 mg/ml) se evaluaron midiendo la glucosa en sangre, la masa ósea (micro-CT) y la tasa de resorción ósea (tinción TRAP y ELISA). Los investigadores que buscan preparaciones detalladas de soluciones orgánicas / fitoquímicas se beneficiarán de esta técnica.
Con el aumento de los estudios sobre el uso de compuestos fitoquímicos para la detección de fármacos, vale la pena prestar atención a los enfoques para preparar soluciones fitoquímicas para evaluar sus efectos óptimos. Muchos aspectos, como la metodología de disolución, la dosis y la concentración, deben considerarse al preparar el compuesto1.
La disolución a base de solvente es ampliamente utilizada para la preparación de compuestos orgánicos1. Los disolventes comúnmente utilizados incluyen agua, aceite, dimetilsulfóxido (DMSO), metanol, etanol, ácido fórmico, Tween, glicerina, etc2. Aunque una suspensión con sustancias no disueltas es aceptable cuando el compuesto se administra por sonda gástrica, un soluto completamente disuelto es crítico para la administración intravenosa. Dado que la solución de aceite, la suspensión y la emulsión pueden causar embolias capilares, se sugiere una solución acuosa para la preparación del compuesto, especialmente cuando se administran inyecciones intravenosas, intramusculares e intraperitoneales3.
El rango de dosis efectivas varía entre compuestos e incluso entre enfermedades tratadas con el mismo compuesto. Las determinaciones de la dosis efectiva y segura y de la concentración dependen de la literatura y de los experimentos preliminares4. Aquí, la preparación del compuesto naringenina se demuestra como ejemplo.
La naringenina (4,5,7-trihidroxiflavanona), un compuesto polifenólico, se ha estudiado en el tratamiento de enfermedades por sus actividades hepatoprotectoras5, antidiabéticas6, antiinflamatorias7 y antioxidantes8. Para aplicaciones in vivo, la administración oral de naringenina se utiliza comúnmente. Estudios previos informaron la preparación de una solución de naringenina en 0,5% -1% de carboximetilcelulosa, dosis de metilcelulosa al 0,5%, DMSO al 0,01% y solución salina fisiológica (PS) a 50-100 mg / kg, administrada por sonda oral 9,10,11,12. Además, otros estudios han reportado suplementar naringenina con comida al 3% (peso / peso) para la ingesta oral a una dosis de 3,6 g / kg / día13,14. Los estudios también han reportado el uso de etanol (0,5% v/v), PS y DMSO para disolver naringenina para inyección intraperitoneal a dosis de 10-50 mg/kg15,16,17,18. En un estudio de epilepsia del lóbulo temporal, los ratones recibieron una inyección de naringenina suspendida en carboximetilcelulosa al 0,25% disuelta en PS19. Aunque estos estudios informan el uso de diferentes disolventes para preparar soluciones de naringenina, no se han informado más detalles, como el estado de disolución y la respuesta animal.
Este protocolo introduce un procedimiento para preparar una solución de naringenina para su aplicación in vivo en la osteoporosis inducida por diabéticos. La preparación de la solución inyectable incluye la preparación de disolventes y compuestos, la estimación de la dosis, el proceso de disolución y la filtración. La dosis se determinó en base a la investigación bibliográfica y experimentos preliminares mediante el monitoreo de ratones después de administrar inyecciones todos los días durante 3 días y modificando la dosis de acuerdo con los comportamientos del ratón. La concentración final elegida (20 mg/kg p.v.) se administró por vía intraperitoneal 5 días a la semana durante 8 semanas en ratones diabéticos inducidos por estreptozotocina (STZ)20,21. Los efectos de la naringenina en la osteoporosis diabética se evaluaron mediante pruebas de glucosa en sangre, micro-CT, tinción de fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP) y ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).
