Generation av mänskliga hjärnorganoider för mitokondriell sjukdom modellering
Summary
Vi beskriver ett detaljerat protokoll för generering av mänskliga inducerade pluripotenta stamcell-härledda hjärnan organoider och deras användning i modellering mitokondriell sjukdomar.
Abstract
Mitokondriella sjukdomar representerar den största klassen av medfödda fel i ämnesomsättningen och är för närvarande obotliga. Dessa sjukdomar orsakar neurodevelopmental defekter vars underliggande mekanismer återstår att klargöra. En stor vägspärr är bristen på effektiva modeller recapitulating den tidiga debuten neuronal nedskrivningar sett hos patienterna. Framsteg inom tekniken för inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) möjliggör generering av tredimensionella (3D) hjärnorganoider som kan användas för att undersöka effekterna av sjukdomar på nervsystemets utveckling och organisation. Forskare, inklusive dessa författare, har nyligen introducerat mänskliga hjärnorganoider för att modellera mitokondriella störningar. Detta dokument rapporterar ett detaljerat protokoll för robust generering av mänskliga iPSC-härledda hjärnan organoider och deras användning i mitokondriell bioenergetic profilering och imaging analyser. Dessa experiment kommer att tillåta användning av hjärnan organoider att undersöka metabola och utvecklingsmässiga dysfunktioner och kan ge avgörande information för att dissekera neuronal patologi av mitokondriella sjukdomar.
Introduction
Mitokondriella sjukdomar representerar den största klassen av medfödda fel i ämnesomsättningen1. De orsakas av genetiska mutationer som stör olika mitokondriella processer, inklusive oxidativ fosforylering (OXPHOS)2, andningskedjemontering, mitokondriell dynamik och mitokondriell DNA-transkription eller replikering3. Vävnader med energibehov påverkas särskilt av mitokondriell dysfunktion4. Följaktligen utvecklar patienter med mitokondriella sjukdomar vanligtvis tidiga neurologiska manifestationer.
Det finns för närvarande inga behandlingar tillgängliga för barn som drabbats av mitokondriella sjukdomar5. Ett stort hinder för läkemedelsutveckling av mitokondriella sjukdomar är bristen på effektiva modeller som rekapitulerar den mänskliga sjukdomskursen6. Flera av de för närvarande studerade djurmodellerna uppvisar inte de neurologiska defekter som finns hos patienterna7. Därför är mekanismerna bakom den neuronala patologin av mitokondriella sjukdomar fortfarande inte helt förstådda.
Nyligen genomförda studier genererade iPSCs från patienter som drabbats av mitokondriella sjukdomar och använde dessa celler för att erhålla patientspecifika neuronala celler. Till exempel har genetiska defekter associerade med mitokondriell sjukdom, Leigh syndrom, visat sig orsaka avvikelser i cellulära bioenergetik8,9, proteinsyntes10 och kalciumhomeostas9,11. Dessa rapporter gav viktiga mekanistiska ledtrådar om neuronal nedskrivningar förekommer i mitokondriella sjukdomar, banar väg för läkemedelsupptäckt för dessa obotliga sjukdomar12.
Tvådimensionella (2D) kulturer möjliggör dock inte undersökningen av den arkitektoniska komplexiteten och den regionala organisationen av 3D-organ13. För detta ändamål kan användningen av 3D-hjärnorganoider som härrör från patientspecifika iPSCs14 göra det möjligt för forskare att få ytterligare viktig information och därmed bidra till att dissekera hur mitokondriella sjukdomar påverkar nervsystemets utveckling och funktion15. Studier som använder iPSC-härledda hjärnorganoider för att undersöka mitokondriella sjukdomar börjar avslöja de neurodevelopmentala komponenterna i mitokondriella sjukdomar.
Ryggmärg organoider bär mutationer som är associerade med mitokondriell sjukdom, mitokondriell encefalopati, mjölksyra acidos och stroke-liknande episoder syndrom (MELAS), visade defekt neurogenesis och fördröjd motor neuron differentiering16. Närorganoider härrör från patienter med mitokondriell sjukdom, Leigh syndrom, visade minskad storlek, defekter i neurala epitelial bud generation och förlust av när arkitektur17. Hjärnan organoider från Leigh syndrom patienter visade att sjukdomen defekter initiera på nivån av neurala stamceller, som inte kan förbinda sig till mitokondriell metabolism, orsakar avvikande neuronal förgrening och morfogenesi18. Således kan neurala stamceller representera ett cellulärt terapeutiskt mål för mitokondriella sjukdomar, och strategier som främjar deras mitokondriella funktion kan stödja nervsystemets funktionella utveckling.
