Представлен протокол визуализации динамических микротрубочек in vivo с использованием флуоресцентно меченого конечного связывающего белка. Описаны методы маркировки, изображения и анализа динамических микротрубочек в заднем боковом микротрубочке (PLM) нейрона C. elegans.
В нейронах ориентация микротрубочек была ключевым оценщиком для идентификации аксонов, которые имеют плюсовые микротрубочки и дендриты, которые обычно имеют смешанную ориентацию. Здесь описаны методы маркировки, изображения и анализа динамики и роста микротрубочек при развитии и регенерации сенсорных нейронов у C. elegans. Используя генетически закодированные флуоресцентные репортеры кончиков микротрубочек, мы визуалировали аксональные микротрубочки. Локальные изменения в поведении микротрубочек, которые инициируют регенерацию аксонов после аксотомии, могут быть количественно определены с помощью этого протокола. Этот анализ адаптируется к другим нейронам и генетическим фонам для исследования регуляции динамики микротрубочек в различных клеточных процессах.
Нейроны имеют сложную архитектуру со специализированными компартментами, такими как дендриты, клеточные тела, аксоны и синапсы. Нейрональный цитоскелет состоит из микротрубочек, микрофиламентов и нейрофиламентов, и их отчетливая организация поддерживает нейронные компартменты структурно и функционально1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . На протяжении многих лет организация микротрубочек была идентифицирована как ключевой детерминант полярности и функции нейронов. Поскольку нейроны подвергаются структурному ремоделированию во время развития или регенерации, динамика и ориентация микротрубочек определяют идентичность, поляризованный транспорт, рост и развитие различных нейронных компартментов7. Поэтому крайне важно оценить динамику и ориентацию микротрубочек in vivo, чтобы коррелировать с процессом ремоделирования нейронов.
Микротрубочки состоят из протофиламентов гетеродимеров α и β тубулина с динамическими плюс-концами и относительно стабильными минус-концами11,12. Открытие комплекса плюс-наконечника и связанных с ним конечных связывающих белков позволило платформе оценить организацию микротрубочек13. Конечные связывающие белки (EBP) временно связываются с растущими плюс концем микротрубочек и их ассоциативная динамика коррелирует с ростом протофиламентов микротрубочек14,15. Из-за частой ассоциации и диссоциации комплекса плюс наконечника с микротрубочкой функция точечного распространения GFP-помеченного EBP появляется как «комета» в таймлапс-ролике15,16. Начиная с новаторского наблюдения за нейронами млекопитающих16,конечные связывающие белки, помеченные флуоресцентными белками, использовались для определения динамики микротрубочек в различных модельных системах и типах нейронов17,18,19,20,21,22,23.
Благодаря своей простой нервной системе и прозрачному телу, C. elegans зарекомендовал себя как отличная модельная система для изучения ремоделирования нейронов во время развития и регенерации in vivo. Здесь описаны методы маркировки, изображения и анализа динамики и роста микротрубочек при развитии и регенерации сенсорных нейронов у C. elegans. Используя генетически закодированный EBP-2::GFP, мы визуализировали микротрубочки в нейроне PLM, что позволило нам определить полярность микротрубочек в двух разных нейритах этого нейрона24. Этот метод позволяет наблюдать и количественно оценивать кометы EBP как меру динамики микротрубочек в различных клеточных контекстах, например, локальные изменения в поведении микротрубочек, которые инициируют регенерацию аксонов после аксотомии, могут быть оценены с использованием нашего протокола. Этот анализ может быть адаптирован для исследования регуляции динамики микротрубочек в различных клеточных процессах в различных типах клеток и генетическом фоне.
