Summary
Эмбриологические манипуляции, такие как экстирпация и трансплантация клеток, являются важными инструментами для изучения раннего развития. Этот протокол описывает простое и эффективное устройство трансплантации для выполнения этих манипуляций у эмбрионов рыбок данио.
Abstract
Классические эмбриологические манипуляции, такие как удаление клеток и трансплантация клеток внутри или между эмбрионами, являются мощными методами изучения сложных процессов развития. Эмбрионы рыбок данио идеально подходят для этих манипуляций, так как они легко доступны, относительно велики по размеру и прозрачны. Однако ранее разработанные устройства для удаления и трансплантации клеток громоздки в использовании или дороги в покупке. Напротив, представленное здесь устройство для трансплантации экономично, просто в сборке и использовании. В этом протоколе мы сначала представляем обработку устройства для трансплантации, а также его сборку из коммерчески и широко доступных деталей. Затем мы представляем три приложения для его использования: генерация эктопических клонов для изучения рассеивания сигнала из локализованных источников, истребление клеток для производства эмбрионов с уменьшенным размером и трансплантация зародышевой линии для генерации материнских зиготных мутантов. Наконец, мы показываем, что инструмент также может быть использован для эмбриологических манипуляций у других видов, таких как японская рисовая рыба медака.
Introduction
Из классических экспериментов Мангольда и Спемана, продемонстрировавших существование организатора, инструктирующего формирование эмбриональной оси1, трансплантация клеток между эмбрионами стала устоявшейся методикой изучения эмбрионального развития2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Широко используемая установка для трансплантации состоит из газонепроницаемого шприца с микрометровым приводом, соединенного с держателем микропипетки через гибкую трубку и резервуара, заполненного минеральным маслом12,13. В этой установке плунжер шприца перемещается через винт. Давление, создаваемое таким образом, переносится в микропипетку и используется для извлечения клеток из одного эмбриона и откладывания их в другой. Однако это устройство с гидравлическим приводом состоит из множества деталей и трудоемко собирается с нуля. Подобные устройства также можно приобрести в виде полного рабочего комплекта, обычно продаваемого как ручные микроинжекторы, и эти коммерческие версии обычно стоят более 1500 долларов США. Как в самодельном, так и в коммерческом варианте микропипетка для манипуляций с эмбрионами отделена от устройства, генерирующего давление (газонепроницаемого шприца) через маслонаполненную трубку. Манипуляции с микропипеткой и движение плунжера, следовательно, должны управляться отдельно разными руками, уменьшая пропускную способность и полезность. Кроме того, устройства громоздки для подготовки к трансплантации, так как трубки должны быть тщательно заполнены маслом, избегая образования пузырьков. Здесь мы описываем альтернативное пневматическое устройство для удаления и трансплантации клеток, которое является недорогим, простым в сборке и простым в использовании.
Представленное здесь устройство содержит газонепроницаемый шприц объемом 25 мкл, оснащенный держателем для микропипетки, и стоит в общей сложности менее 80 долларов США. Устройство легко собирается путем вставки держателя микропипетки в шприц с помощью фиксатора Luer (рисунок 1A). Затем устройство устанавливается непосредственно на микроманипулятор, что позволяет пользователю контролировать как его положение, так и всасывание одной рукой непосредственно на микроманипуляторе. Это удобно оставляет другую руку свободной для стабилизации и перемещения трансплантационной тарелки, содержащей донорские и принимающие эмбрионы. Устройство работает путем прямого всасывания воздухом и не нуждается в заполнении минеральным маслом. Из-за сил притяжения между водой и стенками стеклянной иглы большое движение в поршене шприца переводится в меньшее движение уровня воды внутри иглы, если уровень воды находится в коническом конце стеклянной иглы. Это позволяет точно контролировать количество аспирированных ячеек и место их вставки.
Чтобы продемонстрировать полезность этого устройства, мы представляем три приложения для эмбрионов рыбок данио (Danio rerio). Во-первых, мы покажем, как генерировать локализованные источники секретируемых сигнальных молекул, которые могут быть использованы для изучения образования градиента2,4,6. Здесь донорским эмбрионам вводят мРНК, кодирующую флуоресцентно меченую сигнальную молекулу. Затем флуоресцентные донорские клетки трансплантируются эмбрионам-хозяевам дикого типа, где образование градиента сигнала может быть визуализировано и проанализировано. Во-вторых, мы описываем, как устройство может быть использовано для удаления клеток путем экстирпации с целью получения эмбрионов уменьшенного размера5,13. Наконец, мы показываем, как надежно производить матерински-зиготные мутанты путем трансплантации клеток, несущих первичный репортер зародышевых клеток, в эмбрионы-хозяева, в которых зародышевая линия была удалена6,10. В дальнейшем описанное здесь устройство для трансплантации может быть легко адаптировано к другим эмбриологическим манипуляциям, требующим удаления или трансплантации клеток.