En general, se observó que la naringenina en un rango de concentración de 40-400 mg / ml no se disolvió completamente en etanol o DMSO o 5% (etanol o DMSO) más 95% PS (v / v). Sin embargo, la naringenina se disolvió completamente en una mezcla de 3,52% DMSO, 3,52% Tween 80 y 92,96% PS. El procedimiento detallado ayudará a los investigadores a preparar el compuesto como una solución de inyección para la aplicación in vivo .
La preparación de la solución fitoquímica es la base para su aplicación in vivo. En este protocolo, la preparación de la solución de naringenina se demostró mediante el uso de diferentes disolventes, como etanol, DMSO, Tween 80 y PS al 0,9%. La solución en estado completamente disuelto debe controlarse aún más permitiendo que permanezca a temperatura ambiente durante algunas horas prolongadas y luego filtrada antes de usarse in vivo.
La determinación del disolvente…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81973607 y 81573992).
1.5 mL microtubes | Corning Science (Wujiang) Co. | 23218392 | Holding liquid |
Automatic Dehydrator | Leica Microsystems (Shanghai) Co. | LEICA ASP 300S | Dehydrate samples |
Blood glucose test strips | Johnson & Johnson (China) Medical Equipment Co. | 4130392 | |
Centrifuge | MIULAB | Minute centrifuge | Centrifugal solution |
Dehydrator | Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co. | LEICA ASP300S | Dehydration |
DMSO | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | E918BA0041 | Co-Solvent |
ELISA assay kit | Elabscience Biotechnology Co.,Ltd | Mouse COL1(Collagen Type I) ELISA Kit: E-EL-M0325c Mouse CTX I ELISA Kit: E-EL-M0366c Mouse PICP ELISA Kit: E-EL-M0231c Mouse PINP ELISA Kit: E-EL-M0233c |
|
Ethanol absolute | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | Co-Solvent |
Ethylene glycol monoethyl ether | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | A501118-0500 | TRAP staining |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009617 | Decalcification |
Filter | Merck Millpore LTD. | Millex-GP, 0.22 µm | filter solution |
Glacial acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10000218 | TRAP staining |
Glucose meter | Johnson & Johnson (China) Medical Equipment Co. | One Touch Ultra Vue | Serial number:COJJG8GW |
Grinder | Shanghaijingxin Experimental Technology | Tissuelyser-24 | |
Hematoxylin | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | D005 | TRAP staining |
Insulin syringe | Shanghai Kantaray Medical Devices Co. | 0.33 mm x 13 mm, RW LB | Intraperitoneal injection |
L-(+) tartaric acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 100220008 | TRAP staining |
Microscope | OLYMPUS | sz61 | Observation |
Microtome | Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co. | LEICA RM 2135 | Section |
Mini centrifuge | Hangzzhou Miu Instruments Co., Ltd. | Mini-6KC | Centrifuge |
Naphthol AS-BI phosphate | SIGMA-ALDRICH | BCBS3419 | TRAP staining |
Naringenin | Jiangsu Yongjian Pharmaceutical Co.,Ltd | 102764 | Solute |
Paraffin Embedding station | Leica Microsystems (Shanghai) Co. | LEICA EG 1150 H, LEICA EG 1150 C | Embed samples |
Pararosaniline base | BBI Life Sciences | E112BA0045 | TRAP staining |
Pipettes | eppendorf | 2–20 µL, 100–1000 µL, 20–200 µL | transferre Liquid |
Plate reader | BioTek Instruments USA, Inc. | BioTek CYTATION 3 imaging reader | ELISA |
Resin | Shanghai Yyang Instrument Co., Ltd. | Neutral balsam | TRAP staining |
saline (0.9 PS) | Baxter Healthcare (Shanghai) Co.,Ltd | A6E1323 | Solvent |
Sodium acetate anhydrous | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | Merck-1.06268.0250 | 250g | TRAP staining |
Sodium nitrite | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10020018 | TRAP staining |
Tween-80 | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | E819BA0006 | Emulsifier |
Zirconia beads | Shanghaijingxin Experimental Technology | 11079125z 454g | Grinding |