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Biochemistry

트립토판-ANS FRET 연구를 위한 재조합 Ca2+-ATPase N-도메인에서 트립토판 잔류물의 화학적 수정

Published: October 09, 2021
doi:
10.3791/62770
,
1Instituto de Física,Universidad Autónoma de San Luis Potosí

Summary

ANS는 Ca2+-ATPase 재조합 N-도메인에 바인딩합니다. 형광 스펙트럼은 295 nm의 파장에서 여기시 면에 FRET 와 같은 패턴을 표시합니다. Trp의 NBS 중재 화학 적 변형은 Trp 잔류물과 ANS 사이의 에너지 전송 (FRET)의 부재로 이어지는 N 도메인의 형광을 담금질합니다.

Abstract

사르코/폐막성 레티쿨룸 Ca2+-ATPase (SERCA)는 다양한 적합성으로 결정화 된 P 형 ATPase입니다. 그럼에도 불구하고 자세한 기능 정보는 격리된 재조합 도메인으로부터 얻을 수 있습니다. 엔지니어링(Trp552Leu 및 Tyr587Trp) 재조합 뉴클레오티드 결합 도메인(N-domain)은 리간 드렌드 결합 시 형광 응고를 표시합니다. 외외형 불소, 즉 8-anilino-1-naphthalene 설포네이트(ANS)는 아르그, 그의, 알라, 루 및 페 잔류물과의 정전기 및 소수성 상호 작용을 통해 뉴클레오티드 결합 부위에 결합합니다. ANS 결합은 370 nm의 파장(λ)에서 흥분될 때 형광 강도의 증가에 의해 입증된다. 그러나, 295 nm의 λ에서 흥분할 때, 형광 강도의 증가는 N-도메인 본질적인 형광의 담금질에 결합되는 것처럼 보입니다. 형광 스펙트럼은 Föster 공명 에너지 전송 (FRET)과 같은 패턴을 표시하여 Trp-ANS FRET 쌍의 존재를 제안하며, 이는 Tyr587Trp와 ANS 사이의 짧은 거리 (~20 Å)에 의해 지원되는 것으로 보입니다. 이 연구는 N-bromosuccinimide (NBS)에 의해 매개되는 Trp 화학 적 변형 (및 형광 담금질)에 의해 Trp-ANS FRET 쌍의 분석을 설명합니다. 화학적으로 변형된 N-도메인에서 ANS 형광은 370 nm의 λ에서 흥분할 때와 유사한 295 nm의 λ에서 흥분할 때 증가했습니다. 따라서 Trp 잔류물의 NBS 매개 화학 적 변형은 Trp와 ANS 사이의 FRET부재를 조사하는 데 사용할 수 있습니다. Trp 형광이 없는 경우 ANS 형광의 증가를 관찰해서는 안됩니다. NBS에 의한 단백질에서 Trp 잔류물의 화학적 변형은 결합된 ANS에 가까운 Trp 잔류물 사이 FRET를 검사하는 데 유용할 수 있다. 이 분석은 다른 형광을 사용할 때 유용할 것입니다.

Introduction

Föster 공명 에너지 전달(FRET)은 단백질 구조 및 기능 연구에서 결합 또는 상호 작용 후 분자 구조 간의 거리를 결정하는 표준 기술이 되었다1,2,3,4. P형 ATPases에서 FRET는 사르코-내도 망상 Ca2+-ATPase(SERCA)2,5,6,7,8,예를 들어, 촉매 주기 동안의 구조적 변동을 FRET7에의해 전체 단백질로 분석하여 분석하는 데 사용되어 왔다.

