דור אורגנוידים במוח האדם למידול מחלות מיטוכונדריאליות
Summary
אנו מתארים פרוטוקול מפורט ליצירת אורגנוידים במוח המושרים תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים והשימוש בהם בדוגמנות מחלות מיטוכונדריאליות.
Abstract
מחלות מיטוכונדריאליות מייצגות את הכיתה הגדולה ביותר של טעויות מולדות של חילוף החומרים, וכיום הן חשוכות מרפא. מחלות אלה גורמות למומים נוירו-פיתוחיים שהמנגנונים הבסיסיים שלהם נותרים להתגלות. מחסום מרכזי הוא היעדר מודלים יעילים המשיבים את הליקוי העצבי המוקדם שנראה בחולים. ההתקדמות בטכנולוגיה של תאי גזע פלוריפוטנטים המושרים (iPSCs) מאפשרת ייצור של אורגנוידים תלת ממדיים (3D) במוח שניתן להשתמש בהם כדי לחקור את ההשפעה של מחלות על הפיתוח והארגון של מערכת העצבים. חוקרים, כולל מחברים אלה, הציגו לאחרונה אורגנוידים במוח האנושי מודל הפרעות מיטוכונדריאליות. מאמר זה מדווח על פרוטוקול מפורט לדור החזק של אורגנוידים אנושיים שמקורם ב- IPSC והשימוש בהם בפרופילים ביו-אנרגטיים מיטוכונדריאליים וניתוחי הדמיה. ניסויים אלה יאפשרו שימוש באורגנוידים במוח כדי לחקור תפקודים מטבוליים והתפתחותיים ועשויים לספק מידע חיוני כדי לנתח את הפתולוגיה העצבית של מחלות מיטוכונדריאליות.
Introduction
מחלות מיטוכונדריאליות מייצגות את הכיתה הגדולה ביותר של טעויות מולדות של חילוף החומרים1. הם נגרמים על ידי מוטציות גנטיות המשבשות תהליכים מיטוכונדריאליים שונים, כולל זרחן חמצוני (OXPHOS)2, הרכבת שרשרת הנשימה, דינמיקה מיטוכונדריאלית, ותעתיק DNA מיטוכונדריאלי או שכפול3. רקמות עם דרישות אנרגיה מושפעים במיוחד על ידי תפקוד מיטוכונדריאלי4. בהתאם, חולים עם מחלות מיטוכונדריאליות בדרך כלל לפתח ביטויים נוירולוגיים מוקדמים.
אין כיום טיפולים זמינים לילדים הנגועים במחלות מיטוכונדריאליות5. מכשול מרכזי להתפתחות תרופות של מחלות מיטוכונדריאליות הוא היעדר מודלים יעילים המשיבים את קורס המחלה האנושית6. כמה מהמודלים החייתיים הנחקרים כיום אינם מציגים את הפגמים הנוירולוגיים הקיימים בחולים7. לפיכך, המנגנונים שבביד הפתולוגיה העצבית של מחלות מיטוכונדריאליות עדיין אינם מובנים במלואם.
מחקרים אחרונים יצרו IPSCs מחולים מושפעים ממחלות מיטוכונדריאליות והשתמשו בתאים אלה כדי להשיג תאים עצביים ספציפיים לחולה. לדוגמה, פגמים גנטיים הקשורים למחלה המיטוכונדריאלית, תסמונת לי, נמצאו כגורמים לסטיות בביו-אנרגטיקה תאית8,9, סינתזת חלבונים10 וסידן הומאוסטזיס9,11. דיווחים אלה סיפקו רמזים מכניים חשובים על הליקוי העצבי המתרחש במחלות מיטוכונדריאליות, וסללו את הדרך לגילוי תרופות למחלות חשוכות מרפא אלה12.
תרבויות דו-ממדיות (דו-ממדיות), לעומת זאת, אינן מאפשרות לחקור את המורכבות האדריכלית והארגון האזורי של איברים תלת-ממדיים13. לשם כך, השימוש באורגנוידים מוחיים תלת-ממדיים הנגזרים מ- iPSCs14 ספציפי למטופל עשוי לאפשר לחוקרים להשיג מידע חשוב נוסף ובכך לעזור לנתח כיצד מחלות מיטוכונדריאליות משפיעות על התפתחותה ותפקודה של מערכת העצבים15. מחקרים המעסיקים אורגנוידים במוח שמקורם ב- IPSC כדי לחקור מחלות מיטוכונדריאליות מתחילים לחשוף את המרכיבים הנוירו-התפתחותיים של מחלות מיטוכונדריאליות.
