Generation af humane hjerneorganoider til mitokondriesygdom Modellering
Summary
Vi beskriver en detaljeret protokol for generering af menneskeskabte pluripotente stamcelle-afledte hjerneorganoider og deres anvendelse i modellering mitokondrie sygdomme.
Abstract
Mitokondriesygdomme repræsenterer den største klasse af medfødte fejl i stofskiftet og er i øjeblikket uhelbredelige. Disse sygdomme forårsager neuroudviklingsmæssige defekter, hvis underliggende mekanismer endnu ikke er belyst. En større vejspærring er manglen på effektive modeller, der rekapitulerer den tidlige neuronal svækkelse, der ses hos patienterne. Fremskridt inden for teknologien af inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) muliggør generering af tredimensionelle (3D) hjerneorganoider, der kan bruges til at undersøge virkningen af sygdomme på udviklingen og organiseringen af nervesystemet. Forskere, herunder disse forfattere, har for nylig indført menneskelige hjerneorganoider til model mitokondrie lidelser. Dette papir rapporterer en detaljeret protokol for den robuste generation af humane iPSC-afledte hjerneorganoider og deres anvendelse i mitokondrie bioenergetisk profilering og billeddannelse analyser. Disse eksperimenter vil gøre det muligt at bruge hjerneorganoider til at undersøge metaboliske og udviklingsmæssige dysfunktioner og kan give afgørende oplysninger til at dissekere neuronale patologi af mitokondriesygdomme.
Introduction
Mitokondriesygdomme repræsenterer den største klasse af medfødte fejl i stofskiftet1. De er forårsaget af genetiske mutationer forstyrre forskellige mitokondrie processer, herunder oxidativ fosforylering (OXPHOS)2, respiratorisk kæde samling, mitokondrie dynamik, og mitokondrie DNA transskription eller replikation3. Væv med energibehov er særligt påvirket af mitokondrie dysfunktion4. Derfor udvikler patienter med mitokondriesygdomme typisk tidlige neurologiske manifestationer.
Der er i øjeblikket ingen behandlinger til rådighed for børn ramt af mitokondrie sygdomme5. En væsentlig hindring for lægemiddeludvikling af mitokondriesygdomme er manglen på effektive modeller, der rekapitulerer det menneskelige sygdomsforløb6. Flere af de aktuelt undersøgte dyremodeller udviser ikke de neurologiske defekter, der er til stede hos patienterne7. Derfor er de mekanismer, der ligger til grund for neuronal patologi af mitokondriesygdomme, stadig ikke fuldt forstået.
Nylige undersøgelser genererede iPSC’er fra patienter, der var ramt af mitokondriesygdomme, og brugte disse celler til at opnå patientspecifikke neuronale celler. For eksempel, genetiske defekter forbundet med mitokondriesygdom, Leigh syndrom, har vist sig at forårsage afvigelser i cellulære bioenergetics8,9, proteinsyntese10, og calcium homøostase9,11. Disse rapporter gav vigtige mekanistiske spor om neuronal svækkelse forekommer i mitokondrie sygdomme, bane vejen for opdagelse af lægemidler for disse uhelbredelige sygdomme12.
Todimensionelle (2D) kulturer gør det imidlertid ikke muligt at undersøge den arkitektoniske kompleksitet og regionale organisering af 3D-organer13. Med henblik herpå kan brugen af 3D-hjerneorganoider afledt af patientspecifikke iPSCs14 give forskerne mulighed for at få yderligere vigtige oplysninger og dermed bidrage til at dissekere, hvordan mitokondriesygdomme påvirker udviklingen og funktionen af nervesystemet15. Undersøgelser, der anvender iPSC-afledte hjerneorganoider til at undersøge mitokondriesygdomme, begynder at afdække de neuroudviklingsmæssige komponenter i mitokondriesygdomme.
Rygmarvsorganoider med mutationer forbundet med mitokondriesygdom, mitokondrie encephalopati, mælkesyreose og slagtilfældelignende episoder syndrom (MELAS), viste defekt neurogenese og forsinket motor neurondifferentiering16. Kortikale organoider stammer fra patienter med mitokondriesygdom, Leigh syndrom, viste nedsat størrelse, defekter i neural epitel bud generation, og tab af kortikale arkitektur17. Hjerneorganoider fra Leigh syndrom patienter viste, at sygdommen defekter indlede på niveau med neurale stamfader celler, som ikke kan forpligte sig til mitokondrie metabolisme, forårsager afvigende neuronal forgrening og morfogenese18. Således, neurale forfædre kan repræsentere en cellulær terapeutisk mål for mitokondrie sygdomme, og strategier fremme deres mitokondrie funktion kan støtte den funktionelle udvikling af nervesystemet.
