Studi di interazioni Chaperone-Cochaperone utilizzando il saggio omogeneo basato su perle

Summary

Questo protocollo presenta una tecnica per sondare le interazioni proteina-proteina utilizzando perle donatrici legate al glutatione con co-chaperoni tPR fusi GST e perle accettori accoppiate con un peptide derivato da Hsp90. Abbiamo usato questa tecnica per lo screening di piccole molecole per interrompere le interazioni Hsp90-FKBP51 o Hsp90-FKBP52 e identificato inibitori di interazione Hsp90-FKBP51 potenti e selettivi.

Abstract

Il targeting delle interazioni con la proteina 90 (Hsp90)-cochaperone offre la possibilità di regolare specificamente i processi intracellulari Hsp90-dipendenti. Il pentapeptide MEEVD conservato al C-terminus di Hsp90 è responsabile dell’interazione con il motivo della ripetizione tetratricopeptidica (TPR) dei co-chaperoni. La proteina legante FK506 (FKBP) 51 e FKBP52 sono due co-chaperoni simili con motivo TPR coinvolti in malattie steroidee ormono-dipendenti con funzioni diverse. Pertanto, l’identificazione di molecole che bloccano specificamente le interazioni tra Hsp90 e FKBP51 o FKBP52 fornisce un potenziale terapeutico promettente per diverse malattie umane. Qui, descriviamo il protocollo per un saggio omogeneo di prossimità luminescente amplificato per sondare le interazioni tra Hsp90 e i suoi co-accompagnatori partner FKBP51 e FKBP52. In primo luogo, abbiamo purificato le proteine contenenti il motivo TPR FKBP51 e FKBP52 in forma di glutatione S-transferasi (GST). Utilizzando le perle donatrici legate al glutatione con proteine TPR-motif fuse GST e le perle accettori accoppiate con un peptide C-terminale 10 mer di Hsp90, abbiamo sondato le interazioni proteina-proteina in un ambiente omogeneo. Abbiamo utilizzato questo test per lo screening di piccole molecole per interrompere le interazioni Hsp90-FKBP51 o Hsp90-FKBP52 e identificato inibitori di interazione Hsp90-FKBP51 potenti e selettivi.

Introduction

Gli chaperoni molecolari contribuiscono all’omeostasi delle proteine, compreso il ripiegamento, il trasporto e la degradazione delle proteine. Regolano diversi processi cellulari e sono legati a numerose malattie come il cancro e le malattie neurodegenerative¹. Heat shock protein 90 (Hsp90) è uno dei più importanti chaperoni la cui funzione dipende dai cambiamenti conformazionali guidati dall’idrolisi dell’ATP e dal legame con le proteine client mediate dai suoi co-chaperoni². Nonostante un evidente potenziale di Hsp90 come bersaglio terapeutico, la messa a punto della sua funzione rappresenta una grande sfida. Esistono diversi inibitori di Hsp90 che prendono di mira la regione di legame con l’ATP N-terminale, che sono stati valutati in studi clinici, ma nessuno di essi è stato approvato per la^{commercializzazione 3}. A causa della mancanza di una tasca legante ben^{definita 4}, mirata alla regione C-terminale di Hsp90 ha avuto un successo limitato⁴. Recentemente, l’interruzione delle interazioni Hsp90-cochaperone da parte di piccole molecole è stata studiata come strategia alternativa⁵. Il targeting delle interazioni Hsp90-cochaperone non susciterebbe una risposta generale allo stress cellulare e offre la possibilità di regolare specificamente vari processi intracellulari. Il pentapeptide MEEVD conservato al C-terminus di Hsp90 è responsabile dell’interazione con il motivo della ripetizione tetratricopeptidica (TPR) dei co-chaperoni⁶. Delle 736 proteine contenenti motivi TPR annotate nel database delle proteine umane, ~ 20 diverse proteine interagiscono con Hsp90 tramite questo peptide⁷. Le molecole che competono per il legame peptidico MEEVD interromperebbero le interazioni tra Hsp90 e co-chaperoni contenenti un dominio TPR. Il sito di legame peptidico ha una struttura terziaria simile, ma l’omologia complessiva tra diversi domini del motivo TPR è relativamente bassa⁷, fornendo l’opportunità di identificare molecole specificamente in grado di bloccare le interazioni tra Hsp90 e particolari co-chaperoni del motivo TPR. Tra questi co-chaperoni del motivo TPR, la proteina legante FK506 (FKBP) 51 e FKBP52 sono regolatori della segnalazione del recettore dell’ormone steroideo (SHR) e coinvolti in diverse malattie steroidee ormono-dipendenti tra cui cancro, malattie legate allo stress, malattie metaboliche e morbo di Alzheimer⁸. Sebbene FKBP51 e FKBP52 condividano > somiglianza di sequenza dell’80%, le loro funzioni differiscono: FKBP52 è un regolatore positivo dell’attività SHR, mentre FKBP51 è un regolatore negativo nella maggior parte dei casi⁸. Pertanto, l’identificazione delle molecole, bloccando in particolare le interazioni tra Hsp90 e FKBP51 o FKBP52, fornisce un potenziale terapeutico promettente per le malattie correlate.