אורגנוידים חוט השדרה נושא מוטציות הקשורות למחלה המיטוכונדריאלית, אנצפלופתיה מיטוכונדריאלית, חמצת לקטית, ותסמונת פרקים דמויי שבץ (MELAS), הראו נוירוגנזה פגומה ובידול נוירון מוטורי מושהה16. אורגנוידים קליפת המוח נגזרים מחולים עם המחלה המיטוכונדריאלית, תסמונת לי, הראו גודל מופחת, פגמים ביצירת ניצני אפיתל עצביים, ואובדן ארכיטקטורה קליפת המוח17. אורגנוידים במוח מחולי תסמונת לי הראו כי פגמים המחלה ליזום ברמה של תאי אבות עצביים, אשר לא יכול להתחייב חילוף החומרים המיטוכונדריאלי, גרימת הסתעפות עצבית חריגה מורפוגנזה18. לכן, אבות עצביים עשויים לייצג יעד טיפולי תאי למחלות מיטוכונדריאליות, ואסטרטגיות לקידום תפקודם המיטוכונדריאלי עשויות לתמוך בהתפתחות התפקודית של מערכת העצבים.
השימוש באורגנוידים במוח עשוי לעזור לחשוף את הרכיבים הנוירו-התפתחותיים של מחלות מיטוכונדריאליות. מחלות מיטוכונדריאליות נחשבות בעיקר ניוון עצבי מוקדם5. עם זאת, פגמים נוירו-התפתחותיים קיימים גם בחולים המושפעים ממחלות מיטוכונדריאליות, כולל עיכוב התפתחותי ופגיעה קוגניטיבית19. אורגנוידים מוחיים ספציפיים לחולה עשויים לעזור לטפל בהיבטים אלה ולפרט כיצד מחלות מיטוכונדריאליות עשויות להשפיע על התפתחות המוח האנושי. תפקוד לקוי של מיטוכונדריה יכול גם לשחק תפקיד פתוגנטי במחלות נוירולוגיות נפוצות יותר, כגון מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון ומחלת הנטינגטון4. לפיכך, לפרט את ההשפעה של פגמים מיטוכונדריאליים נוירו-פיתוח באמצעות organoids המוח עשוי גם להיות אינסטרומנטלי לחקר מחלות אלה. מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט ליצירת אורגנוידים במוח לשחזור שניתן להשתמש בהם לביצוע מודל מחלות של מחלות מיטוכונדריאליות.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מתאר את הדור הניתב לשחזור של אורגנוידים אנושיים המופקים מ- IPSC ואת השימוש בהם למידול מחלות מיטוכונדריאליות. הפרוטוקול המתואר כאן משתנה בהתבסס על עבודה שפורסמה בעבר20. אחד היתרונות העיקריים של הפרוטוקול הנוכחי הוא שהוא אינו דורש הטמעה ידנית של כל אורגנויד במטריצה פיגומ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למרים בנינג על התמיכה הטכנית. אנו מכירים בתמיכה של דויטשה Forschungsgemeinschaft (DFG) (PR1527/5-1 ל- A.P.), ספארק ומכון הבריאות של ברלין (BIH) (קרנות אימות BIH ל- A.P.), הקרן המאוחדת למחלות מיטוכונדריאליות (UMDF) (מענק הקונסורציום הבינלאומי של תסמונת לי ל- A.P.), דיסלדורף של בית החולים האוניברסיטאי (Forschungskommission UKD ל- A.P.), ומשרד החינוך והמחקר הפדרלי הגרמני (BMBF) (ה: ביו חוקר צעיר להעניק AZ 031L0211 לא.פ.). העבודה במעבדה של C.R.R. נתמכה על ידי DFG (עבור 2795 “סינפסות תחת לחץ”, Ro 2327/13-1).
