Generazione di organoidi del cervello umano per la modellazione della malattia mitocondriale
Summary
Descriviamo un protocollo dettagliato per la generazione di organoidi cerebrali derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall’uomo e il loro uso nella modellazione delle malattie mitocondriali.
Abstract
Le malattie mitocondriali rappresentano la più grande classe di errori congeniti del metabolismo e sono attualmente incurabili. Queste malattie causano difetti dello sviluppo neurologico i cui meccanismi sottostanti rimangono da chiarire. Un importante ostacolo è la mancanza di modelli efficaci che ricapitolino la compromissione neuronale ad esordio precoce osservata nei pazienti. I progressi nella tecnologia delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) consentono la generazione di organoidi cerebrali tridimensionali (3D) che possono essere utilizzati per studiare l’impatto delle malattie sullo sviluppo e l’organizzazione del sistema nervoso. I ricercatori, compresi questi autori, hanno recentemente introdotto organoidi del cervello umano per modellare i disturbi mitocondriali. Questo documento riporta un protocollo dettagliato per la robusta generazione di organoidi cerebrali umani derivati da iPSC e il loro uso nella profilazione bioenergetica mitocondriale e nelle analisi di imaging. Questi esperimenti consentiranno l’uso di organoidi cerebrali per studiare le disfunzioni metaboliche e dello sviluppo e possono fornire informazioni cruciali per sezionare la patologia neuronale delle malattie mitocondriali.
Introduction
Le malattie mitocondriali rappresentano la più grande classe di errori congeniti del metabolismo1. Sono causati da mutazioni genetiche che interrompono diversi processi mitocondriali, tra cui la fosforilazione ossidativa (OXPHOS)2, l’assemblaggio della catena respiratoria, la dinamica mitocondriale e la trascrizione o la replicazione del DNA mitocondriale3. I tessuti con fabbisogno energetico sono particolarmente colpiti dalla disfunzione mitocondriale4. Di conseguenza, i pazienti con malattie mitocondriali sviluppano tipicamente manifestazioni neurologiche ad esordio precoce.
Attualmente non sono disponibili trattamenti per i bambini affetti da malattie mitocondriali5. Uno dei principali ostacoli allo sviluppo di farmaci per le malattie mitocondriali è la mancanza di modelli efficaci che ricapitolino il decorso della malattia umana6. Molti dei modelli animali attualmente studiati non presentano i difetti neurologici presenti nei pazienti7. Quindi, i meccanismi alla base della patologia neuronale delle malattie mitocondriali non sono ancora completamente compresi.
Studi recenti hanno generato iPSC da pazienti affetti da malattie mitocondriali e hanno utilizzato queste cellule per ottenere cellule neuronali specifiche del paziente. Ad esempio, è stato scoperto che i difetti genetici associati alla malattia mitocondriale, la sindrome di Leigh, causano aberrazioni nella bioenergetica cellulare8,9, nella sintesi proteica10 e nell’omeostasi del calcio9,11. Questi rapporti hanno fornito importanti indizi meccanicistici sulla compromissione neuronale che si verifica nelle malattie mitocondriali, aprendo la strada alla scoperta di farmaci per queste malattie incurabili12.
Le culture bidimensionali (2D), tuttavia, non consentono lo studio della complessità architettonica e dell’organizzazione regionale degli organi 3D13. A tal fine, l’uso di organoidi cerebrali 3D derivati da iPSC specifiche del paziente14 può consentire ai ricercatori di ottenere ulteriori informazioni importanti e quindi aiutare a sezionare come le malattie mitocondriali influenzano lo sviluppo e la funzione del sistema nervoso15. Gli studi che impiegano organoidi cerebrali derivati da iPSC per studiare le malattie mitocondriali stanno iniziando a scoprire i componenti dello sviluppo neurologico delle malattie mitocondriali.