Protocol
1. Сборка и использование устройства для трансплантации
- Сборка устройства для трансплантации.
- Соедините газонепроницаемый шприц Luer емкостью 25 мкл и держатель микропипетки с запорным фитингом Luer для сборки устройства трансплантации (рисунок 1A).
ПРИМЕЧАНИЕ: Смачивание наконечника Luer тонкой пленкой воды может помочь улучшить соединение, удерживая детали вместе с помощью адгезии и сцепления с водой. - Установите устройство непосредственно на ручной микроманипулятор (рисунок 1B). Устройством можно управлять только доминирующей рукой, освобождая другую руку для дополнительных задач.
- Соедините газонепроницаемый шприц Luer емкостью 25 мкл и держатель микропипетки с запорным фитингом Luer для сборки устройства трансплантации (рисунок 1A).
- Подготовка иглы для трансплантации.
- Изготовьте иглу для трансплантации, вытянув стеклянную капиллярную пипетку (без нити) с помощью съемника микропипетки.
- Разбейте кончик иглы как можно более плавно, так как острые края увеличивают вероятность расчесывания желтка во время пересадки, что смертельно для эмбриона.
ПРИМЕЧАНИЕ: Наконечник может быть легко сломан лезвием бритвы с прямым лезвием под стереомикроскопом. Однако использование микрокрапса позволяет генерировать точное отверстие нужного размера. Для генерации эктопического источника подходит наружный диаметр приблизительно 50-60 мкм. Для экстирпации и трансплантации зародышевой линии наружный диаметр иглы должен измеряться примерно 80-90 мкм, чтобы увеличить количество трансплантированных клеток. - Вставьте готовую к использованию иглу в устройство для трансплантации (рисунок 1А).
- Использование устройства для трансплантации.
- Поместите микроманипулятор с устройством трансплантации рядом со стереомикроскопом (рисунок 1B).
- Извлеките поршень и опустите иглу для трансплантации в тарелку для трансплантации, заполненную раствором Рингера (см. шаг 2.2.1) под углом 45° до погружения кончика иглы (рисунок 1B). Вода устремится вверх по игле из-за капиллярного действия.
- Вставьте плунжер примерно наполовину, чтобы промыть растворы Рингера, оставив только небольшой объем воды в тонкой, конической части иглы (рисунок 1С).
ПРИМЕЧАНИЕ: Это нейтральное положение, и уровень воды должен быть стабильным там некоторое время (>20 мин). Если уровень воды нестабилен, воздух протекает; повторно подключите замок Luer или замените шприц. - При использовании иглы для трансплантации в первый раз покройте ее внутреннюю часть, извлекая желток из принесенного в жертву эмбриона, а затем полностью изгоняя желточный материал. Покрытие поможет уменьшить прилипание клеток к стеклу во время последующих процедур.
- Аккуратно расположите донорский эмбрион с помощью иглы, а затем расположите отверстие иглы ортогонально к поверхности эмбриона (рисунок 1D).
ПРИМЕЧАНИЕ: Позиция будет отличаться для разных анализов. Для генерации источника эктопических сигнальных молекул и экстирпации клеток это будет вершина полюса животных (рисунок 1E); для трансплантации зародышевой линии это будет край (рисунок 1D,F). - Медленно и осторожно подтяните поршень, чтобы втянуть клетки в иглу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если клетки поглощаются слишком быстро, они могут быть повреждены. Если все сделано правильно, клетки должны выйти в виде цилиндрической колонки. Избегайте попадания желтка в иглу, так как пересаженный желток токсичен для эмбриона хозяина. - Остановите всасывание, осторожно толкнув плунжер немного вниз, как только нужное количество ячеек будет втянуто. Извлеките иглу из эмбриона, отдернув иглу в сторону коротким и быстрым движением. Оставьте немного раствора Рингера по обе стороны клеточного столба и ограничьте ячейки коническим концом иглы (рисунок 1C,D).
ПРИМЕЧАНИЕ: Жидкость перед клеточным столбом поможет раздвинуть клетки эмбрионов хозяина при депонировании клеточного столба. - Очистите оставшийся желток или обломки клеток, медленно перемещая поршень вверх и вниз - в то время как игла остается погруженной - чтобы промыть клетки раствором Рингера. Если все сделано правильно, неповрежденные клетки останутся склеенными вместе в колонне, в то время как мусор смывается.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе необходимо соблюдать большую осторожность, так как уровень воды будет подниматься выше конического конца иглы. Это вызовет внезапный приток воды, которую можно использовать для промывки клеток. Однако, как только уровень воды пройдет конический конец, тонкий контроль с помощью плунжера будет уменьшен, и плунжер должен перемещаться медленнее и тщательнее. - Переместите тарелку для трансплантации недоминирующей рукой, чтобы расположить иглу ортогонально к поверхности (либо животному полюсу, либо краю) эмбриона хозяина (рисунок 1D-F).