Unsaggio Luminescente Pomogeno A(AlphaScreen) è stato sviluppato per la prima volta nel 1994 da Ullman EF et al.⁹. Ora è ampiamente usato per rilevare diversi tipi di interazioni biologiche, come il peptide¹⁰, la proteina¹¹, il DNA¹², l’RNA¹³e lo zucchero¹⁴. In questa tecnica, ci sono due tipi di perle (diametro 200 nm), una è la perle donatrice e l’altra è la perle accettore. Le biomolecole sono immobilizzate su queste perle; le loro interazioni biologiche portano le perle del donatore e dell’accettore nelle vicinanze. A 680 nm, un fotosensibilizzatore nel cordone donatore illumina e converte l’ossigeno in ossigeno singoletto. Poiché l’ossigeno singoletto ha una vita breve, può diffondersi solo fino a 200 nm. Se il perle accettore è in prossimità, il suo derivato tiosseno reagisce con l’ossigeno singoletto generando chemiluminescenza a 370 nm. Questa energia attiva ulteriormente i fluorofori nello stesso perle accettore per emettere luce a 520-620 nm¹⁵. Se le interazioni biologiche vengono interrotte, il perno accettore e il perno donatore non possono raggiungere la vicinanza, con conseguente decadimento dell’ossigeno singoletto e segnale basso prodotto.

Qui descriviamo un protocollo che utilizza questa tecnica per lo screening di piccole molecole che inibiscono le interazioni tra co-chaperoni Hsp90 e TPR, in particolare FKBP51 e FKBP52. I 10 peptidi lunghi di amminoacidi corrispondenti a Hsp90 estremo C-terminus sono attaccati a perline accettori. I co-chaperoni TPR purificati con tag GST interagiscono con le perle di donatore legate al glutatione. Quando l’interazione tra peptidi derivati da Hsp90 e co-chaperoni del motivo TPR riunisce le perle, viene prodotto un segnale amplificato (Figura 1A). Se le piccole molecole schermate possono inibire le interazioni tra Hsp90 e co-chaperoni del motivo TPR, questo segnale amplificato sarà diminuito (Figura 1B). Il loro IC₅₀ può essere calcolato mediante misurazione quantitativa. Questo protocollo può essere esteso a qualsiasi interazione di co-chaperone chaperone chaperone – TPR-motif ed è di grande importanza nello sviluppo di nuove molecole, bloccando in particolare l’interazione tra Hsp90 e FKBP51 o FKBP52.

Figura 1: Il principio di base di questo saggio. (A) GST-FKBP51 purificato interagisce con le perle donatrici legate al glutatione. I 10 peptidi lunghi di amminoacidi corrispondenti all’estremo C-terminus di Hsp90 sono attaccati alle perle accettori. L’interazione tra i peptidi derivati da Hsp90 e il dominio TPR di FKBP51 porta le perle del donatore e dell’accettore in prossimità. A 680 nm, un fotosensibilizzatore nel cordone donatore illumina e converte l’ossigeno in ossigeno singoletto. Il derivato tiossene sul perle accettore reagisce con l’ossigeno singoletto e genera chemiluminescenza a 370 nm. Questa energia attiva ulteriormente i fluorofori nello stesso perle accettore per emettere luce a 520-620 nm. (B) Quando piccole molecole inibiscono le interazioni tra Hsp90 e FKBP51, le perle del donatore e dell’accettore non possono raggiungere la prossimità. Quindi l’ossigeno singoletto con breve durata decade e non viene prodotto alcun segnale rilevabile. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocol

NOTA: una panoramica di questo protocollo è illustrata nella Figura 2. 1. Espressione e purificazione di GST-FKBP51 e GST-FKBP52 (Figura 2A) PlasmidiNOTA: Ottenere cDNA cloni per FKBP51 umano (id clone: 5723416) e per FKBP52 umano (id clone: 7474554) dal consorzio IMAGE. Amplificare il DNA umano FKBP51 mediante PCR con primer (in avanti; 5’GGATCCATGACTACTGATGAAGGT-3′, inverso; 5′-CTCGAGCTATGCTT…

Representative Results

Nel nostro test, il fattore Z e il rapporto S/B sono rispettivamente 0,82 e 13,35 (Figura 3A), dimostrando che il nostro test è robusto e affidabile per lo screening ad alto rendimento. L’abbiamo quindi usato per lo screening di piccoli composti di massa molecolare. La Figura 3B presenta l’inibizione dose-dipendente delle interazioni chaperone-cochaperone con una piccola molecola selezionata (D10). Le curve dose-risposta per D10 sono generate dall’analisi di re…

Discussion

Qui descriviamo un protocollo che utilizza il test per lo screening di piccole molecole che inibiscono le interazioni tra I co-chaperoni Hsp90 e TPR, in particolare FKBP51 e FKBP52. Il suo punteggio Z’ elevato (>0,8) dimostra la robustezza e l’affidabilità per un formato ad alto throughput. I risultati possono essere ottenuti entro un’ora e sono necessarie piccole quantità di perle, proteine e composti. Inoltre, questo protocollo potrebbe essere facilmente esteso a qualsiasi interazione di co-chaperone Hsp90/Hsp70 – TP…

Materials

384-well plates	Perkin Elmer	6008350	Assay volume 25 ml
Amicon 10.000 MWCO centrifugation unit	Millipore	UFC901008	Concentrate protein
Ampicillin	Sigma	A0166	Antibiotics
Bacteria shaker Unimax 1010	Heidolph		Culture bacteria
cDNA clones for human FKBP51	Source BioScience	clone id: 5723416	pCMV-SPORT6 vector
cDNA clones for human FKBP52	Source BioScience	clone id: 7474554	pCMV-SPORT6 vector
Chemically Competent E. coli	Invitrogen	C602003	One Shot BL21 Star (DE3)
Data analysis software	GraphPad Prism	9.0.0	Analysis data and make figures
Data analysis software	Excel		Analysis data
DMSO	Supelco	1.02952.1000	Dilute compounds
DPBS	Gibco	14190-144	Prepare solution
EDTA	Calbiochem	344504	Prevent proteolysis during sonication
Glutathione	Sigma	G-4251	Elute GST-tagged proteins
Glutathione donor beads	Perkin Elmer	6765300	Donor bead
GST-trap column	Cytiva (GE Healthcare)	17528201	Purify GST-tagged proteins
Isopropyl-β-D-thiogalactoside	Thermo Fisher Scientific	R0392	Induce protein expression
LB Broth (Miller)	Sigma	L3522	Microbial growth medium
PCR instrument	BIO-RAD	S1000 Thermal Cycler	Amplification/PCR
PD-10 column	Cytiva (GE Healthcare)	17085101	Solution exchange
pGEX-6P-1 vector	Cytiva (GE Healthcare)	28954648	Plasmid
pGEX-6P-2 vector	Cytiva (GE Healthcare)	28954650	Plasmid
Plate reader	Perkin Elmer	EnSpire 2300 Multilabel Reader	Read alpha plate
Plate reader software	Perkin Elmer	EnSpire Manager	Plate reader software
Plate reader software protocol	Perkin Elmer	Alpha 384-well Low volume	Use this protocol to read plate
PMSF	Sigma	P7626	Prevent proteolysis during sonication
protease inhibitor cocktail	Sigma	S8830	Prevent proteolysis during sonication
Sodium azide	Sigma	S2002	As a preservative
Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN)	Sigma	156159	Activates matrix for coupling
Ten amino acid peptide NH2-EDASRMEEVD-COOH corresponding to amino acids 714-724 of human Hsp90 beta isoform	Peptide 2.0 inc		Synthesize Hsp90 C-terminal peptide
Test-Tube Rotator	LABINCO		Make end-over-end agitation
Tris-HCl	Sigma	10708976001	Block unreacted sites of acceptor beads
Tween-20	Sigma	P1379	Prevent beads aggregation
Ultra centrifuge Avanti J-20 XP	Beckman Coulter		Centrifuge to get bacteria cell pellets
Ultrasonic cell disruptor	Microson		Sonicate cells to release protein
Unconjugated acceptor beads	Perkin Elmer	6762003	Acceptor beads
XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module	Invitrogen	EI0002	SDS-PAGE