Användningen av hjärnan organoider kan hjälpa till att avslöja neurodevelopmental komponenter av mitokondriella sjukdomar. Mitokondriella sjukdomar anses främst vara tidiga neurodegeneration5. Neurodevelopmental defekter finns dock också hos patienter som drabbats av mitokondriella sjukdomar, inklusive utvecklingsmässiga dröjsmål och kognitiv svikt19. Patientspecifika hjärnorganoider kan hjälpa till att ta itu med dessa aspekter och belysa hur mitokondriella sjukdomar kan påverka människans hjärnutveckling. Mitokondriell dysfunktion kan också spela en patogenetisk roll i andra vanligare neurologiska sjukdomar, såsom Alzheimers sjukdom, Parkinsons sjukdom och Huntingtons sjukdom4. Därför kan klargöra effekterna av mitokondriella defekter i neuroutveckling med hjälp av hjärnan organoider också vara avgörande för studien av dessa sjukdomar. Detta dokument beskriver ett detaljerat protokoll för att generera reproducerbara hjärnan organoider som kan användas för att genomföra sjukdom modellering av mitokondriella sjukdomar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta dokument beskriver reproducerbar generering av mänskliga iPSC-härledda hjärnan organoider och deras användning för mitokondriell sjukdom modellering. Protokollet som beskrivs här ändras baserat på ett tidigare publicerat verk20. En stor fördel med det nuvarande protokollet är att det inte kräver manuell inbäddning av varje organoid i en byggnadsställningsmatris. Faktum är att matrislösningen helt enkelt löses upp i cellodlingsmediet. Dessutom finns det inget behov av att anv?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Miriam Bünning för teknisk support. Vi bekräftar stöd från Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (PR1527/5-1 till A.P.), Spark och Berlin Institute of Health (BIH) (BIH Validation Funds to A.P.), United Mitochondrial Disease Foundation (UMDF) (Leigh Syndrome International Consortium Grant to A.P.), University Hospital Duesseldorf (Forschungskommission UKD till A.P.) och det tyska federala ministeriet för utbildning och forskning (BMBF) (Leigh Syndrome International Consortium Grant to A.P.), University Hospital Duesseldorf (Forschungskommission UKD till A.P.) och det tyska federala ministeriet för utbildning och forskning (BMBF) (BDF) (Leigh Syndrome International Consortium Grant to A.P.), University Hospital Duesseldorf (Forschungskommission UKD till A.P.) och det tyska federala ministeriet för utbildning och forskning (BMBF) (BMBF) (Leigh Syndrome International Consortium Grant to A.P.), University Hospital Duesseldorf (Forschungskommission UKD till A.P.) och det tyska federala ministeriet för utbildning och forskning (BMBF) (BMBF) (Leigh Syndrome International Consortium Grant to A.P.), University Hospital Duesseldorf (Forschungskommission UKD till A.P.) och det tyska federala ministeriet för utbildning och forskning (BMBF) (BMBF) (Leigh Syndrome International Consortium Grant to A.P.), University Hospital Duesseldorf (Forschungskommission UKD till A.P.) och Det tyska federala ministeriet för utbildning och forskning (BMBF Bio young investigator bevilja AZ 031L0211 till A.P.). Arbetet i laboratoriet för C.R.R. stöddes av DFG (FOR 2795 “Synapses under stress”, Ro 2327/13-1).
