Summary
למידה וזיכרון הם מדדים חזקים בחקר ליקויים קוגניטיביים התפתחותיים, תלויי מחלות או הנגרמים על ידי הסביבה. רוב ההערכות הקוגניטיביות דורשות ציוד מיוחד והתחייבויות זמן נרחבות. עם זאת, תיבת המעבורת היא כלי למידה אסוציאטיבי המשתמש בתיבת ג'ל קונבנציונלית להערכה מהירה ואמינה של קוגניציה של דגי זברה בוגרים.
Abstract
ליקויים קוגניטיביים, כולל למידה לקויה וזיכרון, הם סימפטום עיקרי למחלות ניווניות התפתחותיות וגיליות שונות ופגיעה מוחית טראומטית (TBI). דגי זברה הם מודל חשוב למדעי המוח בשל השקיפות שלהם במהלך הפיתוח ויכולות התחדשות חזקות בעקבות נוירוטרומה. בעוד שמבחנים קוגניטיביים שונים קיימים בדגי זברה, רוב ההערכות הקוגניטיביות הבוחנות במהירות למידה לא אסוציאטיבית. יחד עם זאת, אסוציאטיבי-למידה אסוציאטיבית לעתים קרובות דורשים מספר ימים או שבועות. כאן, אנו מתארים מבחן אסוציאטיבי-למידה מהיר המשתמש בגירוי שלילי (הלם חשמלי) ודורש זמן הכנה מינימלי. בדיקת תיבת המעבורת, המוצגת כאן, היא פשוטה, אידיאלית לחוקרים מתחילים, ודורשת ציוד מינימלי. אנו מדגימים כי בעקבות TBI, מבחן תיבת מעבורת זה מעריך באופן פורה גירעון קוגניטיבי והתאוששות מדגי זברה צעירים לזקנים. בנוסף, הבחינה מותאמת לבדיקת זיכרון מיידי או מעוכב. אנו מדגימים כי הן TBI יחיד ואירועי TBI חוזרים על עצמם משפיעים לרעה על הלמידה ועל הזיכרון המיידי אך לא על זיכרון מושהה. אנו, אם כן, מסיקים כי תיבת המעבורת מבחן באופן פוריות עוקב אחר ההתקדמות וההתאוששות של פגיעה קוגניטיבית.
Introduction
למידה וזיכרון משמשים באופן שגרתי כמדדים של פגיעה קוגניטיבית, אשר קורה עקב הזדקנות, מחלה ניווניות, או פציעה. פגיעות מוחיות טראומטיות (TBIs) הן הפציעה הנפוצה ביותר שגורמת לגירעונות קוגניטיביים. שחפים הם של דאגה גוברת בגלל הקשר שלהם עם כמה הפרעות ניווניות, כגון דמנציה פרונטוטמפוראלית ומחלת פרקינסון1,2. בנוסף, צבירה מוגברת בטא עמילואיד שנצפו בחלק מחולי TBI מציע כי זה עשוי להיות קשור גם להתפתחות של מחלתאלצהיימר 3,4. שחפים הם לעתים קרובות תוצאה של טראומה קהה כוח משתרעים על פני מגוון של חומרות5, עם פגיעות מוח קלות (miTBI) להיות הנפוץ ביותר. עם זאת, miTBIs לעתים קרובות לא מדווחים ואובחנו לא נכון כי הם גורמים ליקויים קוגניטיביים קלים לתקופה קצרה בלבד, ואת הפצועים בדרך כלל להתאושש באופן מלא6. לעומת זאת, אירועי miTBI חוזרים ונשנים היו דאגה גוברת מכיוון שהיא נפוצה מאוד אצל מבוגרים צעירים ובינוניים, יכולה להצטבר לאורך זמן7, יכול לפגוע בהתפתחות הקוגניטיבית, ולהחמיר מחלות ניווניות1,2,3,4,5, בדומה לאנשים שחווים TBI8בינוני או חמור .
דג זברה(דניו rerio) הוא מודל שימושי לחקר מגוון נושאים במדעי המוח, כולל היכולת לחדש נוירונים אבודים או פגומים ברחבי מערכת העצבים המרכזית9,10,11,12,13. התחדשות עצבית הודגמה גם בטלנספלון, המכיל את הארכיפלג באזור הפנימי-עורי. אזור נוירואנטומי זה מקביל להיפוקמפוס וסביר להניח שהוא נדרש לקוגניציה בדגים ולזיכרון בזמן קצר בבני אדם14,15,16. יתר על כן, התנהגות דגי הזברה התאפיינה בהרחבה וקוטלגה17. למידה נחקרה באמצעות טכניקות שונות, כולל הרגלה לתגובה הבהלה18, אשר יכול לייצג צורה מהירה של למידה לא אסוציאטיבית כאשר מבוצעת בלוקים קצרים עם תשומת לב לזמן הריקבון המהיר19. מבחנים מורכבים יותר של למידה אסוציאטיבית, כגון T-boxes, פלוס מבוכים, ואפליה חזותית20,21 משמשים אך לעתים קרובות הם גוזלים זמן רב, דורשים ימים או שבועות של הכנה, ולהסתמך על shoaling או חיזוק חיובי. כאן, אנו מתארים פרדיגמה מהירה להערכת למידה אסוציאטיבית וזיכרון מיידי או מתעכב. בדיקת תיבת מעבורת זו משתמשת בגירוי מרתיעה והתניה חיזוק שלילית כדי להעריך ליקויים קוגניטיביים והתאוששות בעקבות TBI בוטה כוח. אנו מדגימים כי דגי זברה בוגרים שאינם ניזוקו (8-24 חודשים) לומדים באופן פורה להימנע מהאור האדום בתוך 20 ניסויים (<20 דקות של הערכה) בתיבת המעבורת, עם רמה גבוהה של עקביות על פני משקיפים. בנוסף, באמצעות תיבת המעבורת אנו מדגימים כי יכולות למידה וזיכרון על פני מבוגר (8-24 חודשים) הן עקביות ומועילות לבדיקת קוגניציה עם ליקויים משמעותיים בין חומרות TBI שונות או TBI חוזרות ונשנות. יתר על כן, שיטה זו יכולה להיות מועסקת במהירות כמדד כדי לעקוב אחר מגוון רחב של התקדמות המחלה או יעילות של התערבויות סמים המשפיעות על תחזוקה או התאוששות של קוגניציה בדגי זברה בוגרים.