- Осторожно приложите небольшое давление, а затем сделайте быстрое, резкое движение, чтобы проткнуть обволакивающий слой эмбриона хозяина. Следите за тем, чтобы не поцарапать желток иглой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшое давление на эмбрион путем тщательного сжатия его к стенкам лунки увеличивает поверхностное натяжение эмбриона и, таким образом, облегчает прокалывание обволакивающего слоя. - Как только игла окажется внутри, осторожно толкните поршень, чтобы выдавить столб клеток в эмбрион, одновременно медленно втягивая иглу (рисунок 1D-F).
- Чистка трансплантационной иглы.
- Промойте иглу, перемещая поршень вверх и вниз, в то время как игла погружается в деионизированную воду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если игла остается грязной, промойте ее 10 М раствором гидроксида натрия, прежде чем снова промыть водой. - Храните иглу в соответствующей коробке для дальнейшего использования.
- Промойте иглу, перемещая поршень вверх и вниз, в то время как игла погружается в деионизированную воду.
2. Генерация эктопических источников секретируемых сигнальных молекул у эмбрионов рыбок данио
- Подготовка эмбрионов хозяина и донора.
- Собирайте свежезаложенные эмбрионы путем спаривания рыбок данио.
- Дехорионат 1-клеточной стадии эмбрионов рыбок данио путем инкубации до 100 эмбрионов в 0,5 мг/мл раствора проназы в течение примерно 15 мин в небольшой стеклянной чашке Петри (подробное описание этой процедуры было опубликовано Rogers, K. W. et al.14).
ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативно, эмбрионы также могут быть дехорионированы на высокой стадии непосредственно перед трансплантацией (этап 2.2), но для этого необходимо, чтобы введенные донорские эмбрионы и неинъекционные эмбрионы хозяина были дехорионированы отдельно. - Погрузите эмбрионы в эмбриональную среду в стакан объемом 200 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбрионы стадии деторионированных бластул и гаструл очень деликатны. Их открытый желток будет прилипать к пластиковым поверхностям и разрываться при контакте с воздухом. Следовательно, они должны оставаться полностью погруженными в эмбриональную среду, перенесенными со стеклянной пипеткой, и поддерживаться либо в пластиковой посуде с агарозовым покрытием (1% в эмбриональной среде), либо в стеклянных чашках Петри. - Осторожно опорожните большую часть эмбриональной среды и медленно заполните стакан свежей эмбриональной средой. Легкое возбуждение, вызванное таким образом, облегчит удаление ослабленных хорионов. Повторите этот шаг 2-3 раза.
- Перенесите дехорионированные эмбрионы с помощью стеклянной пипетки Пастера в инъекционную чашку, покрытую агарозой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пламение кончика стеклянной пипетки Пастера путем воздействия на нее пламени горелки Бунзена может расплавить и сгладить край, помогая предотвратить повреждение эмбрионов. - Ввести мРНК, кодирующую флуоресцентно помеченный белок, в подмножество эмбрионов (подробное описание этой процедуры было опубликовано Rogers, K. W. et al.14). Вводите мРНК в клетку, а не желток, для почти однородной экспрессии. Введенные эмбрионы будут служить донорами, в то время как неинъекционные эмбрионы будут служить хозяевами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество и тип вводимой мРНК будет зависеть от изучаемой сигнальной молекулы и обычно колеблется от 20 до 200 пг2,4,5,6 (но в некоторых случаях может достигать 1000 пг4). - Перенесите введенные эмбрионы в блюдо с шестью лунками, покрытое агарозой, наполненное эмбриональной средой. Инкубируйте при 28 °C до тех пор, пока эмбрионы не достигнут ранней стадии сферы.
- Трансплантация клеток для генерации эктопических источников.
- Наполните трансплантационную тарелку (отдельными треугольными клиновидными лунками, см. Таблицу материалов) раствором Рингера (116 мМ NaCl, 2,8 мМ KCl, 1 мМ CaCl2, 5 мМ HEPES; храните буфер HEPES при 4 °C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Кальций в растворе Рингера способствует клеточной адгезии и помогает эмбриону исцелиться после процедуры трансплантации. - Перенесите эмбрионы в тарелку для трансплантации.
- Поместите эмбрионы хозяина и донора в чередующиеся колонны, в каждом случае с шестом животного, ориентированным на иглу для трансплантации.
- Провести трансплантацию, как описано в разделе 1.3. Для трансплантации эктопического источника возьмите исходные клетки из верхней части полюса животного и поместите их в то же место в эмбрионе хозяина (рисунок 1E).
ПРИМЕЧАНИЕ: Промывка клеток раствором Рингера, как описано в шаге 1.3.8, важна для генерации эктопического источника, чтобы убедиться, что уже секретируемые сигнальные молекулы не переносятся к хозяину. Не пересаживайте слишком много клеток, чтобы убедиться, что источник не рассеивается. Колонна диаметром около 80 мкм и длиной 100 мкм подходит для многих применений. - Позвольте эмбриону-хозяину оставаться в растворе Рингера в течение 30 мин до 1 ч для восстановления.