Materials
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| Affinity Designer | Serif (Europe) Ltd | Layout software; Vector graphics editor | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig | Sigma Aldrich | SAB4600033-250UL | 1:300 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse | Thermo Fisher Scientific | A-31571 | 1:300 |
| Antimycin A | Sigma Aldrich | 1397-94-0 | |
| Anti-β-Tubulin III (TUJ-1) | Sigma Aldrich | T8578 | 1:2000 |
| Argon Laser | Melles Griot | Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 488 is fine, too | |
| Ascorbic acid | Sigma | A92902 | |
| B-27 with Vitamin A | Gibco | 17504044 | |
| Bacto Agar | Becton Dickinson | 3% in PBS, store solution at -20 °C | |
| BDNF | Miltenyi Biotec | 130-093-0811 | |
| cAMP | Sigma | D0627 | |
| Cell Star cell culture 6 well plate | Greiner-Bio-One | 657160 | |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Gibco | 11905031 | |
| Confocal laser scanning microscope C1 | Nikon Microscope Solutions | Modular confocal microscope system | |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement membrane matrix, Phenol Red-free, LDEV-free | Corning | 356231 | Matrix component |
| CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit | Thermo Fisher | C7026 | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher | 31330038 | |
| DMSO | Sigma | D2660-100ML | |
| Donkey anti-goat Cy3 | Merck Millipore | AP180C | 1:300 |
| Donkey anti-mouse Cy3 | Merck Millipore | AP192C | 1:300 |
| Donkey anti-rabbit Cy3 | Merck Millipore | AP182C | 1:300 |
| DPBS | Gibco | 14190250 | |
| DS-Q1Mc camera | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse 90i upright widefield microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse E 600FN upright microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse Ts2 Inverted Microscope | Nikon Microsope Solutions | ||
| EZ-C1 Silver Version 3.91 | Nikon Microscope Solutions | Imaging software for confocal microscope | |
| FCCP | Sigma Aldrich | 370-86-5 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| GDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-291 | |
| Glasgow MEM | Gibco | 11710-035 | |
| Glass Pasteur pipette | Brand | 747715 | Inverted |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| Helium-Neon Laser | Melles Griot | Every other Laser, e.g., diode lasers emitting 594 is fine, too | |
| Heparin | Merck | H3149-25KU | |
| HERACell 240i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026331 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | 1:2500 |
| Image J 1.53c | Wayne Rasband National Institute of Health | Image processing Software | |
| Injekt Solo 10 mL/ Luer | Braun | 4606108V | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco | 10828010 | |
| Laser (407 nm) | Coherent | Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 407 is fine, too | |
| Map2 | Synaptic Systems | No. 188004 | 1:1000 |
| Maxisafe 2030i | |||
| MEM NEAA | Gibco | 11140-050 | |
| mTeSR Plus | Stemcell Technology | 85850 | iPSC medium |
| Multifuge X3R Centrifuge | Thermo Scientific | 10325804 | |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | # LT07-218 | |
| N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Needle for single usage (23G x 1” TW) | Neoject | 10016 | |
| NIS-Elements Aadvanced Research 3.2 | Nikon | Imaging software | |
| Oligomycin A | Sigma Aldrich | 75351 | |
| Orbital Shaker Heidolph Unimax 1010 | Heidolph | 543-12310-00 | |
| PAP Pen | Sigma | Z377821-1EA | To draw hydrophobic barrier on slides. |
| Papain Dissociation System kit | Worthington | LK003150 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 818715 | 4% in PBS, store solution at -20 °C |
| Pasteur pipette 7mL | VWR | 612-1681 | Graduated up to 3 mL |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Plan Apo VC 20x / 0.75 air DIC N2 ∞/0.17 WD 1.0 | Nikon Microscope Solutions | Dry Microscope Objective | |
| Plan Apo VC 60x / 1.40 oil DIC N2 ∞/0.17 WD 0.13 | Nikon Microscope Solutions | Oil Immersion Microscope Objective | |
| Polystyrene Petri dish (100 mm) | Greiner Bio-One | 664161 | |
| Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap (5 mL) | Falcon | 352235 | |
| Potassium chloride | Roth | 6781.1 | |
| ProLong Glass Antifade Moutant | Invitrogen | P36980 | |
| Qualitative filter paper | VWR | 516-0813 | |
| Rock Inhibitior | Merck | SCM075 | |
| Rotenone | Sigma | 83-794 | |
| S100β | Abcam | Ab11178 | 1:600 |
| SB-431542 | Cayman Chemical Company | 13031 | |
| Scalpel blades | Heinz Herenz Hamburq | 1110918 | |
| SMI312 | Biolegend | 837904 | 1:500 |
| Sodium bicarbonate | Merck/Sigma | 31437-1kg-M | |
| Sodium chloride | Roth | 3957 | |
| Sodium dihydrogen phosphate | Applichem | 131965 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| SOX2 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-17320 | 1:100 |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco/StemPro | A1110501 | Reagent A |
| Super Glue Gel | UHU | 63261 | adhesive gel |
| SuperFrost Plus | VWR | 631-0108 | |
| Syringe for single usage (1 mL) | BD Plastipak | 300015 | |
| TB2 Thermoblock | Biometra | ||
| TC Plate 24 Well | Sarstedt | 83.3922 | |
| TC Plate 6 Well | Sarstedt | 83.392 | |
| TGFbeta3 | Miltenyi Biotec | 130-094-007 | |
| Tissue Culture Hood | ThermoFisher | 51032711 | |
| TOM20 | Santa Cruz Biotechnology | SC-11415 | 1:200 |
| Triton-X | Merck | X100-5ML | |
| UltraPure 0.5M EDTA | Invitrogen | 15575020 | |
| Vibratome Microm HM 650 V | Thermo Scientific | Production terminated, any other adjustable microtome is fine, too. | |
| Vibratome Wilkinson Classic Razor Blade | Wilkinson Sword | 70517470 | |
| Whatman Benchkote | Merck/Sigma | 28418852 | |
| Wnt Antagonist I | EMD Millipore Corp | 3378738 | |
| XF 96 extracellular flux analyser | Seahorse Bioscience | 100737-101 | |
| XF Assay DMEM Medium | Seahorse Bioscience | 103680-100 | |
| XF Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
| XFe96 FluxPak (96-well microplate) | Seahorse Bioscience | 102416-100 |
References
- Koopman, W. J., Willems, P. H., Smeitink, J. A. Monogenic mitochondrial disorders. New England Journal of Medicine. 366 (12), 1132-1141 (2012).
- Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Review Disease Primers. 2, 16080 (2016).
- Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature. 491 (7424), 374-383 (2012).
- Carelli, V., Chan, D. C. Mitochondrial DNA: impacting central and peripheral nervous systems. Neuron. 84 (6), 1126-1142 (2014).
- Russell, O. M., Gorman, G. S., Lightowlers, R. N., Turnbull, D. M. Mitochondrial diseases: hope for the future. Cell. 181 (1), 168-188 (2020).
- Weissig, V. Drug development for the therapy of mitochondrial diseases. Trends in Molecular Medicine. 26 (1), 40-57 (2020).
- Tyynismaa, H., Suomalainen, A. Mouse models of mitochondrial DNA defects and their relevance for human disease. EMBO Reports. 10 (2), 137-143 (2009).
- Ma, H., et al. Metabolic rescue in pluripotent cells from patients with mtDNA disease. Nature. 524 (7564), 234-238 (2015).
- Galera-Monge, T., et al. Mitochondrial dysfunction and calcium dysregulation in Leigh syndrome induced pluripotent stem cell derived neurons. International Journal of Molecular Science. 21 (9), 3191 (2020).
- Zheng, X., et al. Alleviation of neuronal energy deficiency by mTOR inhibition as a treatment for mitochondria-related neurodegeneration. Elife. 5, 13378 (2016).
- Lorenz, C., et al. Human iPSC-derived neural progenitors are an effective drug discovery model for neurological mtDNA disorders. Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).
- Inak, G., et al. Concise review: induced pluripotent stem cell-based drug discovery for mitochondrial disease. Stem Cells. 35 (7), 1655-1662 (2017).
- Chiaradia, I., Lancaster, M. A. Brain organoids for the study of human neurobiology at the interface of in vitro and in vivo. Nature Neuroscience. 23 (12), 1496-1508 (2020).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocol. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Liput, M., et al. Tools and approaches for analyzing the role of mitochondria in health, development and disease using human cerebral organoids. Developmental Neurobiology. , (2021).
- Winanto, K. Z. J., Soh, B. S., Fan, Y., Ng, S. Y. Organoid cultures of MELAS neural cells reveal hyperactive Notch signaling that impacts neurodevelopment. Cell Death and Disease. 11 (3), 182 (2020).
- Romero-Morales, A. I., et al. Human iPSC-derived cerebral organoids model features of Leigh Syndrome and reveal abnormal corticogenesis. bioRxiv. , (2020).
- Inak, G., et al. Defective metabolic programming impairs early neuronal morphogenesis in neural cultures and an organoid model of Leigh syndrome. Nature Communications. 12 (1), 1929 (2021).
- Falk, M. J. Neurodevelopmental manifestations of mitochondrial disease. Journal of Developmental & Behavioral Pediatrics. 31 (7), 610-621 (2010).
- Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
- Pfiffer, V., Prigione, A. Assessing the bioenergetic profile of human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 1264, 279-288 (2015).
- Ludikhuize, M. C., Meerlo, M., Burgering, B. M. T., Colman, R. M. J. Protocol to profile the bioenergetics of organoids using Seahorse. STAR Protocols. 2 (1), 100386 (2021).
- Menacho, C., Prigione, A. Tackling mitochondrial diversity in brain function: from animal models to human brain organoids. International Journal of Biochemestry & Cell Biology. 123, 105760 (2020).
- Del Dosso, A., Urenda, J. P., Nguyen, T., Quadrato, G. Upgrading the physiological relevance of human brain organoids. Neuron. 107 (6), 1014-1028 (2020).