Понимание динамики микротрубочек было ключевым направлением в области исследований цитоскелетов на протяжении многих лет. Микротрубочки претерпевают зародышивание и катастрофу вместе с непрерывным процессом динамической нестабильности44, 45,<sup c…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Иши Джина и Эндрю Чисхолма за первоначальную поддержку и штамм, использованный в исследовании. Бактериальный штамм OP50 был коммерчески использован Центром генетики Caenorhabditis (CGC), финансируемым Управлением исследовательских инфраструктурных программ NIH (P40 OD010440). Мы также благодарим Дхармендру Пури за стандартизацию экспериментальных процедур. Исследование финансируется за счет основного гранта Национального центра исследований мозга (при поддержке Департамента биотехнологии правительства Индии), гранта DBT/Wellcome Trust India Alliance Early Career Grant (грант No IA/E/18/1/504331) S.D., Wellcome Trust-DBT India Alliance Intermediate Grant (грант No IA/I/13/1/500874) для A.G.-R и гранта От Совета по научным и инженерным исследованиям (SERB: CRG/2019/002194) для A.G.-R.
CZ18975 worm strain | Yishi Jin lab | CZ18975 | Generated by Anindya Ghosh-Roy |
Agarose | Sigma | A9539 | Mounting worms |
Coverslip (18 mm x 18 mm) | Zeiss | 474030-9010-000 | Mounting worms |
Dry bath with heating block | Neolab | Mounting worms | |
Glass slides (35 mm x 25 mm) | Blue Star | Mounting worms | |
Polystyrene bead solution (4.55 x 10^13 particles/ml in aqueous medium with minimal surfactant) | Polysciences Inc. | 00876 | Mounting worms |
Test tubes | Mounting worms | ||
OP50 bacterial strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | Worm handling |
60mm petri plates | Praveen Scientific | 20440 | Worm handling |
Aspirator/Capillary | VWR | 53432-921 | Worm handling |
Incubator | Panasonic | MIR554E | Worm handling |
Platinum wire | Worm handling | ||
Stereomicroscope with fluorescence attachment | Leica | M165FC | Worm handling |
0.3% Sodium Chloride | Sigma | 71376 | Nematode Growth Medium |
0.25% Peptone | T M Media | 1506 | Nematode Growth Medium |
10mg/mL Cholesterol | Sigma | C8667 | Nematode Growth Medium |
1mM Calcium chloride dihydrate | Sigma | 223506 | Nematode Growth Medium |
1mM Magnesium sulphate heptahydrate | Sigma | M2773 | Nematode Growth Medium |
2% Agar | T M Media | 1202 | Nematode Growth Medium |
25mM Monobasic Potassium dihydrogen phosphate | Sigma | P9791 | Nematode Growth Medium |
0.1M Monobasic Potassium dihydrogen phosphate | Sigma | P9791 | 1X M9 buffer |
0.04M Sodium chloride | Sigma | 71376 | 1X M9 buffer |
0.1M Ammonium chloride | Fisher Scientific | 21405 | 1X M9 buffer |
0.2M Dibasic Disodium hydrogen phosphate heptahydrate | Sigma | S9390 | 1X M9 buffer |
Glass bottles | Borosil | Buffer storage | |
488 nm laser | Zeiss | Imaging | |
5X objective | Zeiss | Imaging | |
63X objective | Zeiss | Imaging | |
Camera | Photometrics | Evolve 512 Delta | Imaging |
Computer system for Spinning Disk unit | HP | Intel ® Xeon CPU E5-2623 3.00GHz | Imaging |
Epifluorescence microscope | Zeiss | Observer.Z1 | Imaging |
Halogen lamp | Zeiss | Imaging | |
Mercury Arc Lamp | Zeiss | Imaging | |
Spinning Disk Unit | Yokogawa | CSU-X1 | Imaging |
ZEN2 software | Zeiss | Imaging | |
Image J (Fiji Version) | Image analysis and processing | ||
Adobe Creative Cloud | Adobe | Image analysis and processing | |
Computer system for Image Analysis | Dell | Intel ® Core ™ i7-9700 CPU 3.00GHz | Image processing/Representation |