Shuttle Box Assay som et associativt læringsværktøj til kognitiv vurdering i lærings- og hukommelsesstudier ved hjælp af voksne zebrafisk

Summary

Læring og hukommelse er potente målinger i at studere enten udviklings-, sygdomsafhængige, eller miljømæssigt inducerede kognitive funktionsnedsættelser. De fleste kognitive vurderinger kræver specialiseret udstyr og omfattende tidsforpligtelser. Men shuttle box assay er en associativ læring værktøj, der udnytter en konventionel gel boks for hurtig og pålidelig vurdering af voksne zebrafisk kognition.

Abstract

Kognitive underskud, herunder nedsat læring og hukommelse, er et primært symptom på forskellige udviklings- og aldersrelaterede neurodegenerative sygdomme og traumatisk hjerneskade (TBI). Zebrafisk er en vigtig neurovidenskabsmodel på grund af deres gennemsigtighed under udvikling og robuste regenerative evner efter neurotrauma. Mens forskellige kognitive tests findes i zebrafisk, de fleste af de kognitive vurderinger, der er hurtige undersøge ikke-associativ læring. På samme tid, associative-learning assays ofte kræver flere dage eller uger. Her beskriver vi en hurtig associativ læringstest, der udnytter en negativ stimulus (elektrisk stød) og kræver minimal forberedelsestid. Shuttle box assay, præsenteret her, er enkel, ideel til nybegyndere efterforskere, og kræver minimalt udstyr. Vi viser, at denne shuttle box test efter TBI reroducibly vurderer kognitive underskud og genopretning fra unge til gamle zebrafisk. Derudover er analysen kan tilpasses til at undersøge enten øjeblikkelig eller forsinket hukommelse. Vi viser, at både en enkelt TBI og gentagne TBI-hændelser påvirker læring og øjeblikkelig hukommelse negativt, men ikke forsinket hukommelse. Vi konkluderer derfor, at shuttle box assay reproducerer progression og genopretning af kognitiv svækkelse.

Introduction

Læring og hukommelse bruges rutinemæssigt som målinger af kognitiv svækkelse, hvilket sker på grund af aldring, neurodegenerativ sygdom eller skade. Traumatiske hjerneskader (TBIs) er den mest almindelige skade, der resulterer i kognitive underskud. TBIs er af stigende bekymring på grund af deres tilknytning til flere neurodegenerative lidelser, såsom frontotemporal demens og Parkinsons sygdom^1,2. Derudover tyder de øgede beta-amyloidaggregationer observeret hos nogle TBI-patienter på, at det også kan være forbundet med udviklingen af Alzheimers sygdom^3,4. TBIs er ofte resultatet af stump-force traumer og spænder over en række sværhedsgrader⁵, med milde hjerneskader (miTBI) er den mest almindelige. MiTBIs er dog ofte urapporterede og fejldiagnosticeret, fordi de resulterer i mindre kognitive svækkelser i kun en kort periode, og de sårede personer kommer sig normalt fuldt⁶. I modsætning hertil har gentagne miTBI-hændelser været en voksende bekymring, fordi det er meget udbredt hos unge og midaldrende voksne, kan akkumuleres over tid⁷, kan forringe kognitiv udvikling og forværre neurodegenerative sygdomme^1,2,3,4,5 ,^svarendetil personer, der oplever enten en moderat eller alvorlig TBI⁸.