- Изучите, были ли клетки успешно пересажены с помощью флуоресцентного стереомикроскопа (рисунок 2).
- После выздоровления перенесите эмбрионы в шестилуночную пластину с агарозным покрытием, заполненную эмбриональной средой, и инкубируйте их при 28 °C.
- Наполните трансплантационную тарелку (отдельными треугольными клиновидными лунками, см. Таблицу материалов) раствором Рингера (116 мМ NaCl, 2,8 мМ KCl, 1 мМ CaCl2, 5 мМ HEPES; храните буфер HEPES при 4 °C).
3. Генерация эмбрионов уменьшенного размера путем экстирпации клеток
- Подготовка эмбрионов к экстирпации.
- Соберите свежезаложенные эмбрионы рыбок данио нужного генотипа.
- Инкубируйте эмбрионы при 28 °C до тех пор, пока они не достигнут высокой стадии.
- Дехорионировать эмбрионы, как описано на этапах 2.1.2-2.1.5, когда эмбрионы достигают высокой стадии.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом примере экстирпация клеток выполняется на стадии сферы. Соответственно, эмбрионы дехорионизируют примерно на 30 мин до 1 ч раньше.
- Необязательно: маркировка синцитиального слоя желтка (YSL).
ПРИМЕЧАНИЕ: При желании вводят флуоресцентный декстранс в YSL перед уничтожением клеток. Эта методика позволяет определить, остается ли YSL неповрежденной после удаления клеток, что важно для нормального эмбриогенеза15. Альтернативно, синтезированные in vitro мРНК или белки также могут быть введены в YSL.- Используйте пипетку Пастера, чтобы перенести дехорионированные эмбрионы в инъекционную чашку с агарозным покрытием, наполненную эмбриональной водой.
- Ориентируйте эмбрионы сбоку, при этом край бластодермы указывает на инъекционную иглу (рисунок 3А).
- Введите 0,5 нл 1,5 мкг/мкл 10 кДа Alexa568-Dextran в YSL, стремясь к области между клетками бластодермы и желтком на глубине около одной трети диаметра эмбриона. Введите все эмбрионы в пределах одного ряда.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку инъекционную иглу не нужно прокалывать через хорион, преимущество имеет небольшое (~4 мкм) и острое отверстие. - Поверните эмбрионы на 180° так, чтобы противоположная сторона края бластодермы указывала на инъекционную иглу (рисунок 3А).
- Вводят еще 0,5 нл 1,5 мкг/мкл 10 кДа Alexa568-Декстрана в YSL, как описано на этапе 3.2.3, получая общий объем инъекции 1 нЛ на эмбрион.
ПРИМЕЧАНИЕ: Инъекция с двух сторон обеспечивает более равномерное распределение флуоресцентного декстрана в YSL. - Исследуйте результат инъекции под флуоресцентным стереомикроскопом. Если все сделано правильно, флуоресцентный сигнал будет ограничен YSL (рисунок 3B) и не будет виден в межклеточном пространстве бластодермы.
- Экстирпация клеток
- Наполните тарелку для трансплантации раствором Рингера (см. шаг 2.2.1).
- Перенесите эмбрионы в тарелку для трансплантации.
- Ориентируйте эмбрионы полюсом животного в сторону иглы для трансплантации (рисунок 3C).
- Осторожно удаляют клетки из области полюса животного, как описано в шагах 1.3.5-1.3.7, тем самым уменьшая бластодерму до желаемого размера.
- Выбросьте удаленные клетки, изгнав их из иглы для трансплантации.
- Как только процедура будет завершена, позвольте эмбрионам оставаться в растворе Рингера в течение 30 минут до 1 часа, чтобы восстановиться.
- ДОПОЛНИТЕЛЬНО: Проверьте целостность YSL под флуоресцентным стереомикроскопом (рисунок 3D).
- Перенесите эмбрионы в покрытую агарозой пластину, заполненную эмбриональной средой, и инкубируйте их при 28 °C.
4. Создание материнских зиготных мутантов путем трансплантации зародышевой линии
- Подготовка эмбрионов хозяина и донора.
- Собирайте свежезаложенные эмбрионы как мутантных, так и диких рыбок данио. Эмбрионы рыбок данио с мутантным фоном будут служить донорами, в то время как эмбрионы рыбок данио с диким фоном будут служить хозяевами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Трансплантация зародышевой линии требует большого количества стартовых эмбрионов (~ 50 для доноров, ~ 500 для хозяев), чтобы обеспечить большое количество успешных трансплантаций зародышевой линии, которые выживают во взрослой жизни. - Перенесите эмбрионы в пропитанную агарозой инъекционную чашку с эмбриональной средой с помощью пипетки Пастера.