FRET 기증자는 다양하며, 작은 형광 (외발) 분자에서 형광 단백질9,10에이르기까지 다양합니다. 트립토판(Trp) 잔류물(그들의 형광로 인한)은 단백질 아미노산서열(11,12)의구조적 변화를 식별하는 데 유용하다. Trp의 형광 강도는 주변 환경의 극성에 실질적으로의존한다(13,14). 리간드 결합은 일반적으로 단백질/효소15,16에서구조적 재배열을 생성한다. Trp가 단백질 결합 부위에 존재하거나 가까이 위치한 경우, 구조적 변동은 수성물질(13,14)에대한 Trp 노출 정도에 자주 영향을 미친다. 따라서, 극성의 변화는 Trp 형광 강도13,14의담금질귀귀착한다. 따라서 Trp의 형광 특성은 효소에 대한 리간드 결합 연구를 수행하는 데 유용합니다. 다른 물리적 현상은 또한 Trp 형광 이17,18,19,20,예를 들어, FRET 및 중간 극성 의 변화로 이어질 수 있다. Trp의 흥분 상태에서 불소호레로의 에너지 전송은 또한단백질(21)의작은 리간드의 친화성 결정과 같은 잠재적인 응용 분야가 있다. 실제로, Trp는 주로 단백질22,23,24,예를 들어, 테르비움(Tb3+)FRET 연구에서 FRET 연구에서 FRET 연구에서 형광 기증자로 주로 사용되어 왔으며, Trp 잔류물은 Tb3+25,26,27로에너지 전송을 위한 안테나로 자주 사용된다. Trp는 단백질 구조에 내재된 구성 특성으로 인해 다른 FRET 기증자에 비해 다양한 이점을 표시하여 연구된단백질(24)의기능/구조에 영향을 줄 수 있는 예비 공정의 필요성을 제거한다. 따라서, 방사성 붕괴의 식별(단백질 구조 재배열에 의해 유도되는 중간 극성의 에너지 전달 및 변화)은 단백질 구조 연구에서 리간드 결합에 관한 정확한 결론을 도출하는 데 중요하다13,14,19,28.

단백질 구조 연구에서, 외외형 불소호레, 즉 8-아닐리노-1-나프탈렌 설포네이트(ANS)는 주로 단백질 접기/전개28,29와관련된 실험에 사용되어 왔다. ANS는 일반적으로 기판31,32,33의결합 부위에서 네이티브 상태에서 단백질/효소에 결합한다. ANS 형광 양자 수율(ΦF)의 증가(즉, 형광 강도의 증가)는 광수 포켓에 있는 ANS와 그의 잔류물이34,35,36,37의적절한 상호작용이 발생할 때 λ=370 nm에서 단백질을 흥미진진하게 유도한다. 다양한 연구에서, Trp 잔류물 (기증자)와 ANS (수락자) 사이의 FRET (280-295 nm 내의 λ에서 흥미 진진한 경우)의 발생은 다음과 같은 것을 기반으로보고되었습니다 : 1) Trp의 형광 스펙트럼과 ANS의 흥분 스펙트럼의 중첩 및 ANS의 흥분 스펙트럼, 2) 보다 적합한 원거리 또는 TRpS (Trps) 식별 3) 단백질 포켓에 결합될 때 높은 ANS 양자 수율, 및 4) ANS3,17,27,37,38의존재에서 단백질의 형광 스펙트럼에서 특징적인 FRET 패턴.

최근에는 SERCA 및 기타 P형 ATPases에서 뉴클레오티드 결합 도메인(N-domain)에 결합하여 설계재조합 N-도메인40,41,42,43,44, 45,46을사용하여 조사되고있다. SERCA N-domain의 분자 공학은 유추형 결합 부위에 가까운 보다 역동적인 구조(Tyr587Trp)로 단독 Trp 잔류물(Trp552Leu)을 이동시키는 데 사용되어 왔으며, 여기서 형광 변이(cnching)는 리간드 결합34에따른 구조적 변화를 모니터링하는 데 사용될 수 있다. 실험 결과는 ANS가 정제된 재조합 SERCAN-도메인(34)에서뉴클레오티드 결합 부위에 결합(ATP로)을 결합한다는 것을 입증하였다. 흥미롭게도, ANS 형광은 295 nm의 λ에서 ecitation시 N-도메인에 결합할 때 증가하며, N-도메인의 본질적인 형광은34를감소시켜 Trp-ANS FRET 쌍의 형성을 암시하는 FRET 패턴을 생성한다.

NBS의 사용은 변형 된 단백질의 흡수성 분석에 의해 단백질(47)에서 Trp 잔류물의 함량을 결정하기 위해 제안되었다. NBS는 덜 흡수성 옥신돌47,48에Trp의 고흡수 인돌 그룹을 수정한다. 이로 인해 Trp 형광성질(40)의손실(담금질)이 발생한다. 따라서, Trp 잔류물의 NBS 매개 화학 적 변형은 FRET가 가설될 때 Trp (기증자로서)의 역할을 정의하는 분석으로 사용될 수 있다.

이 프로토콜은 SERCA의 엔지니어링 재조합 N-도메인에서 NBS에 의한 유일한 Trp 잔류물의 화학적 변형을 단백질 모델로 설명합니다. 실험 결과는 ANS 형광 강도가 여전히 화학적으로 NBS 변형 N-도메인34에서증가한다는 것을 보여 주며, 이는 본질적인 형광이 결여되어 있습니다. 따라서, 분석체는N-도메인(34,40,49)에바인딩될 때 Trp 잔류물과 ANS 사이에 FRET의 부재를 입증하는 데유용하다. 따라서, 이 분석 (Trp의 NBS 화학 수정) 단백질에 Trp-ANS FRET 쌍의 존재를 증명에 유용.