Zebrafisk (Danio rerio) er en nyttig model til at udforske en række emner inden for neurovidenskab, herunder evnen til at regenerere tabte eller beskadigede neuroner i hele centralnervesystemet^{9,10,11,12,13}. Neural regenerering blev også demonstreret i telencephalon, som indeholder archipallium i den dorsale-indre region. Denne neuroanatomiske region svarer til hippocampus og er sandsynligvis nødvendig for kognition i fisk og for den korte tid hukommelse hos mennesker^14,15,16. Desuden har zebrafisk adfærd været omfattende karakteriseret og katalogiseret¹⁷. Læring er blevet undersøgt gennem forskellige teknikker, herunder habituation til forskrækkelse svar¹⁸, som kan repræsentere en hurtig form for ikke-associativ læring, når de udføres i korte blokke og med opmærksomhed på den hurtige henfaldstid¹⁹. Mere komplekse test af associativ læring, såsom T-bokse, plus-labyrinter og visuel diskrimination^20,21 bruges, men ofte er tidskrævende, kræver dage eller ugers forberedelse og er afhængige af stime eller positiv forstærkning. Her beskriver vi et hurtigt paradigme for at vurdere både associativ læring og enten øjeblikkelig eller forsinket hukommelse. Denne shuttle box assay bruger en aversiv stimulus og negativ forstærkning konditionering til at vurdere kognitive underskud og nyttiggørelse efter stump kraft TBI. Vi viser, at ubeskadiget kontrol voksen zebrafisk (8-24 måneder) reproducere lære at undgå rødt lys inden for 20 forsøg (<20 minutters vurdering) i shuttle box, med en høj grad af konsistens på tværs af observatører. Derudover, ved hjælp af shuttle boks vi viser, at læring og hukommelse evner på tværs af voksne (8-24 måneder gamle) er konsekvente og er nyttige til assaying kognition med betydelige funktionsnedsættelser mellem enten forskellige TBI sværhedsgrader eller gentagne TBI. Desuden kan denne metode hurtigt anvendes som en metrik til at spore en bred vifte af sygdomsprogressioner eller effekten af lægemiddelinterventioner, der påvirker vedligeholdelse eller genopretning af kognition hos voksne zebrafisk.

Her giver vi et instruktionsoverblik over en hurtig kognitiv vurdering, der kan undersøge både kompleks associativ læring (afsnit 1) og hukommelse i form af både øjeblikkelig og forsinket hukommelse. Dette paradigme giver en vurdering af den korte og langsigtede hukommelse af en lært associativ kognitiv opgave (afsnit 2).

Protocol

Zebrafisk blev opdrættet og vedligeholdt i Notre Dame Zebrafish facilitet i Freimann Life Sciences Center. De metoder, der er beskrevet i dette manuskript blev godkendt af University of Notre Dame Animal Care and Use Committee (Animal Welfare Assurance Number A3093-01). 1. Shuttle box learning paradigme (Figur 1A) BEMÆRK: Læringsparadigmet giver en hurtig vurdering af kognition med hensyn til associativ læring. Forbered ru…

Representative Results

Læringsparadigmet, der er skitseret i protokollen og skematisk (figur 1), giver en hurtig vurdering af kognition med hensyn til associativ læring. Derudover har dette paradigme et højt niveau af stringens ved at definere læring som en gentagen og konsekvent visning af 5 på hinanden følgende positive forsøg. Dette paradigme gælder også for en række aldre og skader. Ubeskadigede fisk efter 8 måneder (ung voksen), 18 måneder (midaldrende voksen) og 24 måneder (ældre voksne) kræve…

Discussion

Kognitiv svækkelse kan have en betydelig og negativ indvirkning på livskvaliteten. På grund af den øgede synlighed og forekomst af hjernerystelser og traumatiske hjerneskader i hele befolkningen, er det vigtigt at forstå, hvordan de forårsager kognitiv svækkelse, og hvordan skaden kan minimeres eller vendes. Af disse grunde spiller modelorganismer, der kan testes for kognitiv tilbagegang, en afgørende rolle i disse undersøgelser. Gnavere har længe været den primære model til at undersøge neurobehavior og kog…

Materials

Flashlight	Ultrafire	9145
Instant Ocean	Instant Ocean	SS15-10
Large DNA Gel Box	Fisher Scientific	FB-SB-1316	Shuttle Box
Power Supply	Fisher Scientific	FB-105