ПРИМЕЧАНИЕ: Инъекции делаются перед дехорионацией для увеличения пропускной способности. Иглы для инъекций через хорион должны быть тупыми и иметь большее отверстие (~10 мкм), чтобы предотвратить засорение. - Вводят донорским эмбрионам 1 нЛ 100 нг/мкл мРНК, кодирующей GFP с nos1 3'UTR. Вводят мРНК в желток для увеличения пропускной способности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Nos1 3'UTR стабилизирует мРНК в первичных половых клетках, в результате чего половые клетки будут сильно флуоресцентными при изображении через 1 день после оплодотворения10. - Вводят эмбрионам-хозяевам 1 нл 0,33 мМ (3 мкг/мкл) тупикового (dnd) морфолино. Вводят морфолино в желток для увеличения пропускной способности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Морфолино dnd блокирует образование первичных половых клеток, что гарантирует, что зародышевая линия эмбриона-хозяина будет исключительно заселена клетками донора после трансплантации10. - Перенесите введенные эмбрионы в пластиковые чашки Петри с эмбриональной средой. Инкубировать при 28 °C до тех пор, пока эмбрионы не достигнут высокой стадии.
- Дехорионировать эмбрионы, как описано на этапах 2.1.2-2.1.5, когда эмбрионы достигают высокой стадии.
- Собирайте свежезаложенные эмбрионы как мутантных, так и диких рыбок данио. Эмбрионы рыбок данио с мутантным фоном будут служить донорами, в то время как эмбрионы рыбок данио с диким фоном будут служить хозяевами.
- Трансплантация половых клеток
- Наполните тарелку для трансплантации раствором Рингера (см. шаг 2.2.1).
- Перенесите дехорионированные сферические эмбрионы купольной стадии в тарелку для трансплантации.
- Поместите эмбрионы-хозяева и донорские эмбрионы в чередующиеся столбцы, чтобы пересадить клетки от одного донорского эмбриона к шести различным эмбрионам-хозяевам. Это увеличивает вероятность того, что половые клетки из данного эмбриона хозяина будут успешно пересажены.
- Ориентируйте эмбрионы с краем на иглу для трансплантации и проводите трансплантацию, как описано в разделе 1.3. Для трансплантации зародышевой линии (рисунок 1D, F) возьмите исходные клетки с края (где расположены первичные половые клетки) и поместите их в то же место в эмбрионе хозяина.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пересадка большой колонны (примерно 80 мкм в диаметре и 600 мкм в длину) увеличит шансы на получение успешной трансплантации зародышевой линии. - Позвольте эмбриону оставаться в растворе Рингера в течение 30 мин до 1 ч, чтобы восстановиться после завершения трансплантации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если не все донорские эмбрионы, как ожидается, будут гомозиготными мутантами - например, если они являются результатом гетерозиготного инкросса - они должны быть генотипированы после трансплантации, чтобы определить генотип трансплантированной будущей зародышевой линии хозяина. В этом случае убедитесь, что позиции эмбрионов хозяина и донора не смешиваются во время обработки. - Используйте флуоресцентный стереомикроскоп, чтобы проверить, были ли клетки успешно пересажены (рисунок 4A,B).
- Перенесите эмбрионы в 24-луночную пластину, покрытую агарозой. Сгруппируйте все эмбрионы-хозяева, которые получили клетки от одного и того же донора, в один и тот же колодец и метьте их соответствующим образом. Инкубируйте их до следующего дня при 28 °C.
- При необходимости перенесите донорские эмбрионы в меченые полоски ПЦР для генотипирования.
- Скрининг на успешную трансплантацию зародышевой линии
- Скрининг эмбрионов хозяина для успешной трансплантации зародышевой линии под флуоресцентным стереомикроскопом примерно через 30 ч после оплодотворения (HPF). Половые клетки находятся в канавке над расширением желтка (рисунок 4C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Типичные эксперименты с устройством и стратегией, представленными здесь, будут иметь показатель успеха ~ 60%-80% для получения по крайней мере одного эмбриона-хозяина, несущего трансплантированные половые клетки на донорский эмбрион. В предыдущем отчете описывалась эффективность ~10%10. - Если применимо, выбросьте эмбрионы, которые получили клетки от донорских эмбрионов с неправильным генотипом. Выращивайте личинок с успешно пересаженными половыми клетками во взрослую жизнь в соответствии со стандартными условиями животноводства и следуя институциональным рекомендациям.
- Скрининг эмбрионов хозяина для успешной трансплантации зародышевой линии под флуоресцентным стереомикроскопом примерно через 30 ч после оплодотворения (HPF). Половые клетки находятся в канавке над расширением желтка (рисунок 4C).