Protocol

1. ANS 및 SERCA N 도메인 상호 작용의 결정(실리코) 바람직한 단백질 모델링소프트웨어(50)를이용하여 분자 모델링을 통해 단백질(SERCA N-domain)의 3차원(3D) 구조를 생성한다. 바람직한 분자 구조소프트웨어(51)를이용하여 뉴클레오티드 결합 부위를 형성하는 아미노산 잔류물을 확인하고, 아르그와 리스잔류물(35)의존재를 결정?…

Representative Results

분자 도킹은 정전기뿐만 아니라 소수성 상호 작용을 통해 N-도메인의 뉴클레오티드 결합 부위에 ANS의 결합을나타낸다(도 1). Trp 잔류물과 ANS(뉴클레오티드 결합 부위에 바인딩)사이의 분자 거리(20 Å)는 FRET(도1)의발생을 지원합니다. 설계(engineered) 재조합 N-도메인은 친화성 크로마토그래피(그림2)에의해 고순도에서 얻어졌으며 형?…

Discussion

ANS-N-도메인 복합체의 형광 스펙트럼은 295nm의 λ에서 흥분할 때 FRET 와 같은 패턴을 나타내며, Trp 잔류물과 ANS 사이의 분자 거리(20 Å)는 FRET(도1)의발생을 지지하는 것으로 보인다. NBS에 의한 Trp 화학 적 변형은 덜 형광 N 도메인(도 3B,스펙트럼 f);을 초래한다; 따라서 에너지 전송은 불가능합니다. ANS 형광 스펙트럼은 295 nm(도 3A <stron…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 부분적으로 FAI-UASLP 보조금 번호 C19-FAI-05-89.89 및 CONACYT 교부금 번호 316463 (아포요스 라 시엔시아 드 프론테라: 포르탈레시미엔토 y 만테니미엔토 드 인프라에스트루쿠라스 드 Investigación de Usocomún y Capacicn. 저자는 비디오 에디션에서 줄리안 E. 마타 모랄레스의 기술 적 지원에 감사드립니다.

Materials

Acrylamide Bio-Rad 1610107 SDS-PAGE
Ammonium persulfate Bio-Rad 1610700 SDS-PAGE
8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acid Sigma-Aldrich A1028 Fluorophore
Bis-acrylamide Bio-Rad 1610125 SDS-PAGE
N-Bromosuccinimide Sigma-Aldrich B81255 Chemical modification
N,N-dimethylformamide J.T. Baker 9213-12 Stock solution preparation
Fluorescein isothiocyanate Sigma-Aldrich F7250 Chemical fluorescence label
Fluorescence cuvette Hellma Z801291 Fluorescence assay
Fluorescence Spectrofluorometer Shimadzu RF 5301PC Fluorescence assay
HisTrap™ FF GE Healtcare 11-0004-59 Protein purification
IPTG, Dioxane free American Bionalytical AB00841-00010 Protein expression
Imidazole Sigma-Aldrich I5513-25G Protein purification
LB media Fisher Scientific 10000713 Cell culture
Pipetman L P10L Gilson FA10002M Fluorescence assay
Pipetman L P100L Gilson FA10004M Fluorescence assay
Pipetman L P200L Gilson FA10005M Fluorescence assay
Pipetman L P1000L Gilson FA10006M Fluorescence assay
Pipetman L P5000L Gilson FA10007 Fluorescence assay
Precision plus std Bio-Rad 1610374 SDS-PAGE
Sodium dodecyl sulphate Bio-Rad 1610302 SDS-PAGE
Sodium phosphate dibasic J.T. Baker 3828-19 Buffer preparation
Sodium phosphate monobasic J.T. Baker 3818-01 Buffer preparation
Syringe filter 0.2 um Millipore GVWP04700 Solution filtration
Temed Bio-Rad 1610801 SDS-PAGE
Tris Bio-Rad 1610719 SDS-PAGE
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TryptophanANSFRETCa2+-ATPaseN-domainChemical ModificationMolecular ModelingMolecular DockingMolecular DynamicsProtein PurificationSDS-PAGE

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Sampedro, J. G., Cataño, Y. Chemical Modification of the Tryptophan Residue in a Recombinant Ca2+-ATPase N-domain for Studying Tryptophan-ANS FRET. J. Vis. Exp. (176), e62770, doi:10.3791/62770 (2021).
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