Analyse quantitative du taux de croissance d’Aspergillus nidulans à l’aide de la microscopie en direct et d’un logiciel open source
Summary
Nous présentons un protocole d’imagerie en direct sans étiquette utilisant des techniques de microscopie optique transmise pour capturer des images, analyser et quantifier la cinétique de croissance du champignon filamenteux A. nidulans dans les cultures submergées et les milieux solides. Ce protocole peut être utilisé en conjonction avec la microscopie à fluorescence.
Abstract
Il est bien établi que la croissance des colonies de champignons filamenteux, qui dépend principalement des changements dans le taux de croissance apicale des hyphes et des mycéliums, est estimée macroscopiquement sur les milieux solidifiés en comparant la taille des colonies. Cependant, mesurer quantitativement le taux de croissance de souches ou de souches fongiques génétiquement différentes dans différentes conditions environnementales / de croissance (pH, température, sources de carbone et d’azote, antibiotiques, etc.) est difficile. Ainsi, la poursuite d’approches complémentaires pour quantifier la cinétique de croissance devient obligatoire afin de mieux comprendre la croissance des cellules fongiques. En outre, il est bien connu que les champignons filamenteux, y compris Aspergillus spp., ont des modes distincts de croissance et de différenciation dans des conditions subaérivoles sur des milieux solides ou des cultures submergées. Ici, nous détaillons une méthode microscopique quantitative pour analyser la cinétique de croissance du champignon modèle Aspergillus nidulans, en utilisant l’imagerie en direct dans les cultures submergées et les milieux solides. Nous capturons des images, analysons et quantifions les taux de croissance de différentes souches fongiques de manière reproductible et fiable à l’aide d’un logiciel open source et gratuit pour les bio-images (par exemple, Fidji), d’une manière qui ne nécessite aucune expertise préalable en analyse d’images de la part de l’utilisateur.
Introduction
Les champignons filamenteux sont d’une grande importance socio-économique et écologique, étant à la fois cruciaux en tant qu’outils industriels / agricoles pour la productiond’enzymeset d’antibiotiques1,2 et en tant qu’agents pathogènes des plantes cultivées3, insectes nuisibles4 et humains3. De plus, les champignons filamenteux tels que Aspergillus nidulans sont largement utilisés comme organismes modèles pour la recherche fondamentale, comme les études en génétique, biologie cellulaire et évolutive ainsi que pour l’étude de l’extension hyphale5. Les champignons filamenteux sont des organismes hautement polarisés qui s’allongent grâce à l’apport continu de lipides/protéines membranaires et à la synthèse de novo de la paroi cellulaire à l’extrémité extensible6. Un rôle central dans la croissance de la pointe hyphale et le maintien de la polarité est une structure spécialisée appelée « Spitzenkorper » (SPK), une structure hautement ordonnée composée principalement de composants cytosquelettes et de la distribution polarisée du Golgi6,7,8.
Les stimuli/signaux environnementaux, tels que l’interface eau-air, la lumière, la concentration de CO2 et l’état nutritionnel sont responsables des décisions de développement prises par ces moisissures9. Dans les cultures submergées (liquides), la différenciation d’A. nidulans est réprimée et la croissance se produit par allongement de la pointe hyphale6. Au cours de la croissance végétative, les spores asexuées (conidies) germent par extension apicale, formant un réseau indifférencié de cellules hyphales interconnectées, le mycélium, qui peut continuer à croître indéfiniment tant que les nutriments et l’espace sont disponibles. D’autre part, sur les milieux solides, les pointes hyphales s’allongent et après une période définie de croissance végétative (compétence développementale), la reproduction asexuée est initiée et les tiges de conidiophores aériennes s’étendent à partir de cellules spécialisées du pied du mycélium6. Ceux-ci donnent naissance à des structures multicellulaires de développement spécialisées appelées conidiophores, qui produisent de longues chaînes de conidies haploïdes10 qui peuvent relancer la croissance dans des conditions environnementales favorables.
Une méthode largement utilisée pour mesurer la croissance fongique filamenteuse consiste à inoculer des spores sur une gélose nutritive contenue dans une boîte de Pétri et à mesurer macroscopiquement le diamètre de la colonie quelques jours plus tard11. Le diamètre/surface de la colonie, le plus dépendant des changements du taux de croissance mycéliale et moins de la densité des conidiophores12,est alors utilisé comme valeur de croissance. Bien que la mesure de la taille de la population fongique (colonie) qui pousse sur des surfaces solides soit tout à fait adéquate, ce n’est en aucun cas la mesure la plus précise de la croissance. Par rapport aux moyennes au niveau de la population (moyennes de la taille des colonies fongiques), les mesures unicellulaires peuvent saisir l’hétérogénéité d’une population cellulaire et permettre l’identification de nouvelles sous-populations de cellules, états13,dynamique, voies ainsi que les mécanismes biologiques par lesquels les cellules répondent aux changements endogènes et environnementaux14,15. La surveillance de la croissance et du phénotype des cellules fongiques par microscopie time-lapse est sans doute l’approche d’observation quantitative unicellulaire la plus largement utilisée.