Representative Results
Успех и неудача в использовании устройства для трансплантации для трех применений, описанных выше, могут быть легко оценены путем визуального осмотра под стереомикроскопом. При успешных трансплантациях эмбрион должен выглядеть нормальным и похожим по форме и желточности на нетрансплантированные эмбрионы, без больших разрывов в бластодерме. Если эмбрион явно поврежден (рисунок 4B), он не будет развиваться нормально. В идеале трансплантированные клетки, экспрессирующие флуоресцентный маркер, должны выглядеть как непрерывная колонка при просмотре под флуоресцентным стереомикроскопом (рисунок 2А, рисунок 4А). Если столб фрагментирован, это указывает на то, что клетки были срезаны всасыванием в иглу для трансплантации или что осаждение клеток было сделано слишком энергично. Это можно предотвратить, перемещая поршень медленнее и мягко.
Хотя устройство для трансплантации в основном использовалось на эмбрионах рыбок данио на стадиях бластулы5,6, трансплантация и истребление клеток работают так же хорошо для дехорионированных эмбрионов бластулы японской рисовой рыбы медака (Oryzias latipes) (рисунок 2B). Помимо дехорионации эмбриона, которая была описана Porazinski, S. R. et al.17, можно следовать тем же процедурам, которые описаны выше.
В конкретном случае трансплантации зародышевой линии хорошая трансплантация приведет к появлению эмбриона с длинным горизонтальным столбом клеток непосредственно над краем желтка (рисунок 4А). Однако, были ли половые клетки успешно пересажены, можно оценить только на следующий день (рисунок 4C-F) из-за фоновой экспрессии GFP на стадиях бластулы (рисунок 1F). Первичные половые клетки будут выглядеть в виде небольших флуоресцентных сфер в канавке непосредственно над расширением желтка (рисунок 4C-E). Наличие этих клеток в правильном месте свидетельствует об успешной трансплантации зародышевой линии. Клетки с другой формой не являются половыми клетками (например, удлиненные клетки обычно являются мышечными клетками, рисунок 4F). Кроме того, если первичные половые клетки находятся за пределами бороздки, это означает, что они не смогли мигрировать должным образом, и они не смогут внести свой вклад в зародышевую линию эмбриона. Наконец, общая морфология трансплантированных эмбрионов должна быть похожа на нетрансплантированные эмбрионы (рисунок 4D); хвост не должен быть деформирован, а голова не должна быть сморщена или отсутствуют глаза (рисунок 4E). Эти дефекты, как правило, являются результатом чрезмерно высоких концентраций морфолино или повреждения эмбриона во время трансплантации. Эксперименты по трансплантации зародышевой линии, как описано здесь, обычно приводят к 1-2 из 6 эмбрионов-хозяев с успешно пересаженными половыми клетками для 60-80% донорских эмбрионов, в зависимости от опыта экспериментатора. Таким образом, клетки из 40-50 гомозиготных донорских эмбрионов должны быть пересажены в 200-300 эмбрионов-хозяев, чтобы вырастить примерно 30 особей с мутантными половыми клетками.
Рисунок 1: Сборка и использование устройства для трансплантации. (A) Устройство для трансплантации собирается путем соединения газонепроницаемого шприца с держателем микропипетки через замок Luer. Стеклянная игла для трансплантации затем вводится в держатель микропипетки. (B) Фотография собранного устройства для трансплантации, установленного на микроманипуляторе (обратите внимание, что фон и этикетки были удалены с изображения). (C) При использовании устройства для трансплантации важно обеспечить, чтобы уровень воды в игле для трансплантации оставался на коническом конце. (D) Устройство используется под стереомикроскопом для извлечения и вставки клеток из и в эмбрионы телеоста, помещенные в отдельные колодцы трансплантационной чашки. (E) Для генерации эктопических источников клетки берутся с животного полюса донорского эмбриона (i-ii) и переносятся в полюс животного эмбриона хозяина (iii-vi). (F) Для трансплантации зародышевой линии большее количество клеток берется с края донорского эмбриона (i-ii), где расположены половые клетки. Затем клетки переносятся в край эмбрионов-хозяев (iii-vi). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Генерация клонов путем трансплантации клеток. (A) Пример двойного клона, генерируемого последовательной трансплантацией флуоресцентных клеток (зеленый) от донора рыбки данио в эмбрион хозяина рыбки данио. Одинарные и двойные клоны могут быть использованы для изучения того, как секретируемые сигнальные молекулы образуют пространственно-временные градиенты2,4,5,6. (B) Пример одного клона, полученного путем трансплантации клеток трансгенного донора медаки, экспрессирующего eGFP (Уимблдон)17, в хозяина медаки дикого типа. Шкалы представляют 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Генерация эмбрионов уменьшенного размера путем экстирпации клеток. (A) Перед удалением клеток путем экстирпации YSL может быть помечен путем введения флуоресцентных красителей в две противоположные стороны YSL. (B) Пример эмбриона после инъекции YSL. (C) Для получения эмбрионов, уменьшенных по размеру, клетки с полюса животных удаляются путем экстирпации5. (D) Пример эмбриона после экстирпации клеток. Обратите внимание, что YSL остается нетронутым. Шкалы представляют 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Трансплантация зародышевой линии. (А) Пример успешной трансплантации донорских клеток (зеленых) в маргинальную зону хозяина. (B) Пример неудачной трансплантации. Желток эмбриона-хозяина был сильно поврежден, и эмбрион не сможет нормально развиваться. (C) При 30 л.с.ф. успешно пересаженные половые клетки будут обнаружены исключительно в мезодерме гонад в передней области расширения желтка. (D) Пример успешной трансплантации, в которой несколько донорских половых клеток, меченных GFP, заполнили будущую гонаду хозяина. (E) Пример неудачной трансплантации. Хотя половые клетки достигли гонадной мезодермы, эмбрион хозяина сильно деформирован и не будет нормально развиваться. (F) Пример неудачной трансплантации. Флуоресцентные половые клетки, которые не смогли мигрировать в правильное место, не будут повторно заселять гонады. Шкала составляет 100 мкм. Изображения в D-F были сделаны с общим увеличением примерно в 50 раз. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Discussion
Успех эксперимента по трансплантации в значительной степени зависит от мелкой моторики экспериментатора. Для успешного проведения процедур требуется практика. Однако представленный здесь инструмент относительно прост в освоении и использовании по сравнению с другими на рынке, и, в целом, требуется всего несколько дней практики.
