फ्लोरोसेंटली लेबल एंड बाइंडिंग प्रोटीन का उपयोग करके वीवो में गतिशील माइक्रोट्यूबुल्स इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। हमने सी एलिगेंसके पीछे पार्श्व माइक्रोट्यूबल (पीएलएम) न्यूरॉन में गतिशील माइक्रोट्यूबुल्स को लेबल, छवि और विश्लेषण करने के तरीकों का वर्णन किया।
न्यूरॉन्स में, माइक्रोट्यूबुल ओरिएंटेशन उन एक्सॉन की पहचान करने के लिए एक प्रमुख निर्धारक रहा है जिनमें माइक्रोट्यूबुल्स और डेंड्राइट्स को प्लस-एंड किया जाता है जो आम तौर पर मिश्रित अभिविन्यास होते हैं। यहां हम सी एलिगेंस में टच न्यूरॉन्स के विकास और पुनर्जनन के दौरान माइक्रोट्यूबुले गतिशीलता और विकास को लेबल, छवि और विश्लेषण करने के तरीकों का वर्णन करते हैं। माइक्रोट्यूबुले टिप्स के आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स का उपयोग करके, हमने एक्सोनल माइक्रोट्यूबुल्स को इमेज किया। एक्सोटॉमी के बाद एक्सोन पुनर्जनन शुरू करने वाले माइक्रोट्यूबुल व्यवहार में स्थानीय परिवर्तनों को इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है। यह परख विभिन्न सेलुलर प्रक्रियाओं में माइक्रोट्यूबुल गतिशीलता के नियमन की जांच करने के लिए अन्य न्यूरॉन्स और आनुवंशिक पृष्ठभूमि के लिए अनुकूलनीय है।
न्यूरॉन्स में एक विस्तृत वास्तुकला होती है जिसमें विशेष डिब्बों जैसे डेंड्राइट्स, सेल बॉडीज, एक्सॉन और सिनेप्स होते हैं। न्यूरोनल साइटोस्केलेटन माइक्रोट्यूबुल्स, माइक्रोफिलामेंट्स और न्यूरोफिलामेंट्स का गठन किया जाता है और उनका अलग संगठन न्यूरोनल डिब्बों को संरचनात्मक रूप से और कार्यात्मक रूप से1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 का समर्थन करता है . इन वर्षों में, माइक्रोट्यूबुल संगठन को न्यूरोनल ध्रुवता और कार्य के एक प्रमुख निर्धारक के रूप में पहचाना गया है। चूंकि न्यूरॉन्स विकास या पुनर्जनन के दौरान संरचनात्मक पुनर्मॉडलिंग से गुजरते हैं, माइक्रोट्यूबुले गतिशीलता और अभिविन्यास पहचान, ध्रुवीकृत परिवहन, विकास और विभिन्न न्यूरोनल डिब्बों के विकास को निर्धारित करते हैं7। इसलिए, न्यूरोनल रिमॉडलिंग प्रक्रिया से सहसंबंधित करने के लिए वीवो में माइक्रोट्यूबुले गतिशीलता और अभिविन्यास का आकलन करना अनिवार्य है।
माइक्रोट्यूबुल्स α और β तुबुलिन हेट्रोडिमर्स के प्रोटोफिलामेंट्स से मिलकर गतिशील प्लस सिरों और अपेक्षाकृत स्थिर माइनस11,12समाप्त होता है । प्लस टिप कॉम्प्लेक्स और संबंधित अंत बाध्यकारी प्रोटीन की खोज ने माइक्रोट्यूबुले संगठन13का आकलन करने के लिए एक मंच सक्षम किया है । माइक्रोट्यूबुल के बढ़ते प्लस सिरों के साथ अंतिम बाध्यकारी प्रोटीन (ईबीपी) क्षणिक रूप से संबद्ध होते हैं और उनकी संघ गतिशीलता माइक्रोटुबुल प्रोटोफिलामेंट्स14, 15के विकास से सहसंबद्ध होती है। माइक्रोट्यूबुले के साथ प्लस टिप कॉम्प्लेक्स के लगातार सहयोग और वियोजन के कारण, जीएफपी-टैग किए गए ईबीपी का बिंदु प्रसार कार्य टाइमलैप्स मूवी15,16में “धूमकेतु” के रूप में दिखाई देता है। चूंकि स्तनधारी न्यूरॉन्स16में अग्रणी अवलोकन के बाद से फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ टैग किए गए अंतिम बाध्यकारी प्रोटीन का उपयोग विभिन्न मॉडल प्रणालियों और न्यूरॉन प्रकार 17 , 18 ,19, 20 ,22,22,23में माइक्रोटुबुल गतिशीलता का निर्धारण करने के लिए किया गया है ।
अपने सरल तंत्रिका तंत्र और पारदर्शी शरीर के कारण, सी एलिगेंस वीवो मेंविकास और उत्थान के दौरान न्यूरोनल रीमॉडलिंग का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रणाली साबित हुई है। यहां हम सी एलिगेंस में टच न्यूरॉन्स के विकास और पुनर्जनन के दौरान माइक्रोट्यूबुले गतिशीलता और विकास को लेबल, छवि और विश्लेषण करने के तरीकों का वर्णन करते हैं। आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड ईबीपी-2:: जीएफपी का उपयोग करके, हमने पीएलएम न्यूरॉन में माइक्रोट्यूबुल्स को चित्रित किया, जिसने हमें इस न्यूरॉन24के दो अलग-अलग न्यूराइट्स में माइक्रोट्यूबुल्स की ध्रुवीयता निर्धारित करने की अनुमति दी। यह विधि विभिन्न सेलुलर संदर्भों में माइक्रोट्यूबुले गतिशीलता के उपाय के रूप में ईबीपी धूमकेतु के अवलोकन और मात्राकरण की अनुमति देती है, उदाहरण के लिए, माइक्रोट्यूबुल व्यवहार में स्थानीय परिवर्तन जो एक्सोटॉमी के बाद एक्सोन पुनर्जनन शुरू करते हैं, हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग करके मूल्यांकन किया जा सकता है। इस परख को विविध सेल प्रकारों और आनुवंशिक पृष्ठभूमि में विभिन्न सेलुलर प्रक्रियाओं में माइक्रोट्यूबुल गतिशीलता के नियमन की जांच करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
माइक्रोट्यूबुले गतिशीलता को समझना पिछले कुछ वर्षों में साइटोस्केलेल अनुसंधान के क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण ध्यान केंद्रित किया गया है। माइक्रोट्यूब्यूल्स को नाभिक और तबाही से गुजरना पड़ा और गतिशी?…
The authors have nothing to disclose.