כאן, אנו מספקים סקירה מנחה של הערכה קוגניטיבית מהירה שיכולה לבחון הן למידה אסוציאטיבית מורכבת (סעיף 1) והן מבחינת זיכרון מעוכב. פרדיגמה זו מספקת הערכה של הזיכרון לטווח קצר וארוך של משימה קוגניטיבית אסוציאטיבית מלומדת (סעיף 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
דגי זברה גדלו והתוחזקו במתקן דגי הזברה של נוטרדאם במרכז פריימן למדעי החיים. השיטות המתוארות בכתב יד זה אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת נוטרדאם (מספר הבטחת רווחת בעלי חיים A3093-01).
1. פרדיגמת לימוד תיבת הסעות (איור 1A)
הערה: פרדיגמת הלמידה מספקת הערכה מהירה של קוגניציה לגבי למידה אסוציאטיבית.
- הכן את תיבת המעבורת על ידי שינוי תיבת ג'ל 30.5 x 19 x 7.5 ס"מ עם חתיכה 5 x 19 ס"מ של פרספקס כיתה אקווריום הוסיף לכל צד בזווית של 45 °. הפוך קו המסמן את נקודת האמצע של הטנק כדי להעריך מתי דגים חצו את אמצע הטנק(איור 1B).
- הוסף 800 מ"ל של מי מערכת לתיבת המעבורת. הפוך את המים האלה על ידי המסת 60 מ"ג של אוקיינוס מיידי ב 1 ליטר של מי RO deionized. ממלאים את המים עד אמצע המיכל לעומק של 5 ס"מ.
הערה: החלף במים של המערכת המתוקה במהירות של 28 °C (73 °F) כל שעה או לאחר בדיקת 3 דגים. - מניחים 2-3 דגים לתוך מיכל אחזקה המכיל מי מערכת, הממוקם בחדר חשוך שבו תתבצע בדיקת תיבת המעבורת.
- בחדר החשוך, הניחו דג אחד במרכז תיבת המעבורת, אבטחו את המכסה וחברו את האלקטרודות לאספקת חשמל.
הערה: החדר צריך להישאר חשוך ככל האפשר במהלך התאקלות ובדיקה.
- בחדר החשוך, הניחו דג אחד במרכז תיבת המעבורת, אבטחו את המכסה וחברו את האלקטרודות לאספקת חשמל.
- התאקלם הדגים בתיבת המעבורת במשך 15 דקות.
הערה: החוקר צריך להישאר בחדר במהלך תקופת ההתאקלמות או לחזור לחדר הבדיקות בשקט עם מספיק זמן לפני הבדיקה כדי לאפשר לדגים להסתגל לנוכחות החוקר. התאקלמות מוצלחת יכולה להיחשב כאשר הדג בחופשיות חוקר את הטנק.- אם הדג לא מצליח לחקור, המשך בהסתגלות למשך 15 דקות נוספות. אם הדג עדיין לא מצליח להתאקלם לתיבת המעבורת, הסר את הדג. אין להשתמש בדגים אלה לבדיקה.
- הברק ידנית פנס עדשה אדומה 800 לומן ~ 2 ס"מ מקיר תיבת הג'ל בצד הכבוש על ידי הדג, לאחר הסתגלות.
הערה: אל תתחילו ניסוי אם הדג נח ליד חוט הפלטינה על הקיר ליד הקצוות העמוקים של תיבת המעבורת. - האיר את גירוי האור ישירות על הדג ועקוב ידנית אחר כל תנועה לרוחב של הדג עם האור כדי להבטיח הדמיה מתמשכת של הגירוי (איור 1C). המשך לספק את גירוי האור עד אחד מהתנאים הבאים מתקיימים.
- שקול את השביל מוצלח אם הדג חוצה את נקודת האמצע של הטנק בתוך 15 שניות של חשיפה לאור. ברגע שהדגים חוצים את נקודת האמצע, עצרו מיד את גירוי האור(איור 1D).
- שקול את השביל ככושל אם הדג לא חוצה את נקודת האמצע של התיבה ב 15 s. במקרה זה, השתמש באספקת כוח אלקטרופורזיס כדי להחיל גירוי הלם שלילי (20 mV:1 A) לסירוגין 2 s של On, 2 s off לתקופה של 15 s (מקסימום של 4 זעזועים), או עד שהדגים עוברים את נקודת אמצע הדרך של התיבה, ובשלב זה לסיים הן את האור ואת הגירוי השלילי.