Успех процедуры трансплантации можно повысить, приняв несколько мер предосторожности. Одним из шагов является обеспечение того, чтобы микроманипулятор был хорошего качества и мог бесперебойно работать. Добавление окуляра с более высоким увеличением к стереомикроскопу может помочь точно расположить иглу относительно эмбриона. Использование хорошо размножающихся рыбок данио или медаки для приобретения здоровых эмбрионов и забота о том, чтобы не повредить эмбрионы во время обработки (особенно во время и после этапа дехорионации), также повысит вероятность успеха.
Проблемы с отсроченной токсичностью могут быть более трудными для устранения. Если эмбрион умирает через несколько часов, но не сразу после трансплантации, желток мог быть поврежден иглой (например, при слишком глубоком проникновении эмбриона), или, возможно, клетки были выброшены слишком сильно. Отсроченная токсичность и эмбриональная смерть также могут быть результатом желтка или клеточного мусора, вводимого вместе с донорскими клетками; другой причиной может быть ухудшение буфера HEPES в растворе Рингера. Эти проблемы могут быть преодолены путем промывки клеток (см. шаг 1.3.8) или просто с использованием свежей партии буфера, соответственно. Кроме того, деформированные эмбрионы-хозяева в экспериментах по трансплантации зародышевой линии могут быть результатом чрезмерно высоких концентраций морфолино. Крайне важно использовать достаточное количество морфолино, чтобы полностью абляция зародышевой линии дикого типа хозяина, тем самым предотвращая вклад этих клеток в потомство, но в то же время необходимо избегать чрезмерно высоких концентраций морфолино. Таким образом, последовательное количество морфолино во всех введенных эмбрионах-хозяевах (несколько сотен в типичном эксперименте) является ключом к успеху трансплантации зародышевой линии. Этому можно помочь, дополнив инъекционную смесь морфолино легко видимым индикаторным красителем14, который можно отслеживать под флуоресцентным стереомикроскопом, чтобы гарантировать, что все эмбрионы получают одинаковый объем инъекции.
Процедуры, описанные в этом протоколе, включают исключительно манипуляции с клетками у рыбок данио или эмбрионов медаки на стадии бластулы, но в будущем, вероятно, можно будет адаптировать устройство к различным стадиям и видам, изменив диаметр и форму иглы для трансплантации.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов, о которых можно было бы заявить.