Ici, nous détaillons un protocole d’imagerie en direct sans étiquette utilisant des techniques de microscopie à lumière transmise (telles que le contraste de phase, le contraste d’interférence différentielle (DIC) et la microscopie polarisée) pour capturer des images, qui, indépendamment de l’utilisation combinée de la microscopie à fluorescence, peuvent être utilisées pour analyser et quantifier la croissance polaire des souches d’A. nidulans dans les cultures submergées et les milieux solides.
Protocol
Representative Results
Discussion
La surveillance de la croissance et du phénotype des cellules fongiques par microscopie time-lapse est une approche puissante pour évaluer le comportement cellulaire en temps réel et déterminer quantitativement et avec précision si un traitement médicamenteux particulier et / ou une intervention génétique entraîne une croissance cellulaire détectable ou des différences phénotypiques au fil du temps.
Dans cette étude, une méthodologie fiable d’imagerie des cellules vivantes a é…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été en partie soutenu par le projet « Une infrastructure de recherche grecque pour la visualisation et la surveillance des processus biologiques fondamentaux (BioImaging-GR) » (MIS 5002755) qui est mis en œuvre dans le cadre de l’action « Renforcement de l’infrastructure de recherche et d’innovation », financé par le programme opérationnel « Compétitivité, entrepreneuriat et innovation » (CRSN 2014-2020) et cofinancé par la Grèce et l’UE.
Materials
| µ-Slide 8 Well | Ibidi | 80826 | Imaging slides |
| 4-Aminobenzoic acid | Merck | A9878 | |
| azhAΔ ngnAΔ | Genotype: zhAΔ::pyrGAf; ngnAΔ::pyrGAf; pyroA4 pantoB100 / References:Laboratory collection, Athanasopoulos et al., 2013 | ||
| Bacto Casamino Acids | Gibco | 223030 | |
| Biotin | Merck | B4639 | |
| Chloroform | Merck | 67-66-3 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Merck | C8027 | |
| Glucose | Merck | G8270 | |
| GraphPad Prism 8.0 | GraphPad Software | Statistical Software | |
| ImageJ | NIH | Image processing and analysis software | |
| Inoculating Loop | Merck | I8263-500EA | |
| Iron(III) phosphate | Merck | 1.03935 | |
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | Microscope software | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Merck | 63138 | |
| Manganese(II) sulfate monohydrate | Merck | M7899 | |
| Microscope Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
| Nicotinamide (Niacinamide) | Supelco | 47865-U | |
| Peptone | Millipore | 68971 | |
| Petri Dishes for Microbiology Culture | KISKER | G090 | |
| Potassium chloride | Merck | P4504 | |
| Potassium phosphate monobasic | Merck | P5655 | |
| Pyridoxine hydrochloride | Merck | P6280 | |
| Quali – Microcentrifuge Tubes, 1,7 mL, DNase-, RNase and pyrogen free, sterile | KISKER | G052-S | |
| Quali – Microcentrifuge Tubes, 2.0 mL, sterile | KISKER | G053-S | |
| Quali – Standard Tips, Bevelled, 100-1000 µL | KISKER | VL004G | |
| Quali – Standard Tips, Bevelled, 1-200 µL | KISKER | VL700G | |
| Quali Microvolume Tips, DNase-, RNase free, 0,1-10 µL/clear | KISKER | GC.TIPS.B | |
| Riboflavin (B2) | Supelco | 47861 | |
| Scalpel blades NO. 11 | OdontoMed2011 | S2771 | |
| Sodium chloride | Merck | S7653 | |
| Sodium hydroxide | Merck | S8045 | |
| Sodium tetraborate decahydrate | Merck | S9640 | |
| VS151 (PilA-GFP and H1-mRFP) | Genotype: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuAΔ::argB+ pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / References:Laboratory collection, Biratsi et al., 2021 | ||
| WT | Genotype: nkuAΔ::argB; pyrG89; pyroA4;pyrG89 / References: TN02A3 -FGSC A1149 | ||
| Yeast Extract | Millipore | 70161 | |
| ZnSO4 |
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