Brugen af hjerneorganoider kan hjælpe med at afdække de neuroudviklingsmæssige komponenter i mitokondriesygdomme. Mitokondriesygdomme betragtes hovedsageligt som tidlig neurodegeneration5. Men, neuroudviklingsmæssige defekter er også til stede hos patienter ramt af mitokondrie sygdomme, herunder udviklingsforsinkelse og kognitiv svækkelse19. Patient-specifikke hjerne organoider kan hjælpe med at løse disse aspekter og belyse, hvordan mitokondrie sygdomme kan påvirke menneskets hjerne udvikling. Mitokondrie dysfunktion kan også spille en patogenetisk rolle i andre mere almindelige neurologiske sygdomme, såsom Alzheimers sygdom, Parkinsons sygdom, og Huntingtons Sygdom4. Derfor kan det også være medvirkende til studiet af disse sygdomme at belyse virkningen af mitokondriedefekter i neuroudvikling ved hjælp af hjerneorganoider. Dette papir beskriver en detaljeret protokol til generering reproducerbare hjerneorganoider, der kan bruges til at gennemføre sygdom modellering af mitokondrie sygdomme.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette papir beskriver reproducerbar generation af humane iPSC-afledte hjerneorganoider og deres anvendelse til mitokondrie sygdom modellering. Den protokol, der er beskrevet her, ændres på basis af et tidligere udgivet værk20. En stor fordel ved den nuværende protokol er, at det ikke kræver manuel indlejring af hvert organoid i en stilladsmatrix. Faktisk opløses matrixopløsningen simpelthen i cellekulturmediet. Desuden er der ingen grund til at ansætte dyre bioreaktorer, da organoider kan …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Miriam Bünning for teknisk support. Vi anerkender støtte fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (PR1527/5-1 til A.P.), Spark og Berlin Institute of Health (BIH) (BIH Validation Funds to A.P.), United Mitochondrial Disease Foundation (UMDF) (Leighskadrom International Consortium Grant to A.P.), University Hospital Düsseldorf (Forschungs UKD til A.P.) og det tyske forbundsministerium for uddannelse og forskning (BMBF) (e: Bio unge investigator tilskud AZ 031L0211 til A.P.). Arbejdet i laboratoriet i C.R.R. blev støttet af DFG (FOR 2795 “Synapses under stress”, Ro 2327/13-1).
Materials
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| Affinity Designer | Serif (Europe) Ltd | Layout software; Vector graphics editor | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig | Sigma Aldrich | SAB4600033-250UL | 1:300 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse | Thermo Fisher Scientific | A-31571 | 1:300 |
| Antimycin A | Sigma Aldrich | 1397-94-0 | |
| Anti-β-Tubulin III (TUJ-1) | Sigma Aldrich | T8578 | 1:2000 |
| Argon Laser | Melles Griot | Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 488 is fine, too | |
| Ascorbic acid | Sigma | A92902 | |
| B-27 with Vitamin A | Gibco | 17504044 | |
| Bacto Agar | Becton Dickinson | 3% in PBS, store solution at -20 °C | |
| BDNF | Miltenyi Biotec | 130-093-0811 | |
| cAMP | Sigma | D0627 | |
| Cell Star cell culture 6 well plate | Greiner-Bio-One | 657160 | |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Gibco | 11905031 | |
| Confocal laser scanning microscope C1 | Nikon Microscope Solutions | Modular confocal microscope system | |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement membrane matrix, Phenol Red-free, LDEV-free | Corning | 356231 | Matrix component |
| CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit | Thermo Fisher | C7026 | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher | 31330038 | |
| DMSO | Sigma | D2660-100ML | |
| Donkey anti-goat Cy3 | Merck Millipore | AP180C | 1:300 |
| Donkey anti-mouse Cy3 | Merck Millipore | AP192C | 1:300 |
| Donkey anti-rabbit Cy3 | Merck Millipore | AP182C | 1:300 |
| DPBS | Gibco | 14190250 | |
| DS-Q1Mc camera | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse 90i upright widefield microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse E 600FN upright microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse Ts2 Inverted Microscope | Nikon Microsope Solutions | ||
| EZ-C1 Silver Version 3.91 | Nikon Microscope Solutions | Imaging software for confocal microscope | |