- תן לדגים לנוח במשך 30 s ולחזור על שלבים 1.5-1.6.2. שמור תיעוד מפורט של סדר הניסויים המוצלחים (1.6.1) וניסויים כושלים (1.6.2).
הערה: כאן, הגדרנו את הלמידה כהשלמה של 5 ניסויים מוצלחים רצופים. לאחר שהלמידה הוכחה, יש להסיר את הדגים מתיבת המעבורת ולהמיתו באופן אנושי.
2. פרדיגמת זיכרון (איור 1A)
הערה: פרדיגמה זו מספקת הערכה של הזיכרון לטווח קצר וארוך של משימה קוגניטיבית אסוציאטיבית מלומדת.
- תקופת אימון
- הוסף 800 מ"ל של מי מערכת לתיבת המעבורת. הפוך את המים האלה על ידי המסת 60 מ"ג של אוקיינוס מיידי ב 1 ליטר של מי RO deionized. ממלאים את המים עד אמצע המיכל לעומק של 5 ס"מ.
הערה: מים צריכים להיות מוחלפים עם מים במערכת המתוקה ב 28 °C (75 °F) כל שעה או לאחר בדיקת 3 דגים. - מניחים 2-3 דגים במיכל אחזקה המכיל מי מערכת, הממוקם בחדר חשוך שבו תתבצע בדיקת תיבת המעבורת.
- בחדר החשוך, הניחו דג אחד במרכז תיבת המעבורת, אבטחו את המכסה וחברו את האלקטרודות לאספקת חשמל.
הערה: החדר צריך להישאר חשוך ככל האפשר במהלך התאקלות ובדיקה. - דגים מתאקלם בתיבת המעבורת במשך 15 דקות.
הערה: החוקר צריך להישאר בחדר במהלך תקופת ההסתגלות או לחזור לחדר הבדיקות בשקט עם מספיק זמן לפני הבדיקה כדי לאפשר לדגים להסתגל לנוכחות החוקר. קבעו התאקלמה מוצלחת כאשר הדגים חוקרים בחופשיות את הטנק. - אם הדג לא מצליח לחקור, המשך בהסתגלות למשך 15 דקות נוספות. אם הדג עדיין לא מצליח להתאקלם לתיבת המעבורת, הסר את הדגים ואל תשתמש בו לבדיקה.
- לאחר ההתאקלמות המוצלחת, הדליקו ידנית פנס עדשה אדומה 800 לומן ~ 2 ס"מ מהקיר הצדדי של תיבת הג'ל, בצד תיבת המעבורת הכבושה על ידי הדגים.
- האיר את גירוי האור ישירות על הדג ועקוב אחר כל תנועה לרוחב של הדג עם האור כדי להבטיח הדמיה מתמשכת של הגירוי על ידי הדג.
- בעוד האור זורח על הדג, בו זמנית להחיל את גירוי ההלם השלילי (20 mV:1 A) לסירוגין 2 s On, 2 s Off עבור 15 s (מקסימום של 4 זעזועים), או עד הדג עובר את נקודת האמצע של התיבה. ברגע שזה מושג, לסיים הן את האור ואת הגירוי השלילי.
הערה: אפשר לדג לנוח במשך 30 s ואז לחזור על שלב 2.1.6-2.1.8 עבור 25 איטרציות(איור 1A).
- הוסף 800 מ"ל של מי מערכת לתיבת המעבורת. הפוך את המים האלה על ידי המסת 60 מ"ג של אוקיינוס מיידי ב 1 ליטר של מי RO deionized. ממלאים את המים עד אמצע המיכל לעומק של 5 ס"מ.
- בדיקה ראשונית
- אפשר 15 דקות מנוחה לדגים לאחר תקופת האימון. אל תסיר אותם מתיבת המעבורת. בדוק את שימור הזיכרון הראשוני על-ידי הקלטת כל ניסיון כ- pass/fail בקפדנות, מיד לאחר תקופת מנוחה זו.
- החל רק את גירוי האור עבור עד 15 s ולתעד את התגובות כדלקמן.
- שקול את הניסוי מוצלח אם הדג חוצה את נקודת האמצע של תיבת המעבורת בתוך 15 s לאחר תחילת גירוי האור. עצור את גירוי האור מיד כאשר הדג חוצה את נקודת אמצע הדרך.
- שקול את הניסוי ככושל אם הדג אינו חוצה את נקודת האמצע של תיבת המעבורת 15 s לאחר תחילת גירוי האור. עצור את גירוי האור לאחר 15 s.
הערה: במהלך הבדיקה הראשונית, גירוי שלילי אינו מוחל בעקבות ניסיון כושל.
- חזור על שלב 2.2.2, עם תקופת מנוחה של 30 שנה בין ניסויים, ורשום ניסויים מוצלחים (2.2.2.1) וניסויים כושלים (2.2.2.2) ב-25 ניסויים. ערך זה ישמש התייחסות אישית לכל דג.
- זיכרון מיידי
- לגרום לפציעה מיד לאחר תקופת הבדיקה הראשונית על ידי פרדיגמת נזק מועדפת (למשל, טראומה קהה באמצעות ירידה במשקל מרמרו שונה). דגי בית בנפרד לזיהוי קל. תיעדו את ערכי הבדיקה הראשוניים שלהם והחזירו דגים למתקן החיות.