Gli organoidi del midollo spinale portatori di mutazioni associate alla malattia mitocondriale, all’encefalopatia mitocondriale, all’acidosi lattica e alla sindrome da episodi simili a ictus (MELAS), hanno mostrato neurogenesi difettosa e differenziazione ritardata dei motoneuroni16. Gli organoidi corticali derivati da pazienti con malattia mitocondriale, sindrome di Leigh, hanno mostrato dimensioni ridotte, difetti nella generazione di gemme epiteliali neurali e perdita dell’architettura corticale17. Gli organoidi cerebrali dei pazienti con sindrome di Leigh hanno dimostrato che i difetti della malattia iniziano a livello delle cellule progenitrici neurali, che non possono impegnarsi nel metabolismo mitocondriale, causando aberranti ramificazioni neuronali e morfogenesi18. Pertanto, i progenitori neurali possono rappresentare un bersaglio terapeutico cellulare per le malattie mitocondriali e le strategie che promuovono la loro funzione mitocondriale possono supportare lo sviluppo funzionale del sistema nervoso.
L’uso di organoidi cerebrali potrebbe aiutare a scoprire i componenti dello sviluppo neurologico delle malattie mitocondriali. Le malattie mitocondriali sono considerate principalmente come neurodegenerazione ad esordio precoce5. Tuttavia, i difetti dello sviluppo neurologico sono presenti anche nei pazienti affetti da malattie mitocondriali, tra cui ritardo dello sviluppo e deterioramento cognitivo19. Gli organoidi cerebrali specifici del paziente possono aiutare ad affrontare questi aspetti e chiarire come le malattie mitocondriali possono avere un impatto sullo sviluppo del cervello umano. La disfunzione mitocondriale potrebbe anche svolgere un ruolo patogenetico in altre malattie neurologiche più comuni, come il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson e la malattia di Huntington4. Quindi, chiarire l’impatto dei difetti mitocondriali nel neurosviluppo usando organoidi cerebrali potrebbe anche essere strumentale per lo studio di tali malattie. Questo documento descrive un protocollo dettagliato per la generazione di organoidi cerebrali riproducibili che possono essere utilizzati per condurre la modellazione delle malattie mitocondriali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo articolo descrive la generazione riproducibile di organoidi cerebrali umani derivati da iPSC e il loro uso per la modellazione della malattia mitocondriale. Il protocollo qui descritto viene modificato sulla base di un lavoro pubblicato in precedenza20. Uno dei principali vantaggi del presente protocollo è che non richiede l’incorporamento manuale di ciascun organoide in una matrice di impalcatura. Infatti, la soluzione della matrice viene semplicemente disciolta nel terreno di coltura cel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Miriam Bünning per il supporto tecnico. Riconosciamo il sostegno della Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (PR1527/5-1 ad A.P.), Spark and Berlin Institute of Health (BIH) (BIH Validation Funds to A.P.), della United Mitochondrial Disease Foundation (UMDF) (Leigh Syndrome International Consortium Grant to A.P.), dell’University Hospital Duesseldorf (Forschungskommission UKD to A.P.) e del Ministero Federale Tedesco dell’Istruzione e della Ricerca (BMBF) (e: Bio giovane investigatore concede AZ 031L0211 ad A.P.). Il lavoro nel laboratorio del C.R.R. è stato sostenuto dal DFG (FOR 2795 “Synapses under stress”, Ro 2327/13-1).
Materials
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| Affinity Designer | Serif (Europe) Ltd | Layout software; Vector graphics editor | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig | Sigma Aldrich | SAB4600033-250UL | 1:300 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse | Thermo Fisher Scientific | A-31571 | 1:300 |
| Antimycin A | Sigma Aldrich | 1397-94-0 | |
| Anti-β-Tubulin III (TUJ-1) | Sigma Aldrich | T8578 | 1:2000 |
| Argon Laser | Melles Griot | Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 488 is fine, too | |
| Ascorbic acid | Sigma | A92902 | |
| B-27 with Vitamin A | Gibco | 17504044 | |
| Bacto Agar | Becton Dickinson | 3% in PBS, store solution at -20 °C | |
| BDNF | Miltenyi Biotec | 130-093-0811 | |
| cAMP | Sigma | D0627 | |
| Cell Star cell culture 6 well plate | Greiner-Bio-One | 657160 | |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Gibco | 11905031 | |
| Confocal laser scanning microscope C1 | Nikon Microscope Solutions | Modular confocal microscope system | |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement membrane matrix, Phenol Red-free, LDEV-free | Corning | 356231 | Matrix component |
| CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit | Thermo Fisher | C7026 | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher | 31330038 | |
| DMSO | Sigma | D2660-100ML | |