| FCCP | Sigma Aldrich | 370-86-5 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| GDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-291 | |
| Glasgow MEM | Gibco | 11710-035 | |
| Glass Pasteur pipette | Brand | 747715 | Inverted |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| Helium-Neon Laser | Melles Griot | Every other Laser, e.g., diode lasers emitting 594 is fine, too | |
| Heparin | Merck | H3149-25KU | |
| HERACell 240i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026331 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | 1:2500 |
| Image J 1.53c | Wayne Rasband National Institute of Health | Image processing Software | |
| Injekt Solo 10 mL/ Luer | Braun | 4606108V | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco | 10828010 | |
| Laser (407 nm) | Coherent | Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 407 is fine, too | |
| Map2 | Synaptic Systems | No. 188004 | 1:1000 |
| Maxisafe 2030i | |||
| MEM NEAA | Gibco | 11140-050 | |
| mTeSR Plus | Stemcell Technology | 85850 | iPSC medium |
| Multifuge X3R Centrifuge | Thermo Scientific | 10325804 | |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | # LT07-218 | |
| N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Needle for single usage (23G x 1” TW) | Neoject | 10016 | |
| NIS-Elements Aadvanced Research 3.2 | Nikon | Imaging software | |
| Oligomycin A | Sigma Aldrich | 75351 | |
| Orbital Shaker Heidolph Unimax 1010 | Heidolph | 543-12310-00 | |
| PAP Pen | Sigma | Z377821-1EA | To draw hydrophobic barrier on slides. |
| Papain Dissociation System kit | Worthington | LK003150 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 818715 | 4% in PBS, store solution at -20 °C |
| Pasteur pipette 7mL | VWR | 612-1681 | Graduated up to 3 mL |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Plan Apo VC 20x / 0.75 air DIC N2 ∞/0.17 WD 1.0 | Nikon Microscope Solutions | Dry Microscope Objective | |
| Plan Apo VC 60x / 1.40 oil DIC N2 ∞/0.17 WD 0.13 | Nikon Microscope Solutions | Oil Immersion Microscope Objective | |
| Polystyrene Petri dish (100 mm) | Greiner Bio-One | 664161 | |
| Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap (5 mL) | Falcon | 352235 | |
| Potassium chloride | Roth | 6781.1 | |
| ProLong Glass Antifade Moutant | Invitrogen | P36980 | |
| Qualitative filter paper | VWR | 516-0813 | |
| Rock Inhibitior | Merck | SCM075 | |
| Rotenone | Sigma | 83-794 | |
| S100β | Abcam | Ab11178 | 1:600 |
| SB-431542 | Cayman Chemical Company | 13031 | |
| Scalpel blades | Heinz Herenz Hamburq | 1110918 | |
| SMI312 | Biolegend | 837904 | 1:500 |
| Sodium bicarbonate | Merck/Sigma | 31437-1kg-M | |
| Sodium chloride | Roth | 3957 | |
| Sodium dihydrogen phosphate | Applichem | 131965 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| SOX2 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-17320 | 1:100 |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco/StemPro | A1110501 | Reagent A |
| Super Glue Gel | UHU | 63261 | adhesive gel |
| SuperFrost Plus | VWR | 631-0108 | |
| Syringe for single usage (1 mL) | BD Plastipak | 300015 | |
| TB2 Thermoblock | Biometra | ||
| TC Plate 24 Well | Sarstedt | 83.3922 | |
| TC Plate 6 Well | Sarstedt | 83.392 | |
| TGFbeta3 | Miltenyi Biotec | 130-094-007 | |
| Tissue Culture Hood | ThermoFisher | 51032711 | |
| TOM20 | Santa Cruz Biotechnology | SC-11415 | 1:200 |
| Triton-X | Merck | X100-5ML | |
| UltraPure 0.5M EDTA | Invitrogen | 15575020 | |
| Vibratome Microm HM 650 V | Thermo Scientific | Production terminated, any other adjustable microtome is fine, too. | |
| Vibratome Wilkinson Classic Razor Blade | Wilkinson Sword | 70517470 | |
| Whatman Benchkote | Merck/Sigma | 28418852 | |
| Wnt Antagonist I | EMD Millipore Corp | 3378738 | |
| XF 96 extracellular flux analyser | Seahorse Bioscience | 100737-101 | |
| XF Assay DMEM Medium | Seahorse Bioscience | 103680-100 | |
| XF Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
| XFe96 FluxPak (96-well microplate) | Seahorse Bioscience | 102416-100 |
References
- Koopman, W. J., Willems, P. H., Smeitink, J. A. Monogenic mitochondrial disorders. New England Journal of Medicine. 366 (12), 1132-1141 (2012).
- Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Review Disease Primers. 2, 16080 (2016).
- Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature. 491 (7424), 374-383 (2012).
- Carelli, V., Chan, D. C. Mitochondrial DNA: impacting central and peripheral nervous systems. Neuron. 84 (6), 1126-1142 (2014).
- Russell, O. M., Gorman, G. S., Lightowlers, R. N., Turnbull, D. M. Mitochondrial diseases: hope for the future. Cell. 181 (1), 168-188 (2020).
- Weissig, V. Drug development for the therapy of mitochondrial diseases. Trends in Molecular Medicine. 26 (1), 40-57 (2020).
- Tyynismaa, H., Suomalainen, A. Mouse models of mitochondrial DNA defects and their relevance for human disease. EMBO Reports. 10 (2), 137-143 (2009).
- Ma, H., et al. Metabolic rescue in pluripotent cells from patients with mtDNA disease. Nature. 524 (7564), 234-238 (2015).
- Galera-Monge, T., et al. Mitochondrial dysfunction and calcium dysregulation in Leigh syndrome induced pluripotent stem cell derived neurons. International Journal of Molecular Science. 21 (9), 3191 (2020).
- Zheng, X., et al. Alleviation of neuronal energy deficiency by mTOR inhibition as a treatment for mitochondria-related neurodegeneration. Elife. 5, 13378 (2016).
- Lorenz, C., et al. Human iPSC-derived neural progenitors are an effective drug discovery model for neurological mtDNA disorders. Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).
- Inak, G., et al. Concise review: induced pluripotent stem cell-based drug discovery for mitochondrial disease. Stem Cells. 35 (7), 1655-1662 (2017).
- Chiaradia, I., Lancaster, M. A. Brain organoids for the study of human neurobiology at the interface of in vitro and in vivo. Nature Neuroscience. 23 (12), 1496-1508 (2020).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocol. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Liput, M., et al. Tools and approaches for analyzing the role of mitochondria in health, development and disease using human cerebral organoids. Developmental Neurobiology. , (2021).
- Winanto, K. Z. J., Soh, B. S., Fan, Y., Ng, S. Y. Organoid cultures of MELAS neural cells reveal hyperactive Notch signaling that impacts neurodevelopment. Cell Death and Disease. 11 (3), 182 (2020).
- Romero-Morales, A. I., et al. Human iPSC-derived cerebral organoids model features of Leigh Syndrome and reveal abnormal corticogenesis. bioRxiv. , (2020).
- Inak, G., et al. Defective metabolic programming impairs early neuronal morphogenesis in neural cultures and an organoid model of Leigh syndrome. Nature Communications. 12 (1), 1929 (2021).
- Falk, M. J. Neurodevelopmental manifestations of mitochondrial disease. Journal of Developmental & Behavioral Pediatrics. 31 (7), 610-621 (2010).
- Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
- Pfiffer, V., Prigione, A. Assessing the bioenergetic profile of human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 1264, 279-288 (2015).
- Ludikhuize, M. C., Meerlo, M., Burgering, B. M. T., Colman, R. M. J. Protocol to profile the bioenergetics of organoids using Seahorse. STAR Protocols. 2 (1), 100386 (2021).
- Menacho, C., Prigione, A. Tackling mitochondrial diversity in brain function: from animal models to human brain organoids. International Journal of Biochemestry & Cell Biology. 123, 105760 (2020).
- Del Dosso, A., Urenda, J. P., Nguyen, T., Quadrato, G. Upgrading the physiological relevance of human brain organoids. Neuron. 107 (6), 1014-1028 (2020).