הערה: דגים נפצעו על ידי TBI קהה כוח כפי שתואר בעבר22. - יש לאסוף 2-3 דגי TBI שלא ניזוקו או TBI 4 שעות לאחר בדיקה ראשונית ו/או 4 שעות לאחר הפציעה (או במסגרת הזמן הניסיונית המדוברת) ממתקן בעלי החיים. שמור את כל הדגים בחדר החשוך במיכלים בודדים המכילים מי מערכת.
- מניחים דגים במרכז תיבת המעבורת (מוכנים עם מי מערכת כמתואר ב-1.1), דג אחד בכל פעם, ומאבטחים את המכסה. חבר את אספקת החשמל ואפשר לדגים להתאקלם במשך 15 דקות.
- לאחר הסתגלות, להעריך זיכרון מיידי (בקפדנות לעבור / להיכשל) על ידי החלת גירוי האור רק עבור עד 15 s ולתעד את התגובות כדלקמן.
- שקול את הניסוי מוצלח אם הדג חוצה את נקודת האמצע של התיבה בתוך תקופת הבדיקה של 15. לסיים את גירוי האור בעת חציית נקודת אמצע הדרך.
- שקול את הניסוי ככושל אם הדג אינו חוצה את נקודת האמצע של התיבה בתוך 15 s של תחילת גירוי האור. לסיים את גירוי האור לאחר 15 s תקופה נגמרה.
הערה: במהלך בדיקה זו לאחר פציעה, גירוי הלם שלילי אינו מיושם בעקבות ניסיון כושל.
- חזור על שלב 2.3.4, עם תקופת מנוחה של 30 שנה בין ניסויים, ורשום את מספר הניסויים המוצלחים (2.3.4.1) וניסויים כושלים (2.3.4.2) ב- 25 ניסויים.
- חשב את ההפרש באחוזים בניסויים מוצלחים לאחר הפגיעה לתקופת הבדיקה הראשונית באמצעות המשוואה:
- לגרום לפציעה מיד לאחר תקופת הבדיקה הראשונית על ידי פרדיגמת נזק מועדפת (למשל, טראומה קהה באמצעות ירידה במשקל מרמרו שונה). דגי בית בנפרד לזיהוי קל. תיעדו את ערכי הבדיקה הראשוניים שלהם והחזירו דגים למתקן החיות.
- זיכרון מושהה
- החזירו דגים, ששוכנו בנפרד לזיהוי קל והקלטה של ערכי הבדיקה הראשוניים שלהם, למתקן בעלי החיים מיד לאחר תקופת הבדיקה הראשונית.
- אפשר לדגים 4 ימים (או מסגרת הזמן הניסיונית המדוברת) בין הבדיקה הראשונית לפציעה ו/או בדיקת זיכרון מאוחרת.
- לגרום לפציעה על ידי פרדיגמת הנזק המועדפת (כגון ירידת המשקל מרמרו שונה כדי לגרום לטראומה קהה כוח). דגי בית בנפרד לזיהוי קל של ערכי הבדיקה הראשוניים, והחזרת דגים למתקן בעלי החיים.
הערה: דגים נפצעו על ידי TBI קהה כוח כפי שתואר בעבר22. - יש לאסוף 2-3 דגי TBI שלא ניזוקו או TBI 4 שעות לאחר בדיקה ראשונית ו/או 4 שעות לאחר הפציעה (או במסגרת הזמן הניסיונית המדוברת) ממתקן בעלי החיים.
- שמור את כל הדגים בחדר החשוך במיכלים בודדים המכילים מי מערכת, והנח אותו אחר זה במרכז תיבת המעבורת (מוכן עם מי מערכת כמתואר ב -1.1), לאבטח את המכסה, לחבר את אספקת החשמל, ולאפשר לדגים 15 דקות להתאקלם.
- לאחר הסתגלות, להעריך זיכרון מיידי (בקפדנות לעבור / להיכשל) על ידי החלת גירוי האור רק עבור עד 15 s ולתעד את התגובות הבאות:
- שקול את השביל מוצלח אם הדג חוצה את נקודת האמצע של התיבה בתוך תקופת הבדיקה של 15. לסיים את גירוי האור בעת חציית נקודת אמצע הדרך.
- שקול את השביל ככושל אם הדג לא חוצה את נקודת אמצע הדרך של התיבה בתוך 15 s של תחילת גירוי האור, לסיים את גירוי האור.
הערה: במהלך בדיקה זו לאחר פציעה, גירוי הלם שלילי אינו מוחל בעקבות ניסיון כושל.
- חזור על שלב 2.4.6, עם תקופת מנוחה של 30 שנה בין ניסויים, ורשום את מספר הניסויים המוצלחים (2.4.6.1) וניסויים כושלים (2.4.6.2) ב-25 ניסויים.