| Donkey anti-goat Cy3 | Merck Millipore | AP180C | 1:300 |
| Donkey anti-mouse Cy3 | Merck Millipore | AP192C | 1:300 |
| Donkey anti-rabbit Cy3 | Merck Millipore | AP182C | 1:300 |
| DPBS | Gibco | 14190250 | |
| DS-Q1Mc camera | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse 90i upright widefield microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse E 600FN upright microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse Ts2 Inverted Microscope | Nikon Microsope Solutions | ||
| EZ-C1 Silver Version 3.91 | Nikon Microscope Solutions | Imaging software for confocal microscope | |
| FCCP | Sigma Aldrich | 370-86-5 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| GDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-291 | |
| Glasgow MEM | Gibco | 11710-035 | |
| Glass Pasteur pipette | Brand | 747715 | Inverted |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| Helium-Neon Laser | Melles Griot | Every other Laser, e.g., diode lasers emitting 594 is fine, too | |
| Heparin | Merck | H3149-25KU | |
| HERACell 240i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026331 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | 1:2500 |
| Image J 1.53c | Wayne Rasband National Institute of Health | Image processing Software | |
| Injekt Solo 10 mL/ Luer | Braun | 4606108V | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco | 10828010 | |
| Laser (407 nm) | Coherent | Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 407 is fine, too | |
| Map2 | Synaptic Systems | No. 188004 | 1:1000 |
| Maxisafe 2030i | |||
| MEM NEAA | Gibco | 11140-050 | |
| mTeSR Plus | Stemcell Technology | 85850 | iPSC medium |
| Multifuge X3R Centrifuge | Thermo Scientific | 10325804 | |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | # LT07-218 | |
| N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Needle for single usage (23G x 1” TW) | Neoject | 10016 | |
| NIS-Elements Aadvanced Research 3.2 | Nikon | Imaging software | |
| Oligomycin A | Sigma Aldrich | 75351 | |
| Orbital Shaker Heidolph Unimax 1010 | Heidolph | 543-12310-00 | |
| PAP Pen | Sigma | Z377821-1EA | To draw hydrophobic barrier on slides. |
| Papain Dissociation System kit | Worthington | LK003150 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 818715 | 4% in PBS, store solution at -20 °C |
| Pasteur pipette 7mL | VWR | 612-1681 | Graduated up to 3 mL |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Plan Apo VC 20x / 0.75 air DIC N2 ∞/0.17 WD 1.0 | Nikon Microscope Solutions | Dry Microscope Objective | |
| Plan Apo VC 60x / 1.40 oil DIC N2 ∞/0.17 WD 0.13 | Nikon Microscope Solutions | Oil Immersion Microscope Objective | |
| Polystyrene Petri dish (100 mm) | Greiner Bio-One | 664161 | |
| Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap (5 mL) | Falcon | 352235 | |
| Potassium chloride | Roth | 6781.1 | |
| ProLong Glass Antifade Moutant | Invitrogen | P36980 | |
| Qualitative filter paper | VWR | 516-0813 | |
| Rock Inhibitior | Merck | SCM075 | |
| Rotenone | Sigma | 83-794 | |
| S100β | Abcam | Ab11178 | 1:600 |
| SB-431542 | Cayman Chemical Company | 13031 | |
| Scalpel blades | Heinz Herenz Hamburq | 1110918 | |
| SMI312 | Biolegend | 837904 | 1:500 |
| Sodium bicarbonate | Merck/Sigma | 31437-1kg-M | |
| Sodium chloride | Roth | 3957 | |
| Sodium dihydrogen phosphate | Applichem | 131965 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| SOX2 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-17320 | 1:100 |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco/StemPro | A1110501 | Reagent A |
| Super Glue Gel | UHU | 63261 | adhesive gel |
| SuperFrost Plus | VWR | 631-0108 | |
| Syringe for single usage (1 mL) | BD Plastipak | 300015 | |
| TB2 Thermoblock | Biometra | ||
| TC Plate 24 Well | Sarstedt | 83.3922 | |
| TC Plate 6 Well | Sarstedt | 83.392 | |
| TGFbeta3 | Miltenyi Biotec | 130-094-007 | |
| Tissue Culture Hood | ThermoFisher | 51032711 | |
| TOM20 | Santa Cruz Biotechnology | SC-11415 | 1:200 |
| Triton-X | Merck | X100-5ML | |
| UltraPure 0.5M EDTA | Invitrogen | 15575020 | |
| Vibratome Microm HM 650 V | Thermo Scientific | Production terminated, any other adjustable microtome is fine, too. | |
| Vibratome Wilkinson Classic Razor Blade | Wilkinson Sword | 70517470 | |
| Whatman Benchkote | Merck/Sigma | 28418852 | |
| Wnt Antagonist I | EMD Millipore Corp | 3378738 | |
| XF 96 extracellular flux analyser | Seahorse Bioscience | 100737-101 | |
| XF Assay DMEM Medium | Seahorse Bioscience | 103680-100 | |
| XF Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
| XFe96 FluxPak (96-well microplate) | Seahorse Bioscience | 102416-100 |
References
- Koopman, W. J., Willems, P. H., Smeitink, J. A. Monogenic mitochondrial disorders. New England Journal of Medicine. 366 (12), 1132-1141 (2012).
- Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Review Disease Primers. 2, 16080 (2016).
- Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature. 491 (7424), 374-383 (2012).
- Carelli, V., Chan, D. C. Mitochondrial DNA: impacting central and peripheral nervous systems. Neuron. 84 (6), 1126-1142 (2014).
- Russell, O. M., Gorman, G. S., Lightowlers, R. N., Turnbull, D. M. Mitochondrial diseases: hope for the future. Cell. 181 (1), 168-188 (2020).
- Weissig, V. Drug development for the therapy of mitochondrial diseases. Trends in Molecular Medicine. 26 (1), 40-57 (2020).
- Tyynismaa, H., Suomalainen, A. Mouse models of mitochondrial DNA defects and their relevance for human disease. EMBO Reports. 10 (2), 137-143 (2009).
- Ma, H., et al. Metabolic rescue in pluripotent cells from patients with mtDNA disease. Nature. 524 (7564), 234-238 (2015).
- Galera-Monge, T., et al. Mitochondrial dysfunction and calcium dysregulation in Leigh syndrome induced pluripotent stem cell derived neurons. International Journal of Molecular Science. 21 (9), 3191 (2020).
- Zheng, X., et al. Alleviation of neuronal energy deficiency by mTOR inhibition as a treatment for mitochondria-related neurodegeneration. Elife. 5, 13378 (2016).
- Lorenz, C., et al. Human iPSC-derived neural progenitors are an effective drug discovery model for neurological mtDNA disorders. Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).
- Inak, G., et al. Concise review: induced pluripotent stem cell-based drug discovery for mitochondrial disease. Stem Cells. 35 (7), 1655-1662 (2017).
- Chiaradia, I., Lancaster, M. A. Brain organoids for the study of human neurobiology at the interface of in vitro and in vivo. Nature Neuroscience. 23 (12), 1496-1508 (2020).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocol. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Liput, M., et al. Tools and approaches for analyzing the role of mitochondria in health, development and disease using human cerebral organoids. Developmental Neurobiology. , (2021).
- Winanto, K. Z. J., Soh, B. S., Fan, Y., Ng, S. Y. Organoid cultures of MELAS neural cells reveal hyperactive Notch signaling that impacts neurodevelopment. Cell Death and Disease. 11 (3), 182 (2020).
- Romero-Morales, A. I., et al. Human iPSC-derived cerebral organoids model features of Leigh Syndrome and reveal abnormal corticogenesis. bioRxiv. , (2020).
- Inak, G., et al. Defective metabolic programming impairs early neuronal morphogenesis in neural cultures and an organoid model of Leigh syndrome. Nature Communications. 12 (1), 1929 (2021).
- Falk, M. J. Neurodevelopmental manifestations of mitochondrial disease. Journal of Developmental & Behavioral Pediatrics. 31 (7), 610-621 (2010).
- Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
- Pfiffer, V., Prigione, A. Assessing the bioenergetic profile of human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 1264, 279-288 (2015).
- Ludikhuize, M. C., Meerlo, M., Burgering, B. M. T., Colman, R. M. J. Protocol to profile the bioenergetics of organoids using Seahorse. STAR Protocols. 2 (1), 100386 (2021).
- Menacho, C., Prigione, A. Tackling mitochondrial diversity in brain function: from animal models to human brain organoids. International Journal of Biochemestry & Cell Biology. 123, 105760 (2020).
- Del Dosso, A., Urenda, J. P., Nguyen, T., Quadrato, G. Upgrading the physiological relevance of human brain organoids. Neuron. 107 (6), 1014-1028 (2020).