हम प्रारंभिक समर्थन और अध्ययन में इस्तेमाल तनाव के लिए Yishi जिन और एंड्रयू Chisholm शुक्रिया अदा करते हैं । बैक्टीरियल स्ट्रेन OP50 को अनुसंधान बुनियादी ढांचा कार्यक्रमों (P40 OD010440) के एनआईएच कार्यालय द्वारा वित्त पोषित कैनोरहैब्डिटिस जेनेटिक्स सेंटर (सीजीसी) से व्यावसायिक रूप से लाभ उठाया गया था। हम प्रायोगिक प्रक्रियाओं के मानकीकरण के लिए धर्मेंद्र पुरी को भी धन्यवाद देते हैं। अध्ययन राष्ट्रीय मस्तिष्क अनुसंधान केंद्र के कोर अनुदान द्वारा वित्त पोषित है (जैव प्रौद्योगिकी विभाग द्वारा समर्थित, भारत सरकार), डीबीटी/वेलकम ट्रस्ट इंडिया एलायंस अर्ली करियर ग्रांट (ग्रांट# आईए/ई/18/1/504331) एसडी को, वेलकम ट्रस्ट-डीबीटी इंडिया एलायंस इंटरमीडिएट ग्रांट (ग्रांट# आईए/आई/आई/13/1/500874) को ए.जी.आर और साइंस एंड इंजीनियरिंग रिसर्च बोर्ड (एसईआरबी) से ग्रांट: सीआरजी/2019/002194) से एग-आर
CZ18975 worm strain | Yishi Jin lab | CZ18975 | Generated by Anindya Ghosh-Roy |
Agarose | Sigma | A9539 | Mounting worms |
Coverslip (18 mm x 18 mm) | Zeiss | 474030-9010-000 | Mounting worms |
Dry bath with heating block | Neolab | Mounting worms | |
Glass slides (35 mm x 25 mm) | Blue Star | Mounting worms | |
Polystyrene bead solution (4.55 x 10^13 particles/ml in aqueous medium with minimal surfactant) | Polysciences Inc. | 00876 | Mounting worms |
Test tubes | Mounting worms | ||
OP50 bacterial strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | Worm handling |
60mm petri plates | Praveen Scientific | 20440 | Worm handling |
Aspirator/Capillary | VWR | 53432-921 | Worm handling |
Incubator | Panasonic | MIR554E | Worm handling |
Platinum wire | Worm handling | ||
Stereomicroscope with fluorescence attachment | Leica | M165FC | Worm handling |
0.3% Sodium Chloride | Sigma | 71376 | Nematode Growth Medium |
0.25% Peptone | T M Media | 1506 | Nematode Growth Medium |
10mg/mL Cholesterol | Sigma | C8667 | Nematode Growth Medium |
1mM Calcium chloride dihydrate | Sigma | 223506 | Nematode Growth Medium |
1mM Magnesium sulphate heptahydrate | Sigma | M2773 | Nematode Growth Medium |
2% Agar | T M Media | 1202 | Nematode Growth Medium |
25mM Monobasic Potassium dihydrogen phosphate | Sigma | P9791 | Nematode Growth Medium |
0.1M Monobasic Potassium dihydrogen phosphate | Sigma | P9791 | 1X M9 buffer |
0.04M Sodium chloride | Sigma | 71376 | 1X M9 buffer |
0.1M Ammonium chloride | Fisher Scientific | 21405 | 1X M9 buffer |
0.2M Dibasic Disodium hydrogen phosphate heptahydrate | Sigma | S9390 | 1X M9 buffer |
Glass bottles | Borosil | Buffer storage | |
488 nm laser | Zeiss | Imaging | |
5X objective | Zeiss | Imaging | |
63X objective | Zeiss | Imaging | |
Camera | Photometrics | Evolve 512 Delta | Imaging |
Computer system for Spinning Disk unit | HP | Intel ® Xeon CPU E5-2623 3.00GHz | Imaging |
Epifluorescence microscope | Zeiss | Observer.Z1 | Imaging |
Halogen lamp | Zeiss | Imaging | |
Mercury Arc Lamp | Zeiss | Imaging | |
Spinning Disk Unit | Yokogawa | CSU-X1 | Imaging |
ZEN2 software | Zeiss | Imaging | |
Image J (Fiji Version) | Image analysis and processing | ||
Adobe Creative Cloud | Adobe | Image analysis and processing | |
Computer system for Image Analysis | Dell | Intel ® Core ™ i7-9700 CPU 3.00GHz | Image processing/Representation |