- חשב את ההבדל באחוזים בניסויים מוצלחים של לאחר פגיעה לתקופת הבדיקה הראשונית עם המשוואה:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרדיגמת הלמידה, המתוארת בפרוטוקול וסכמטי (איור 1), מספקת הערכה מהירה של קוגניציה ביחס ללמידה אסוציאטיבית. בנוסף, פרדיגמה זו יש רמה גבוהה של מחרוזות, על ידי הגדרת הלמידה כתצוגה חוזרת ועקבית של 5 ניסויים חיוביים רצופים. פרדיגמה זו חלה גם על מגוון גילאים ופציעות. דגים שלא ניזוקו בגיל 8 חודשים (מבוגר צעיר), 18 חודשים (מבוגר בגיל העמידה) ו -24 חודשים (מבוגר מבוגר) נדרשו למספר דומה של ניסויים כדי ללמוד את ההתנהגות של הימנעות מהאור האדום (לא ניזוק 8 מ ': 15.28 ± 4.92 ניסויים, 18 מ': 17.66 ± 5.5 ניסויים, 24 מ': 16.2 ± 4.79 ניסויים, 8 מ' לעומת 18 מ' p =0.92, 8 מ' לעומת 24 מ' p =0.98, 18 מ' לעומת 24 מ' p=0.97, איור 2A). השתמשנו גם בפגיעה מוחית טראומטית חמורה (sTBI) מודל22 וצפינו שדגים בגילאים שונים דורשים מספר דומה של ניסויים כדי לשלוט במבחן על פני 1-5 ימים לאחר פציעה (dpi; 8 מ' לעומת 18 מ', p=0.09, 8 מ' לעומת 24 מ', p = 0.96, 18 מ ' לעומת 24 מ ', p = 0.12, איור 2A). ביום 1 בעקבות sTBI, דגים בכל הגילאים (8, 18, ו 24 מ ') נדרש מספר דומה של ניסויים כדי ללמוד את ההתנהגות (8 מ ': 73.3 ± 9.45 ניסויים, 18 מ ': 79.33 ± 6.35 ניסויים, 24 מ ': 68.25 ± 6.65 ניסויים, 8 מ 'לעומת 18 מ 'p = 0.71, 8 מ 'לעומת 24 מ 'p = 0.76, 18 מ 'לעומת 24 מ 'p =0.28, איור 2א) וכולם היו גדולים משמעותית מהבקרות שלא ניזוקו (עמ<0.01). באופן קולקטיבי, נתונים אלה מראים כי תיבת המעבורת יכולה להיות מנוצלת כדי לבחון ליקויים קוגניטיביים הנגרמים על ידי פציעות על פני טווחי גיל ומציעים כי דגי זברה בוגרים יכולים להתאושש קוגניטיבית לאחר פגיעה בוטה בכוח.
מכיוון שאירועי miTBI חוזרים ונשנים עלולים לפגוע יותר ויותר בתפקוד הקוגניטיבי, השתמשנו ב- assay תיבת המעבורת כמדד כדי לעקוב אחר התקדמות תלוית מינון באמצעות TBI חוזרת ונשנית. השתמשנו בבדק הזה כדי להעריך את הלמידה בעקבות פגיעה בוטה של miTBI22 שחוזרת על עצמה מדי יום לפרקי זמן שונים. כפי שנצפה בעבר, דגים שלא ניזוקו שולטים במהירות בתיבת המעבורת והשיגו 5 ניסויים חיוביים רצופים ב-16.4 ± 3.5 ניסויים(איור 2B). יום אחד לאחר miTBI יחיד, דגים מציגים עלייה משמעותית במספר הניסויים כדי ללמוד את ההתנהגות (40.25 ± 12.65 ניסויים, p<0.05, איור 2B). גירעון זה גדל לאחר 2 אירועי miTBI (48 ± 14.9 ניסויים) והוא הועלה עוד יותר לאחר 3 פציעות miTBI (56.63 ± 12.75 ניסויים, איור 2B). בנוסף, ראינו עלייה משמעותית בליקוי קוגניטיבי בין דג miTBI שקיבל פגיעה ייחודית לבין 3 פציעות (עמ<0.05).
בדקנו גם כיצד הושפע הזיכרון בעקבות אירועי miTBI חוזרים ונשנים באמצעות הפרוטוקול לפרדיגמות זיכרון מיידיות ומושהות(איור 1A). דגים תמימים שלא ניזוקו קיבלו תקופת אימונים ותקופת בדיקה ראשונית, שלאחריה חלק מהדגים נפצעו לזיכרון מיידי ואחרים הוחזרו למתקן הדגים למשך 4 ימים כדי לגשת לזיכרון מאוחר(איור 2C). דגים שלא ניזוקו מציגים עלייה קלה בהפרש האחוזים של ניסויים מוצלחים הן בזיכרון המיידי (6.22% ± 4.7%) והן בזיכרון מושהה (6.13% ± 5.57%) ביחס לתקופת הבדיקה הראשונית. לאחר מכן בדקנו את ההשפעה של אירועי TBI מרובים בוטה על הזיכרון. ליקויים משמעותיים נצפו בעקבות miTBI בזיכרון מיידי, אך לא בזיכרון מתעכב. בעקבות miTBI יחיד, דגים הציגו ליקויי זיכרון מיידיים משמעותיים (-26.77% ± 8.93%) לעומת דגים שלא ניזוקו (p<0.0001, איור 2C). מגמה זו נמשכה עם פציעה חוזרת ונשנית עם גירעונות הולכים וגדלים לאחר 2x miTBI (-37.42% ± 10.01%) ו 3x miTBI (-39.71% ± 11.39%). יתר על כן, ראינו מינון דומה-אפקט בין דגים שטופלו עם miTBI יחיד (1x) ו 3x miTBI (p<0.05, איור 2C). נתונים אלה מצביעים על כך שהלמידה והזיכרון מצטמצמים בדגי miTBI עם המספר ההולך וגדל של פציעות, מה שמגדיל באופן משמעותי את הגירעון ואת בדיקת תיבת המעבורת והפרוטוקולים שתוארו לעיל רגישים מספיק כדי לזהות הבדלים אלה.