Acknowledgments
Этот проект был поддержан Обществом Макса Планка и получил финансирование от Европейского исследовательского совета (ERC) в рамках исследовательской и инновационной программы Европейского союза Horizon 2020 (грантовое соглашение No 637840 (QUANTPATTERN) и грантовое соглашение No 863952 (ACE-OF-SPACE)).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0 mm glass capillary, ends cut without filament | To make the transplantation needle | ||
| 1.0 mm glass capillary, ends cut with filament | To make injection needles | ||
| 200 mL glass beaker | For embryo dechorionation | ||
| 24-well plastic plate | To be coated with agarose in order to incubate embryos | ||
| 5 cm diameter glass Petri dish | For embryo dechorionation | ||
| 6-well plastic plate | To be coated with agarose in order to incubate embryos | ||
| Agarose | To coat plastic dishes | ||
| dnd1 morpholino | Gene Tools | Sequence: GCTGGGCATCCATGTCTCCGAC CAT |
|
| Embryo medium | 250 mg/L Instant Ocean salt, 1 mg/L methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3 | ||
| Fluorescence stereomicroscope with GFP/RFP filters and light source | To assess YSL injections and germ-line transplantations | ||
| Glass micropipette puller | Sutter Instrument Company | P-1000 | To make the transplantation needle |
| Glass pasteur pipette | Kimble Chase (via Fisher) | 63A53WT | For pipetting embryos; the tips can be flamed to smoothen out the edge |
| Incubator at 28 °C | For incubating zebrafish embryos | ||
| Luer tip 25 μL Hamilton syringe, 1700 series | Hamilton | Ref: 80201 | Part of the transplantation device |
| Manual micromanipulator with 3 axes of movement | Narishige | M-152 | For controlling the transplantation device |
| Manual pipetting pump | Bio-Tek | Cat. # 641 | For use with the glass pipettes to transfer embryos |
| Metal dissecting probe | For moving and rotating zebrafish embryos | ||
| Microforge | Narishige | MF2 | To make the transplantation needle |
| Microinjection apparatus | For injection of mRNA and morpholino into embryos | ||
| Microinjection molds, triangular grooves | Adaptive Science Tools | TU-1 | To prepare microinjection plates with agarose |
| Microinjection-molds, single wells | Adaptive Science Tools | PT-1 | To prepare transplantation plates with agarose |
| Micropipette holder with Luer fitting for a 1.0 mm glass capillary | World Precision Instruments | MPH6S10 | Part of the transplantation device |
| mMessage mMachine Sp6 transcription kit |
Life Technologies | AM1340M | To generate capped mRNA for injection into embryos |
| Plasmid with GFP-nos1 3'UTR | Plasmid that can be transcriped to produce mRNA encoding GFP with the 3'UTR of nos1 | ||
| Plastic petri dish 100 mm | To be coated with agarose in order to make injection and transplantation dishes | ||
| Protease from Streptomyces griseus | Sigma | P5147 | For embryo dechorionation: Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos |
| Ringer’s solution | For 1 L: Add 6.78 g of NaCl, 0.22 g of KCl, 0.26 g of CaCl2 and 1.19 g of HEPES; then fill to 1 L; adjust pH to 7.2; sterilize by filtration | ||
| Stereomicroscope | For injection and transplantation |
References
- Spemann, H., Mangold, H. Induction of embryonic primordia by implantation of organizers from a different species. Archives for Microscopic Anatomy and Developmental Mechanics. 100 (3-4), 599-638 (1924).
- Müller, P., et al. Differential diffusivity of Nodal and Lefty underlies a reaction-diffusion patterning system. Science. 336 (6082), 721-724 (2012).
- Donovan, P., et al. Paracrine Activin-A signaling promotes melanoma growth and metastasis through immune evasion. Journal of Investigative Dermatology. 137 (12), 2578-2587 (2017).
- Pomreinke, A. P., et al. Dynamics of BMP signaling and distribution during zebrafish dorsal-ventral patterning. eLife. 6, 25861 (2017).
- Almuedo-Castillo, M., et al. Scale-invariant patterning by size-dependent inhibition of Nodal signaling. Nature Cell Biology. 20, 1032-1042 (2018).
- Soh, G. H., Pomreinke, A. P., Müller, P. Integration of Nodal and BMP signaling by mutual signaling effector antagonism. Cell Reports. 31 (1), 107487 (2020).
- Mahalwar, P., Walderich, B., Singh, A. P., Nüsslein-Volhard, C. Local reorganization of xanthophores fine-tunes and colors the striped pattern of zebrafish. Science. 345 (6202), 1362-1364 (2014).
- Frohnhöfer, H. G., Krauss, J., Maischein, H. M., Nüsslein-Volhard, C. Iridophores and their interactions with other chromatophores are required for stripe formation in zebrafish. Development. 140 (14), 2997-3007 (2013).
- Chen, Y., Schier, A. F. The zebrafish Nodal signal Squint functions as a morphogen. Nature. 411 (6837), 607-610 (2001).
- Ciruna, B., et al. Production of maternal-zygotic mutant zebrafish by germline replacement. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (23), 14919-14924 (2002).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th edn. , University of Oregon Press. (2000).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (29), e1394 (2009).
- Capek, D., Müller, P. Positional information and tissue scaling during development and regeneration. Development. 146 (24), 177709 (2019).
- Rogers, K. W., Bläßle, A., Schier, A. F., Müller, P. Measuring protein stability in living zebrafish embryos using fluorescence decay after photoconversion (FDAP). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52266 (2015).
- Carvalho, L., Heisenberg, C. P. The yolk syncytial layer in early zebrafish development. Trends in Cell Biology. 20 (10), 586-592 (2010).
- Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Dechorionation of medaka embryos and cell transplantation for the generation of chimeras. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2055 (2010).
- Centanin, L., Hoeckendorf, B., Wittbrodt, J. Fate restriction and multipotency in retinal stem cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 553-562 (2011).