Materials
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| Affinity Designer | Serif (Europe) Ltd | Layout software; Vector graphics editor | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig | Sigma Aldrich | SAB4600033-250UL | 1:300 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse | Thermo Fisher Scientific | A-31571 | 1:300 |
| Antimycin A | Sigma Aldrich | 1397-94-0 | |
| Anti-β-Tubulin III (TUJ-1) | Sigma Aldrich | T8578 | 1:2000 |
| Argon Laser | Melles Griot | Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 488 is fine, too | |
| Ascorbic acid | Sigma | A92902 | |
| B-27 with Vitamin A | Gibco | 17504044 | |
| Bacto Agar | Becton Dickinson | 3% in PBS, store solution at -20 °C | |
| BDNF | Miltenyi Biotec | 130-093-0811 | |
| cAMP | Sigma | D0627 | |
| Cell Star cell culture 6 well plate | Greiner-Bio-One | 657160 | |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Gibco | 11905031 | |
| Confocal laser scanning microscope C1 | Nikon Microscope Solutions | Modular confocal microscope system | |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement membrane matrix, Phenol Red-free, LDEV-free | Corning | 356231 | Matrix component |
| CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit | Thermo Fisher | C7026 | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher | 31330038 | |
| DMSO | Sigma | D2660-100ML | |
| Donkey anti-goat Cy3 | Merck Millipore | AP180C | 1:300 |
| Donkey anti-mouse Cy3 | Merck Millipore | AP192C | 1:300 |
| Donkey anti-rabbit Cy3 | Merck Millipore | AP182C | 1:300 |
| DPBS | Gibco | 14190250 | |
| DS-Q1Mc camera | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse 90i upright widefield microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse E 600FN upright microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse Ts2 Inverted Microscope | Nikon Microsope Solutions | ||
| EZ-C1 Silver Version 3.91 | Nikon Microscope Solutions | Imaging software for confocal microscope | |
| FCCP | Sigma Aldrich | 370-86-5 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| GDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-291 | |
| Glasgow MEM | Gibco | 11710-035 | |
| Glass Pasteur pipette | Brand | 747715 | Inverted |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| Helium-Neon Laser | Melles Griot | Every other Laser, e.g., diode lasers emitting 594 is fine, too | |
| Heparin | Merck | H3149-25KU | |
| HERACell 240i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026331 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | 1:2500 |
| Image J 1.53c | Wayne Rasband National Institute of Health | Image processing Software | |
| Injekt Solo 10 mL/ Luer | Braun | 4606108V | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco | 10828010 | |
| Laser (407 nm) | Coherent | Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 407 is fine, too | |
| Map2 | Synaptic Systems | No. 188004 | 1:1000 |
| Maxisafe 2030i | |||
| MEM NEAA | Gibco | 11140-050 | |
| mTeSR Plus | Stemcell Technology | 85850 | iPSC medium |
| Multifuge X3R Centrifuge | Thermo Scientific | 10325804 | |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | # LT07-218 | |
| N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Needle for single usage (23G x 1” TW) | Neoject | 10016 | |
| NIS-Elements Aadvanced Research 3.2 | Nikon | Imaging software | |
| Oligomycin A | Sigma Aldrich | 75351 | |
| Orbital Shaker Heidolph Unimax 1010 | Heidolph | 543-12310-00 | |
| PAP Pen | Sigma | Z377821-1EA | To draw hydrophobic barrier on slides. |
| Papain Dissociation System kit | Worthington | LK003150 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 818715 | 4% in PBS, store solution at -20 °C |
| Pasteur pipette 7mL | VWR | 612-1681 | Graduated up to 3 mL |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Plan Apo VC 20x / 0.75 air DIC N2 ∞/0.17 WD 1.0 | Nikon Microscope Solutions | Dry Microscope Objective | |
| Plan Apo VC 60x / 1.40 oil DIC N2 ∞/0.17 WD 0.13 | Nikon Microscope Solutions | Oil Immersion Microscope Objective | |
| Polystyrene Petri dish (100 mm) | Greiner Bio-One | 664161 | |
| Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap (5 mL) | Falcon | 352235 | |
| Potassium chloride | Roth | 6781.1 | |
| ProLong Glass Antifade Moutant | Invitrogen | P36980 | |
| Qualitative filter paper | VWR | 516-0813 | |
| Rock Inhibitior | Merck | SCM075 | |
| Rotenone | Sigma | 83-794 | |
| S100β | Abcam | Ab11178 | 1:600 |
| SB-431542 | Cayman Chemical Company | 13031 | |
| Scalpel blades | Heinz Herenz Hamburq | 1110918 | |
| SMI312 | Biolegend | 837904 | 1:500 |
| Sodium bicarbonate | Merck/Sigma | 31437-1kg-M | |
| Sodium chloride | Roth | 3957 | |
| Sodium dihydrogen phosphate | Applichem | 131965 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| SOX2 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-17320 | 1:100 |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco/StemPro | A1110501 | Reagent A |
| Super Glue Gel | UHU | 63261 | adhesive gel |
| SuperFrost Plus | VWR | 631-0108 | |
| Syringe for single usage (1 mL) | BD Plastipak | 300015 | |
| TB2 Thermoblock | Biometra | ||
| TC Plate 24 Well | Sarstedt | 83.3922 | |
| TC Plate 6 Well | Sarstedt | 83.392 | |
| TGFbeta3 | Miltenyi Biotec | 130-094-007 | |
| Tissue Culture Hood | ThermoFisher | 51032711 | |
| TOM20 | Santa Cruz Biotechnology | SC-11415 | 1:200 |
| Triton-X | Merck | X100-5ML | |
| UltraPure 0.5M EDTA | Invitrogen | 15575020 | |
| Vibratome Microm HM 650 V | Thermo Scientific | Production terminated, any other adjustable microtome is fine, too. | |
| Vibratome Wilkinson Classic Razor Blade | Wilkinson Sword | 70517470 | |
| Whatman Benchkote | Merck/Sigma | 28418852 | |
| Wnt Antagonist I | EMD Millipore Corp | 3378738 | |
| XF 96 extracellular flux analyser | Seahorse Bioscience | 100737-101 | |
| XF Assay DMEM Medium | Seahorse Bioscience | 103680-100 | |
| XF Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
| XFe96 FluxPak (96-well microplate) | Seahorse Bioscience | 102416-100 |
References
- Koopman, W. J., Willems, P. H., Smeitink, J. A. Monogenic mitochondrial disorders. New England Journal of Medicine. 366 (12), 1132-1141 (2012).
- Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Review Disease Primers. 2, 16080 (2016).
- Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature. 491 (7424), 374-383 (2012).
- Carelli, V., Chan, D. C. Mitochondrial DNA: impacting central and peripheral nervous systems. Neuron. 84 (6), 1126-1142 (2014).
- Russell, O. M., Gorman, G. S., Lightowlers, R. N., Turnbull, D. M. Mitochondrial diseases: hope for the future. Cell. 181 (1), 168-188 (2020).
- Weissig, V. Drug development for the therapy of mitochondrial diseases. Trends in Molecular Medicine. 26 (1), 40-57 (2020).
- Tyynismaa, H., Suomalainen, A. Mouse models of mitochondrial DNA defects and their relevance for human disease. EMBO Reports. 10 (2), 137-143 (2009).
- Ma, H., et al. Metabolic rescue in pluripotent cells from patients with mtDNA disease. Nature. 524 (7564), 234-238 (2015).
- Galera-Monge, T., et al. Mitochondrial dysfunction and calcium dysregulation in Leigh syndrome induced pluripotent stem cell derived neurons. International Journal of Molecular Science. 21 (9), 3191 (2020).
- Zheng, X., et al. Alleviation of neuronal energy deficiency by mTOR inhibition as a treatment for mitochondria-related neurodegeneration. Elife. 5, 13378 (2016).
- Lorenz, C., et al. Human iPSC-derived neural progenitors are an effective drug discovery model for neurological mtDNA disorders. Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).
- Inak, G., et al. Concise review: induced pluripotent stem cell-based drug discovery for mitochondrial disease. Stem Cells. 35 (7), 1655-1662 (2017).
- Chiaradia, I., Lancaster, M. A. Brain organoids for the study of human neurobiology at the interface of in vitro and in vivo. Nature Neuroscience. 23 (12), 1496-1508 (2020).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocol. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Liput, M., et al. Tools and approaches for analyzing the role of mitochondria in health, development and disease using human cerebral organoids. Developmental Neurobiology. , (2021).
- Winanto, K. Z. J., Soh, B. S., Fan, Y., Ng, S. Y. Organoid cultures of MELAS neural cells reveal hyperactive Notch signaling that impacts neurodevelopment. Cell Death and Disease. 11 (3), 182 (2020).
- Romero-Morales, A. I., et al. Human iPSC-derived cerebral organoids model features of Leigh Syndrome and reveal abnormal corticogenesis. bioRxiv. , (2020).
- Inak, G., et al. Defective metabolic programming impairs early neuronal morphogenesis in neural cultures and an organoid model of Leigh syndrome. Nature Communications. 12 (1), 1929 (2021).
- Falk, M. J. Neurodevelopmental manifestations of mitochondrial disease. Journal of Developmental & Behavioral Pediatrics. 31 (7), 610-621 (2010).
- Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
- Pfiffer, V., Prigione, A. Assessing the bioenergetic profile of human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 1264, 279-288 (2015).
- Ludikhuize, M. C., Meerlo, M., Burgering, B. M. T., Colman, R. M. J. Protocol to profile the bioenergetics of organoids using Seahorse. STAR Protocols. 2 (1), 100386 (2021).
- Menacho, C., Prigione, A. Tackling mitochondrial diversity in brain function: from animal models to human brain organoids. International Journal of Biochemestry & Cell Biology. 123, 105760 (2020).
- Del Dosso, A., Urenda, J. P., Nguyen, T., Quadrato, G. Upgrading the physiological relevance of human brain organoids. Neuron. 107 (6), 1014-1028 (2020).
