Rask, rimelig og ukomplisert produksjon av bakteriell cellefri lysat
Summary
Denne protokollen beskriver en rask og enkel metode for å produsere bakteriell lysat for cellefritt genuttrykk, ved hjelp av en konstruert stamme av Escherichia coli og krever bare standard laboratorieutstyr.
Abstract
Cellefritt genuttrykk gir biologiens kraft uten komplikasjoner av en levende organisme. Selv om mange slike genuttrykkssystemer eksisterer, er de fleste ganske dyre å kjøpe og / eller krever spesialutstyr og fin finpusset kompetanse for å produsere effektivt. Denne protokollen beskriver en metode for å produsere bakteriell cellefri lysat som støtter høye nivåer av genuttrykk, ved hjelp av bare standard laboratorieutstyr og krever minimal behandling. Metoden bruker en Escherichia coli-stamme som produserer en endolysin som ikke påvirker veksten, men som effektivt lyser en høstet cellepellet etter en enkel fryse-tining syklus. Den eneste videre behandlingen som kreves er en kort inkubasjon etterfulgt av sentrifugering for å fjerne autolysat av cellulært rusk. Dynamiske genkretser kan oppnås gjennom heterologt uttrykk for ClpX-protease i cellene før høsting. En E. coli-stamme som mangler lacZ-genet, kan brukes til høysensitive, cellefrie biosensing-applikasjoner ved hjelp av en kolorimetrisk eller fluorescerende avlesning. Hele protokollen krever så få som 8-9 timer, med bare 1-2 timer praktisk arbeid fra inokulasjon til ferdigstillelse. Ved å redusere kostnadene og tiden for å oppnå cellefri lysat, bør denne metoden øke overkommeligheten av cellefritt genuttrykk for ulike applikasjoner.
Introduction
Genuttrykk i cellefrie lysater har flere fordeler i forhold til å bruke levende celler1,2,3,4. Lysater kan enkelt modifiseres biokjemisk og brukes under forhold som kan være skadelige for eller umulig å oppnå i levende celler. Genuttrykkskretser trenger ikke å kjempe eller konkurrere med vertsbiologiske prosesser, og testing av nye genetiske kretser er så enkelt som å legge til DNA. Av disse grunnene har cellefritt genuttrykk funnet ulike bruksområder, fra biosensorer5,6 til raskt prototyping av syntetiske genkretser7,8 til utvikling av kunstige celler9. De fleste cellefrie genuttrykk bruker cellulære lysater som har blitt svært bearbeidet, og som vanligvis krever lange og komplekse protokoller, spesialutstyr og/eller sensitive trinn som kan føre til betydelig variasjon mellom brukere og partier10,11.
Dette dokumentet beskriver en enkel, effektiv metode for å produsere cellefri lysat som krever minimal behandling og ekspertise (Figur 1A)12. Metoden er avhengig av E. coli-celler som er konstruert for å lyse etter en enkel fryse-tine syklus. Cellene uttrykker en endolysin fra phage lambda som forringer celleveggen. Etter hvert som cellene vokser, forblir denne endolysinen i cytoplasma, beslaglagt fra celleveggen. Imidlertid forstyrrer en enkel fryse-tining syklus den cytoplasmatiske membranen, frigjør endolysin i periplasma, hvor den forringer celleveggen, noe som resulterer i rask cellelys. Protokollen kan fullføres med bare noen få timers praktisk arbeid og krever bare en fryser, en sentrifuge som er i stand til 30.000 × g (for optimale resultater; lavere hastigheter kan brukes med mer forsiktighet for ikke å forstyrre pellet), en virvelblander og en enkel bufferløsning. Funksjonell lysat kan til og med produseres ved å fryse tørking av cellene og rehydrere dem in situ. Denne metoden produserer imidlertid lysater med lavere aktivitet, antagelig på grunn av gjenværende celleavfall.