איור 1:תיבת המעבורת אסאי. (א)סקירה מנחה של פרדיגמות הלמידה והזיכרון להערכה קוגניטיבית. (B)שרטוט של קופסת ג'ל DNA גדולה שהוסבה לבדיקת תיבת המעבורת. (C,D) ייצוג גרפי של יישום גירויים במהלך ניסויים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: דגי זברה מציגים ליקויים קוגניטיביים בעקבות TBI בוטה. (A) בעקבות sTBI, דגי זברה בגיל 8, 18 ו -24 חודשים מציגים ליקויי למידה שאינם שונים באופן משמעותי בין קבוצות גיל. עלייה משמעותית במספר הניסויים כדי ללמוד את פרדיגמת תיבת המעבורת בהשוואה לבקרות תואמות גיל נצפו ב 1 dpi חוזר לרמות שלא ניזוקו על ידי 4-5 dpi. (B,C) דגי miTBI חוזרים הציגו הן למידה (B) והן זיכרון (C) ליקויים באופן תלוי מינון. המשמעות ± SEM מתוותת ב- A ו- B, בעוד סטיית התקן ± הממוצעת מתוותת ב- C. כל נקודת נתונים על כל שלושת הגרפים מייצגת דג זברה בוגר יחיד. ניתוחים סטטיסטיים בוצעו עם ANOVA חד-כיווני או דו-כיווני ואחריו מבחן טוקי לאחר הוק. # p<0.05, ## p<0.01. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פגיעה קוגניטיבית יכולה להשפיע באופן משמעותי ושלילי על איכות החיים. בשל הנראות המוגברת וההתרחשות של זעזועי מוח ופגיעות מוחיות טראומטיות בכל האוכלוסייה, חשוב להבין כיצד הם גורמים לפגיעה קוגניטיבית וכיצד ניתן למזער או להפוך את הנזק. מסיבות אלה, מודל אורגניזמים שניתן לבדוק עבור ירידה קוגניטיבית לשחק תפקיד קריטי במחקרים אלה. מכרסמים כבר זמן רב המודל העיקרי לחקור neurobehavior וקוגניציה, עם זאת, דגי זברה הופיעו כמודל שימושי עם התנהגויות שונות רבות לחקור מגוון של התפתחויות, הקשורות לגיל, ורכשו גירעונות קוגניטיביים17,20,23,24,25,26. שיטות שונות להערכת קוגניציה נוצלו מלמידה חד ממדית בצורה של הרגלה, ללמידה מורכבת וזיכרון מרחבי, זיהוי אובייקטים ומיקום חדשניים, וקבלת החלטות18,19,20,21,27,28. עם זאת, מבחנים קוגניטיביים אלה מוגבלים לבדיקת קוגניציה לא אסוציאטיבית או דורשים הקמה מורכבת, השקעה כספית בציוד, או התחייבות זמן נרחבת לפני שניתן לבצע בדיקות. לעומת זאת, תיבת המעבורת ופרדיגמות הלמידה והזיכרון המתוארות כאן משתמשות בבחינת למידה אסוציאטיבית מורכבת חסכונית, מוערכת במהירות ומועסקת בקלות על ידי חוקר טירון. והכי חשוב, עולה בקנה אחד עם המבחנים הקוגניטיביים האחרים, הבדיקה שלנו מדגימה כי דגים לא ניזוקו לומדים במהירות את המשימה האסוציאטיבית ויכולים לזכור את המשימה ימים לאחר מכן ללא אימון לסירוגין29.
הסתגלות הבדיקה מספקת אפיקים לחקור נקודות זמן שונות של למידה וזיכרון כמדד של התקדמות המחלה או התערבויות מכניות. ישנן שתי תכונות עיקריות של ההסתה. ראשית, השיטה פשוטה. הבחינה מוגדרת במהירות ויש לה נקודות סיום ברורות ומובחנות ביחס לניסויים מוצלחים וכושלים, מה שהופך אותה נגישה למגוון חוקרים. מצאנו שבגלל הפשטות של ההסתה הזו, יש מעט מאוד פתרון בעיות הדרוש כדי להשתמש בתיבת המעבורת בהצלחה. שנית, הבדיקה מהירה מאוד בהשוואה למבחנים קוגניטיביים אחרים, המספקים גמישות או את היכולת לבחון מספר גדול של דגים במהירות ביום אחד. הזמן להעריך את הלמידה הוא לפחות 19.75 דקות(איור 1),כאשר הדגים דורשים 15 דקות כדי להתאקלם לתיבת המעבורת (שנקבעה על ידי חקר טנקים), ואחריו ניסוי כושל אחד (גירוי קל של 15, 15 s סלידה מגירוי, 30 s בין ניסויים) ו -5 ניסויים חיוביים מיידיים רצופים (גירוי קל של <15). בפועל, ראינו כי דגים שלא ניזוקו דורשים 6-30 ניסויים (19.75 דקות-43.75 דקות), בעוד שבמקרים קיצוניים (בעקבות טראומה חמורה של כוח קהה), הגירעונות החמורים ביותר יכולים לדרוש 100 ניסויים (113.75 דקות). מחקרי זיכרון מבוצעים גם במהירות. בעקבות מתווה הפרוטוקול, הזמן המינימלי הדרוש להתאקלמות, אימון ובדיקה ראשונית הוא 67.5 דקות (15 דקות התאקלות, 25 איטרציות של אור והלם עבור 15 s, 30 s מנוחה בין ניסויים, ולחזור על הבדיקות הראשוניות ללא גירויים שליליים). בעוד בדיקה חוזרת של זיכרון מיידי או מעוכב דורשת רק 33.75 דקות (15 דקות התאקלמות, 25 איטרציות של גירוי אור בלבד עבור 15 s, ו 30 s מנוחה בין ניסויים), ללא קשר לפציעה, טיפול, או גירעון קוגניטיבי.