Lysatene er svært aktive for cellefritt genuttrykk, og de kan forbedres på forskjellige måter avhengig av sluttbruken. Frekvensen av proteinsyntese kan økes ytterligere ved å konsentrere lysatet ved hjelp av standard spinnkonsentratorer. Lineært DNA kan beskyttes mot nedbrytning ved å tilsette renset GamS-protein. Proteinforringelse, som er nødvendig for mer kompleks kretsdynamikk som oscillasjon, kan oppnås ved å uttrykke en ClpX-heksamer i den autolyserende produserende stammen13. Til slutt aktiveres LacZ-baserte visuelle avlesninger ved hjelp av en autolysert belastning som mangler lacZ. Totalt sett produserer denne metoden svært aktiv cellefri lysat som passer for et bredt spekter av applikasjoner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen som beskrives her gir svært aktiv bakteriell lysat for cellefritt genuttrykk. Nøkkelen er å bruke celler som bærer plasmid pAD-LyseR, som uttrykker lambda phage endolysin cytosolisk. Disse cellene er forsterket for å lyse seg ved permeabilisering av den indre membranen, slik at endolysintilgangen til celleveggen, som metoden oppnår gjennom en enkel fryse-tine syklus. Fordi cellene effektivt lyser seg selv, blir produktet referert til som autolysat. Etter at cellene har lysnet, er de eneste gjenværende …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Zachary Sun og Richard Murray (California Institute of Technology) for vennlig å gi plasmid P_araBAD-gamS, og Kaeko Kamei (Kyoto Institute of Technology) for vennlig å gi en høyhastighets kjølesentrifuge. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Institutes of Health og fra ARO MURI-programmet og ble delvis støttet av Leading Initiative for Excellent Young Researchers, MEXT, Japan.
Materials
| 2xYT media | EMD Millipore | 4.85008 | or equivalent |
| 3-PGA | Sigma Aldrich | P8877 | or equivalent |
| Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit, 3 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC900308 | optional, can be used to concentrate lysate, select concentrator capacity appropriate for the volume to be concentrated |
| ampicillin | Sigma Aldrich | A0166-5G | or carbenicillin, a more stable variant |
| ATP | Sigma Aldrich | A8937 | or equivalent |
| cAMP | Sigma Aldrich | A9501 | or equivalent |
| CoA | Sigma Aldrich | C4282 | or equivalent |
| CTP | United States Biosciences | 14121 | or equivalent |
| D-glucose (dextrose) | Fisher Scientific | AAA1749603 | or equivalent |
| dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | D0632-1G | or equivalent |
| E. coli BL21-Gold (DE3) carrying pAD-LyseR | Addgene | 99244 | |
| E. coli BL21-Gold (DE3) ΔlacZ carrying pAD-LyseR | Addgene | 99245 | |
| Folinic acid | Sigma Aldrich | F7878 | or equivalent |
| GTP | United States Biosciences | 16800 | or equivalent |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-25G | or equivalent |
| LB media | Fisher Scientific | DF0446075 | or equivalent |
| magnesium glutamate | Sigma Aldrich | 49605-250G | or equivalent |
| NAD | Sigma Aldrich | N6522 | or equivalent |
| potassium glutamate | Sigma Aldrich | G1501-100G | or equivalent |
| potassium hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | 221473-25G | for adjusting pH |
| potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | or equivalent |
| potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | or equivalent |
| Spermidine | Sigma Aldrich | 85558 | or equivalent |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | 9310500GM | or equivalent |
| tRNA mix | Roche | 10109541001 | or equivalent |
| UTP | United States Biosciences | 23160 | or equivalent |
References
- Dudley, Q. M., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free metabolic engineering: biomanufacturing beyond the cell. Biotechnology Journal. 10 (1), 69-82 (2015).
- Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. The emerging age of cell-free synthetic biology. FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).
- Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research. International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).
- He, M. Cell-free protein synthesis: applications in proteomics and biotechnology. New Biotechnology. 25 (2-3), 126-132 (2008).
- Pardee, K., et al. Paper-based synthetic gene networks. Cell. 159 (4), 940-954 (2014).
- Pardee, K., et al. low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
- Takahashi, M. K., et al. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods. 86, 60-72 (2015).
- Siegal-Gaskins, D., Tuza, Z. A., Kim, J., Noireaux, V., Murray, R. M. Gene circuit performance characterization and resource usage in a cell-free “breadboard”. ACS Synthetic Biology. 3 (6), 416-425 (2014).
- Niederholtmeyer, H., Chaggan, C., Devaraj, N. K. Communication and quorum sensing in non-living mimics of eukaryotic cells. Nature Communications. 9, 5027 (2018).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50762 (2013).
- Dopp, J., Jo, Y., Reuel, N. Methods to reduce variability in E. coli-based cell-free protein expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
- Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression. ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).
- Tonooka, T., Niederholtmeyer, H., Tsimring, L., Hasty, J. Artificial cell on a chip integrated with protein degradation. 2019 IEEE 32nd International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (MEMS). , 107-109 (2019).
- Garibaldi, B., et al. Validation of autoclave protocols for successful decontamination of category A medical waste generated from care of patients with serious communicable diseases. Journal of Clinical Microbiology. 55 (2), 545-551 (2017).
- Cole, S., Miklos, A., Chiao, A., Sun, Z., Lux, M. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
- Fujiwara, K., Doi, N. Biochemical preparation of cell extract for cell-free protein synthesis without physical disruption. PLoS ONE. 11 (4), 0154614 (2016).
- Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, 8 (2010).