בעת הערכת neurobehavior, פרדיגמות שונות לנצל גירויים חיוביים או שליליים. גירויים חיוביים בצורה של מזון או אינטראקציה חברתית, המשמשים לעתים קרובות במבוכים T-box קלאסיים, יכול לסייע בתגובה חזקה של משימה למדה. עם זאת, בדיקות המשתמשות בהתאגדות חיובית עושות זאת על חשבון הזמן. לעומת זאת, בעוד התניה בתגובה לגירוי שלילי מספקת אסוציאציה מהירה ותגובה התנהגותית חזקה, זה על חשבון הגירוי השלילי. דגים שלא ניזוקו לומדים לעתים קרובות את תיבת המעבורת נבדקים במהירות ולכן הם נתונים למספר מינימלי של זעזועים, וכתוצאה מכך נראה שאין תופעות לוואי. עם זאת, דגים נפגעים נוירולוגית (TBI), עם ליקויים קוגניטיביים חמורים, דורשים מספר משמעותי של ניסויים וזעזועים חשמליים. זעזועים מרובים אלה נצפו מדי פעם לגרום התקפי טוניק-קלוני. כל דג חווה התקף טוניק-קלוני בעוד בתוך תיבת המעבורת צריך להיות מוסר מיד ולהמית מבחינה אתית. כל הניסויים עבור הדגים המתחסדים, עד וכולל אירוע התפיסה, יש להחריג בכל ניתוח סטטיסטי. יתר על כן, ראוי לציין כי הלם חשמלי לנבדק שניזוק נוירולוגית עלול לכפות הבדלים לא מכוונים בין דגים פגומים שאינם נובעים מתיבת המעבורת. מסיבה זו, אנו מציעים כל הדגים הנבדקים להערכת neurobehavior לא צריך לשמש עבור כל מדד כמותי אחר (סם ביולוגי בסרום, IHC, וכו '). חשוב גם להבין כי שיטת למידה זו מבוססת על גירוי חזותי ואינה מתאימה לנזק שעלול לסכן מעגלים חזותיים, שכן היא תבלבל את התוצאות.
התוצאות שלנו מראות כי בעקבות TBI בוטה כוח, דגי זברה להפגין גירעון קוגניטיבי מהיר וכתוצאה מכך ניסויים מוגברים לשלוט במשימה אסוציאטיבית במבחן תיבת המעבורת. גירעונות מיידיים דומים נראים במודלים מכרסמים של TBI, אולם גירעונות אלה יכולים להצטמצם, הם לעתים קרובות נמשכים ונשאריםמשמעותיים 30. לעומת זאת, דגי זברה מציגים התאוששות קוגניטיבית תוך 7 ימים לאחר הפציעה. היכולת המתחדשת של דג הזברה הבוגר מתועדת היטב9,10,11,12,13,14,15, עם נישות נוירוגניות ידועות באזורים חדריים / תת חדריים של טלנספלון31,32. ההתאוששות הקוגניטיבית שנצפתה בבדיקה שלנו בעקבות TBI מספקת תובנה למבחנים הדרושים כדי לזהות אם נישות נוירוגניות אלה מגורות ולשחק תפקיד ברקמות והתאוששות קוגניטיבית.
לסיכום, תיבת המעבורת מספקת הערכה מהירה של קוגניציה לגבי למידה אסוציאטיבית וזיכרון. ההסתה משתמשת בציוד מינימלי ומנזרי והיא פשוטה מבחינה טכנית. ניתן להשתמש ביישומים עתידיים כדי להעריך התערבויות גנטיות ופרמקולוגיות לדגים נעלבים נוירולוגית לגבי הגנת נוירו, כמו גם פרדיגמות פציעה אחרות או מודלים ניווניות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות לחברי המעבדה של הייד על הדיונים המהורהרים שלהם ולטכנאי המרכז למדעי החיים של פריימן על טיפול וגידוד דגי זברה. עבודה זו נתמכה על ידי המרכז לחקר דגי זברה באוניברסיטת נוטרדאם, המרכז לתאי גזע ורפואה רגנרטיבית באוניברסיטת נוטרדאם, ומענקים ממכון העיניים הלאומי של NIH R01-EY018417 (DRH), תוכנית מלגת המחקר לתואר שני של הקרן הלאומית למדע (JTH), מלגת LTC ניל היילנד מנוטרדאם (JTH), זקיפים של מלגת חופש (JTH) ומלגת פט טילמן (JTH). איור 1 שנעשה עם BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flashlight | Ultrafire | 9145 | |
| Instant Ocean | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Large DNA Gel Box | Fisher Scientific | FB-SB-1316 | Shuttle Box |
| Power Supply | Fisher Scientific | FB-105 |
References
- Deutsch, M., Mendez, M., Teng, E. Interactions between traumatic brain injury and frontotemporal degeneration. Dementia and Geriatric Cognitive Disorders. 39, 143-153 (2015).
- Gardner, R., et al. Traumatic brain injury in later life increases risk for Parkinson disease. Annals in Neurology. 77, 987 (2015).
- Fleminger, S., Oliver, D., Lovestone, S., Rabe-Hesketh, S., Giora, A. Head injury as a risk factor for Alzheimer's disease: the evidence 10 years on; a partial replication. Journal of Neurology, Neurosurgery and Psychiatry. 74, 857-886 (2003).
- Johnson, V., Stewart, W., Smith, D. Traumatic brain injury and amyloid-β pathology: a link to Alzheimer's disease. Nature Reviews Neurosciences. 11, 361-370 (2010).
- Korley, F. K., Kelen, G. D., Jones, C. M., Diaz-Arrastia, R. Emergency department evaluation of traumatic brain injury in the United States, 2009-2010. The Journal of Head Trauma Rehabilitation. 31, 379-387 (2016).
- Corrigan, J. D., Selassie, A. W., Orman, J. A. L.
- Levin, H., Arrastia, R. Diagnosis, prognosis, and clinical management of mild traumatic brain injury. The Lancet Neurology. 14, 506-517 (2015).
- GBD 2016 Traumatic Brain Injury and Spinal Cord Injury Collaborators. Global, regional, and national burden of traumatic brain injury and spinal cord injury, 1990-2016: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet, Neurology. 18 (1), 56-87 (2019).
- Campbell, L. J., et al. Notch3 and DeltaB maintain Müller glia quiescence and act as negative regulators of regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Glia. 69 (3), 546-566 (2021).
- Green, L. A., Nebiolo, J. C., Smith, C. J. Microglia exit the CNS in spinal root avulsion. PLoS Biology. 17 (2), 3000159 (2019).
- Hentig, J., Byrd-Jacobs, C. Exposure to zinc sulfate results in differential effects on olfactory sensory neuron subtypes in the adult zebrafish. International Journal of Molecular Sciences. 17 (9), 1445 (2016).
- Ito, Y., Tanaka, H., Okamoto, H., Oshima, T. Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum. Developmental Biology. 342, 26-38 (2010).
- Lahne, M., Nagashima, M., Hyde, D. R., Hitchcock, P. F. Reprogramming Muller glia to regenerate retinal neurons. Annual Reviews of Vision Sciences. 6, 171-193 (2020).
- Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), Cambridge, England. 4831-4841 (2011).
- Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Disease Models & Mechanisms. 5 (2), 200-209 (2012).
- Bhattarai, P., et al. Neuron-glia interaction through Serotonin-BDNF-NGFR axis enables regenerative neurogenesis in Alzheimer's model of adult zebrafish brain. PLoS Biology. 18 (1), 3000585 (2020).
- Kalueff, A., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).
- Chanin, S., et al. Assessing startle responses and their habituation in adult zebrafish. Zebrafish Protocols for Neurobehavioral Research. 66, Humana Press. (2012).
- López-Schier, H. Neuroplasticity in the acoustic startle reflex in larval zebrafish. Current Opinion in Neurobiology. 54, 134-139 (2019).
- Maheras, A. L., et al. Genetic pathways of neuroregeneration in a novel mild traumatic brain injury model in adult zebrafish. eNeuro. 5 (1), (2018).
- Gaspary, K. V., Reolon, G. K., Gusso, D., Bonan, C. D. Novel object recognition and object location tasks in zebrafish: Influence of habituation and NMDA receptor antagonism. Neurobiology of Learning and Memory. 155, 249-260 (2018).
- Hentig, J., Cloghessy, K., Dunseath, C., Hyde, D. R. A scalable model to study the effects of blunt-force injury in adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. , (2021).
- Wu, Y. J., et al. Fragile X mental retardation-1 knockout zebrafish shows precocious development in social behavior. Zebrafish. 14 (5), 438-443 (2017).
- Rea, V., Van Raay, T. J. Using zebrafish to model autism spectrum disorder: A Comparison of ASD risk genes between zebrafish and their mammalian counterparts. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 575575 (2020).
- Zhdanova, I. V., et al. Aging of the circadian system in zebrafish and the effects of melatonin on sleep and cognitive performance. Brain Research Bulletin. 75 (2-4), 433-441 (2008).
- Yu, L., Tucci, V., Kishi, S., Zhdanova, I. V.
- Bahl, A., Engert, F. Neural circuits for evidence accumulation and decision making in larval zebrafish. Nature Neuroscience. 23 (1), 94-102 (2020).
- Ngoc Hieu, B. T., et al. Development of a modified three-day t-maze protocol for evaluating learning and memory capacity of adult zebrafish. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1464 (2020).
- Williams, F. E., White, D., Messer, W. S. A simple spatial alternation task for assessing memory function in zebrafish. Behavioural Processes. 58 (3), 125-132 (2002).
- Zohar, O., et al. Closed-head minimal traumatic brain injury produces long-term cognitive deficits in mice. Neuroscience. 118 (4), 949-955 (2003).
- Becker, C., Becker, T. Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration. Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).
- Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration, and cell fate. Developmental Biology. 295 (1), 263-277 (2006).
